Método autoradiográfico quantitativo para determinação das taxas regionais de síntese protéica cerebral in vivo

Resumo

A síntese proteica é um processo biológico crítico para as células. No cérebro, é necessário para mudanças adaptativas. A mensuração das taxas de síntese proteica no cérebro intacto requer considerações metodológicas cuidadosas. Aqui nós apresentamos o L-[1-¹⁴C]-método Bakersfield quantitativo da leucina para a determinação de taxas regionais da síntese da proteína cerebral in vivo.

Resumo

A síntese protéica é necessária para o desenvolvimento e manutenção da função neuronal e está envolvida em mudanças adaptativas no sistema nervoso. Além disso, pensa-se que o desregulação da síntese da proteína no sistema nervoso pode ser um phenotype do núcleo em algumas desordens desenvolventes. A medida exata das taxas da síntese da proteína cerebral em modelos animais é importante para compreender estas desordens. O método que desenvolvemos foi projetado para ser aplicado ao estudo de animais acordados e comportados. É um método autoradiográfico quantitativo, de modo que pode render taxas em todas as regiões do cérebro simultaneamente. O método é baseado no uso de um aminoácido traçador, L-[1-¹⁴C]-leucina, e um modelo cinético do comportamento da L-leucina no cérebro. Nós escolhemos L-[1-¹⁴C]-leucina como o Tracer porque não conduz aos produtos metabólicos etiquetados estranhos. É incorporado na proteína ou metabolizado ràpida para render ¹⁴co₂ que é diluído em uma grande associação de co₂ sem rótulo no cérebro. O método e o modelo também permitem a contribuição da leucina sem rótulo derivada da proteólise tecidual para a associação precursora do tecido para síntese proteica. O método tem a resolução espacial para determinar as taxas de síntese protéica em camadas de células e neurópilo, bem como núcleos hipotalâmicos e do nervo craniano. Para obter dados quantitativos confiáveis e reprodutíveis, é importante aderir aos detalhes processuais. Aqui apresentamos os procedimentos detalhados do método quantitativo autoradiográfico L-[1-¹⁴C]-leucina para a determinação das taxas regionais de síntese protéica in vivo.

Introdução

A síntese proteica é um importante processo biológico necessário para a mudança adaptativa de longo prazo no sistema nervoso¹. A inibição da síntese proteica bloqueia o armazenamento de memória de longo prazo em invertebrados e vertebrados². A síntese proteica é essencial para a manutenção das fases tardias de algumas formas de potenciação a longo prazo (LTP) e depressão a longo prazo (Ltd)³, sobrevivência neuronal durante o desenvolvimento⁴, e para a manutenção geral do neurônio e sua conexões sinápticas⁵. A mensuração das taxas de síntese de proteínas cerebrais pode ser uma ferramenta importante para o estudo de alterações adaptativas, bem como distúrbios do neurodesenvolvimento e distúrbios relacionados à aprendizagem e à memória.

Desenvolvemos um método para quantificar as taxas de síntese protéica cerebral in vivo em um animal acordado que oferece vantagens inerentes a outras técnicas que estimam taxas em preparações ex vivo ou in vitro de tecido cerebral⁶. Acima de tudo é a aplicabilidade para medições no cérebro intacto em um animal acordado. Esta é uma consideração chave porque permite medições com estrutura sináptica e função no lugar e sem preocupações sobre efeitos post mortem. Além disso, a abordagem autoradiográfica quantitativa que empregamos atinge um alto grau de localização espacial. Considerando que a energia de ¹⁴C é tal que não podemos localizar o traçador no nível subcelular ou celular, podemos medir as taxas em camadas celulares e pequenas regiões cerebrais, como núcleos hipotalâmicos, com aproximadamente uma resolução de 25 μm⁷.

Um desafio de medições in vivo com radiofármacos é garantir que o radiomarcar medido está no produto da reação de interesse, em vez de precursor rotulado não reagido ou outros produtos metabólicos rotulados estranhos⁶. Nós escolhemos L-[1-¹⁴C]-leucina como o aminoácido Tracer porque é incorporado na proteína ou metabolizado ràpida a ¹⁴co_2, que é diluído na grande associação de co₂ sem rótulo no cérebro resultando da taxa elevada de metabolismo energético⁸. Além disso, qualquer ¹⁴c não incorporado em proteínas existe principalmente como livre [¹⁴c]-leucina, que durante o período experimental de 60 min, é quase totalmente eliminada do tecido⁶. As proteínas são então fixadas ao tecido com formalina e posteriormente enxaguadas com darágua remover qualquer livre [¹⁴C]-leucina antes da autoradiografia.

Outra consideração importante é a questão da diluição da atividade específica da Associação de aminoácidos precursores por aminoácidos não rotulados derivados da proteólise tecidual. Nós mostramos que no rato e no rato adultos, aproximadamente 40% do pool da leucina do precursor para a síntese da proteína no cérebro vem dos ácidos aminados derivados da avaria⁶da proteína. Isso deve ser incluído no cálculo das taxas regionais de síntese de proteínas cerebrais (rCPS) e deve ser confirmado em estudos em que essa relação pode mudar. A base teórica e os pressupostos do método foram apresentados em detalhes em outros lugares⁶. Neste artigo, focamos as questões processuais da aplicação desta metodologia.

Este método tem sido empregado para a determinação de RCPS em esquilos terrestres⁹, ovinos¹⁰, macacos rhesus¹¹, ratos^{12,13,14,15,16 , 17} anos de ^{, 18 anos} de ^{, 19} anos de ^{, 20} anos de ^{, 21}, um modelo do rato do complexo de esclerose tuberosa²², um modelo do rato da síndrome frágil de x²³,^24,25,26, ratos frágeis da pré-mutação de x²⁷, e um modelo do rato do fenilcetonúria²⁸. Neste manuscrito, apresentamos os procedimentos de mensuração de rCPS com o método in vivo autoradiográfico L-[1-¹⁴C]-leucina. Nós apresentamos rCPS em regiões do cérebro de um rato acordado do controle. Nós igualmente demonstramos que in vivo a administração do anisomycin, um inibidor da tradução, abole a síntese da proteína no cérebro.

Protocolo

Nota: todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Instituto Nacional de saúde mental e Comitê de uso de animais e foram realizados de acordo com os institutos nacionais de diretrizes de saúde sobre o cuidado e uso de animais.

Uma visão geral do protocolo é apresentada na Figura 1.

1. implante cirurgicamente cateteres em veia femoral e artéria para administração do traçador e coleta de amostras de sangue arterial cronometradas, respectivamente. Termine a cirurgia pelo menos 22 h antes da administração do Tracer. A cirurgia requer cerca de 1 h para ser concluída.

1. Reúna os materiais necessários: instrumentos cirúrgicos estéreis (tesouras cirúrgicas, Microtesouras, fórceps, três ganchos cirúrgicos da pele), equipamento para a anestesia do isoflurano (vaporizador do isoflurano, scavenger ativo do gás, câmara selada da anestesia, anestesia cone de nariz), estágio de cirurgia estéril, cortadores de pele, 70% etanol, betadine, gaze estéril, fita cirúrgica, aquecedores de mão comerciais, microscópio cirúrgico, estéril 0,9% cloreto de sódio (soro fisiológico), heparina estéril 100 USP unidades/mL em 0,9% cloreto de sódio (heparinizado salina), tiras estéreis de 5 20 cm de 6-0 sutura absorvível, costas estéreis de 25 cm de cateteres de polietileno PE-8 e PE-10 com uma extremidade cortada em 45^o, seringas estéreis de 1 cc, agulhas estéreis de calibre 32, equipamento de cauterização, estéril 15-20 cm oco inox haste de aço (diâmetro interno de 2,5 milímetros, diâmetro exterior de 3 milímetros), anestésicos locais (pomada do Bupivacaine e do Lidocaine), e um cerco animal com instalação do apêndice do giro (Tether da mola de 30 cm com tecla, giro, montagem giratória e braço, 20 X 13 cm cilíndricos desobstruídos recipiente).
2. Prepare o animal para a cirurgia.
3. Assegure-se de que as técnicas assépticas e estéreis apropriadas estejam usadas como exigido por sua instituição.
   1. Pesar o animal. O animal deve ser pelo menos 25 g para a cirurgia bem sucedida.
   2. Coloc o animal dentro de uma câmara selada do plexiglass e conecte a câmara ao instrumento da anestesia do isoflurano. Ajuste a vazão para 2,5 L/min para machos e 3,0 L/min para fêmeas de 1,5% de isoflurano em O₂. Após aproximadamente 2 minutos, assegure-se de que o rato esteja sedado apropriadamente pela falta de um reflexo da retirada com uma pitada do dedo do pé.
   3. Uma vez sedado, retire o mouse da câmara e coloque-o em uma posição prona com seu rosto dentro do cone do nariz da anestesia. Configurar o cone do nariz para receber gás do vaporizador e para devolver o gás ao limpador de gás. O limpador capturará isoflurano em um filtro de carvão.
   4. Use tosquiadeiras para raspar a pele entre as omoplatas. Certifique-se de esterilizar adequadamente a região raspada, alternando três vezes entre Betadine e etanol esfrega.
   5. Vire o mouse sobre em uma posição supina mantendo a face no cone do nariz. Tape para baixo a perna esquerda para o estágio de cirurgia e usar cortadores para raspar a pele da coxa esquerda interna para o abdômen superior esquerdo. Certifique-se de esterilizar adequadamente a região raspada, alternando três vezes entre Betadine e etanol esfrega.
   6. Deslize um handwarmer comercialmente disponível ativado, envolvido na gaze, o rato. Tape a perna direita para a fase cirúrgica.
4. Insira o cateter na veia femoral esquerda.
   1. Com a ajuda de um microscópio cirúrgico, use tesouras cirúrgicas para fazer uma incisão de 1 cm da porção medial superior da coxa esquerda rostralmente para a linha média, revelando a artéria e a veia femoral.
   2. Retrair a pele solta com ganchos cirúrgicos da pele para expor mais as vesículas.
   3. Aplique o cloreto de sódio estéril de 0,9% à área exposta para manter a umidade adequada.
   4. Use fórceps para dissecar sem corte, separando o tecido conjuntivo em torno de uma pequena seção da artéria femoral e veia. Cuidadosamente, separe a artéria e a veia (Figura 2).
   5. Use fórceps para enfiar uma fita de sutura absorvível (vertente A) a veia femoral e a artéria no ponto mais lateral da incisão. Puxe a sutura até a metade para que as extremidades estejam quites.
   6. Em um ponto mais proximal à virilha, use o fórceps para rosqueie uma segunda sutura (vertente B) somente a veia femoral. Gentilmente amarrar um meio nó que será usado para restringir o fluxo sanguíneo.
   7. Em um ponto entre a vertente a e a vertente B, use o fórceps para rosqueie uma terceira sutura (Costa C) somente a veia femoral. Gentilmente amarrar um nó cheio que será usado para restringir o fluxo sanguíneo. Tenha cuidado para não rasgar a veia.
   8. Puxe suavemente a vertente B para restringir o fluxo sanguíneo. Use um hemostat para puxar suavemente a vertente B para manter o fluxo sanguíneo restrito.
   9. Corte um pequeno orifício na área restrita da veia femoral com Microtesoura e insira cuidadosamente a extremidade angular da tubagem PE-8 (previamente lavada com heparina salina) em direção a Strand B. Uma vez que introduzido, libere a tensão de Strand B e guie o cateter mais acima da veia. Aperte a vertente B à volta da veia que contém o cateter.
   10. Usando a vertente C, amarre um nó adicional em torno do cateter. Certifique-se de que este nó não Capture a artéria femoral.
   11. Puxe delicadamente para trás no tambor da seringa para encher parcialmente o tubo com sangue para assegurar-se de que o cateter estêve implantado corretamente.
5. Seguindo o mesmo procedimento, insira um cateter PE-10 na artéria femoral esquerda.
6. Procedimento cirúrgico completo.
   1. Uma vez que ambos os cateteres da veia femoral e da artéria foram fixados, amarre Strand A em um nó em torno de ambos os cateteres.
   2. Corte todas as suturas em excesso e retire os ganchos da pele. Lave o cateter arterial com soro fisiológico heparinizado para evitar a coagulação. Cauterize as extremidades de ambos os cateteres para criar um selo.
   3. Coloque o mouse na posição prona e faça uma pequena incisão na base do pescoço e aplique soro fisiológico na área exposta.
   4. Introduza a haste de metal oca subdérmica da incisão da garganta à incisão femoral. Cobra os cateteres através da haste oca e fora da incisão do pescoço. Retire a haste oca. Os cateteres de implante subdérmica impedirão que os ratos danifiquem os cateteres.
   5. Aplique bupivacaína nos lados da ferida. Fechar a incisão femoral com sutura. Adicione a pomada do Lidocaine sobre a ferida fechada, suturada.
   6. Cobra os cateteres através de um tubo oco flexível de 30 cm (mola Tether) e suturar o botão da mola Tether a pele. Aplique bupivacaína nos lados da ferida. Suturar o botão da mola Tether a pele. Adicione a pomada do Lidocaine sobre a ferida fechada, suturada.
   7. Mova o mouse para um recipiente cilíndrico claro (20 cm de altura, 13 cm de diâmetro) com uma montagem giratória e braço para abrigar o animal durante o período de recuperação. Coloque um aquecedor de mão o recipiente para manter o animal quente.
   8. Aparafuse a parte superior da corda da mola a um giro e fixe o giro ao braço giratório anexado ao recipiente cilíndrico. Certifique-se que o rato tem a gama completa de movimento e os cateteres podem ser acessados.
   9. Coloc uma tampa entalhado que não interfira com o mecanismo do giro sobre o cerco animal. Consulte a Figura 3 para a configuração completa.
   10. Permitir que o mouse para recuperar. Pelo menos 22 h é recomendado.

2. Prepare a solução injetável de L-[1-¹⁴C] leucina e a solução de dihidrato de ácido 5-sulfosalicílico (SSA) a 16% (p/v) para amostras de plasma de desproteinização. Na solução SSA, também incluem 0, 4 mM de norleucina e 1 μCi/mL [H³] leucina como padrões internos para análise de aminoácidos e análise da concentração de traçador nas frações plasmáticas solúveis em ácido, respectivamente. Armazene o SSA até dois meses a 4 ° c.

1. Compra comercialmente disponível L-[1-¹⁴C] leucina (50-60 MCI/mmol), que é vendido como uma solução em 2% etanol ou 0,1 N HCl. seque uma atividade conhecida do traçador um fluxo suave de nitrogênio e reconstitua em uma solução de soro fisiológico normal estéril feito até uma concentração de 100 μCi/mL.

3. administrar L-[1-¹⁴C] leucina intravenosamente e coletar amostras de sangue arterial.

1. Reúna os materiais necessários: 18 1,5 mL de microtubos para amostras de plasma de desproteinização (adicione 70 mL de água desionizada a cada tubo), 17 250mL de pastilhas de vidro (15 pastilhas para coleta de amostras de sangue arterial e 2 pastilhas para coleta de sangue no espaço morto para ser reinjetado. Para limitar a coleta de sangue extra e desnecessário, pequenas inserções de frascos de vidro fino com partes inferiores cônicas que permitem a pipetagem acessível do plasma sobrenadante é recomendada), 2 tubos microcapilares (32 X 0,8 mm, para medição do hematócrito), 1 heparina e tubo de microcentrífuga de fluoreto de lítio (para evitar a coagulação e a glicólise, respectivamente), hemostats (cubra as pontas com tubos de Tygon para que as braçadeiras não danifique a tubulação do PE), monitor da glicose sanguínea, transdutor da pressão sanguínea, 1 mL seringas estéreis (para solução de eutanásia disponível comercialmente (diluído 1:1 em água desionizada (para camundongos)).
2. Assegure-se de que o animal esteja em estado fisiológico normal no início do experimento.
   1. Prenda a tubulação arterial aproximadamente 2 cm da extremidade e corte a ponta, criando uma abertura para que o sangue flua. Em seguida, desaperte o tubo e colete o sangue do espaço morto ((c. 30 mL) para coletar qualquer soro fisiológico residual e/ou sangue de empates anteriores) e, em um tubo separado, colete uma amostra de controle (aprox. 30 μL), amostras de hematócrito (cerca de metade do volume do tubo capilar) e uma glicose amostra (aprox. 20 μL).
   2. Meça o hematócrito obstruindo uma extremidade com putty e centrifugador do vedador por 1 minuto em 4500 x g. Meça a relação do volume de pilhas vermelhas ao volume de sangue total. Se um animal tiver um hematócrito abaixo de 30%, não continue o estudo.
   3. Use um monitor de glicose no sangue comercialmente disponível para medir o nível de glicose em uma gota de sangue.
   4. Centrífuga de controle de amostra para 2 min em 18.000 x g para separar o plasma. Desproteinize as amostras de plasma da seguinte forma: Adicionar 5 μL de plasma a 70 μL de água desionizada num microtubo de 1,5 mL, adicionar 25 μL da solução de 16% de SSA e Vortex. Coloque no gelo por 30 min antes de congelar em gelo seco.
   5. Retorne o sangue do espaço morto para o animal através da linha venosa, seguido por um soro fisiológico heparinizado para evitar o excesso de perda de sangue.
   6. Conecte a linha arterial a um transdutor de pressão arterial para medir a pressão arterial média.
   7. Depois de tomar as amostras certifique-se de re-Clamp a linha arterial e para nivelar a linha com um pequeno (50 mL) volume de soro fisiológico heparinizado.
3. Administrar o traçador intravenosamente e coletar amostras de sangue arterial cronometradas.
   1. Use um conector em Y para anexar uma seringa com o traçador (100μCi/kg) e uma seringa com 50 mL de soro fisiológico estéril para liberar a linha venosa após a injeção do traçador. Conecte o conector Y à linha venosa.
   2. Inicie o estudo, iniciando simultaneamente um relógio de parada e injetando o traçador. Lave a linha venosa com soro fisiológico (c. 100mL) imediatamente após a injecção.
   3. Colete amostras de sangue 1-7 continuamente ao longo dos primeiros 2 min do experimento da mesma maneira. Após a coleta da 7ª amostra, colete 30 μL de sangue no espaço morto antes de cada amostra restante. As amostras 8-14 são coletadas em 3, 5, 10, 15, 30, 45 e 60 min, respectivamente.
   4. Amostras de sangue do processo imediatamente após a coleta, como foi descrito para a amostra de controle. Se houver um atraso, coloque as amostras no gelo. Reinjete cuidadosamente o sangue do espaço morto na artéria através do cateter arterial e lave com soro fisiológico de heparina.
   5. Em algum momento durante o experimento, processe três padrões internos adicionando 25 μL de 16% de SSA, 0, 4 mM de norleucina e 1 mCi/mL [³H] de leucina a 75 μL de água, vortex e coloque no gelo.
   6. Depois de coletar a 14ª amostra em 60 min, injetar aproximadamente 0,2 mL de B-eutanásia-D na linha venosa para eutanizar o animal. Registre a hora da morte.
   7. Desaparafuse o animal da montagem giratória e retire do invólucro animal. Remova com cuidado o cérebro, coloc na folha de alumínio, e congele no gelo seco. Não congelar cérebros com nitrogênio líquido como cérebros podem rachar. Armazene o cérebro, as amostras, e os padrões internos em-80 ° c até pronto para o processamento. O processamento pode ser realizado em qualquer ponto depois.

4. analisar as concentrações de leucina e L-[1-¹⁴C] leucina em amostras de plasma.

1. Descongelar amostras e padrões internos no gelo, vortex, e centrifugar 18.000 x g por 5 min a 2 ° c. A fração sobrenadante conterá a leucina livre rotulada e sem rótulo.
2. Transfira 40 μL do sobrenadante para um frasco de cintilação líquida e adicione um cocktail de cintilação. Quantificar as desintegrações por min (DPM) de ³h e ¹⁴c por meio de contagem de cintilação líquida e uma curva de saciar projetada para a contagem simultânea de dupla etiqueta (³h e ¹⁴c).
3. Para quantificar as concentrações plasmáticas de leucina, utilizar um sistema de HPLC com uma coluna de troca catiónica de sódio e derivação pós-coluna com o-phthaldehyde e detecção fluorométrica.
   1. Ajuste a HPLC às seguintes especificações: excitação do fluorômetro de 330 nanômetro e emissão de 465 nanômetro. A fase móvel consiste em eluante de sódio, pH 7,40 e eluante de sódio + 5% de Sulfolano, pH 3,15. Ajuste a taxa de fluxo do amortecedor de 0,400 ml/min e a taxa de fluxo do instrumento do derivatização a 0,300 ml/min. Ajuste a temperatura da coluna a 48 ° c e à temperatura do reator a 45 ° c.
   2. Calibrar o sistema com uma gama de concentrações de aminoácidos (incluindo a norleucina) entre 30 e 500 pmol/10mL. A curva de calibração é linear. As concentrações de aminoácido das amostras de injeção testadas de 10 mL caem dentro das escalas desta curva de calibração.

5. Realize a autoradiografia quantitativa.

1. Prepare seções do cérebro 20 μm na espessura para o autoradiography. Cérebro da seção por meio de um criostato em-20 ° c.
2. Descongelar seções de série do cérebro da montagem em corrediças gelatina-revestidas. Ar seco.
3. Lave as lâminas em cinco mudanças de formalina a 10% por 30 min por mudança, seguido por um fluxo contínuo de água deionizada para 1 h. Cubra as lâminas frouxamente com a folha para evitar a poeira e deixe secar por 24 h.
4. Organize slides em um filme de raios-X (gavetas que cabem 20X25 cm filmes de mamografia são recomendados), juntamente com um conjunto de [¹⁴c] padrões de metilmetacrilato, que foram previamente calibrados contra o tecido de concentrações conhecidas de ¹⁴c como descrito em²⁹. Os padrões podem ser comprados comercialmente mas asseguram-se de que cobrem uma escala de 2-300 mCi/g do tecido e são calibrados de encontro à espessura do tecido de 20 μm. safelight vermelho, coloque um pedaço de filme de mamografia, lado da emulsão para baixo, em cima das seções.
5. Sele as gavetas e coloc em um saco em mudança preto e armazene-as em um armário por 40-45 dias.
6. Desenvolva filmes de acordo com as direções do fabricante. Nota: o desenvolvimento automatizado da película não é recomendado porque o fundo pode ser desigual e pode afetar a quantificação.

6. analise imagens.

Nota: recomenda-se um programa comercialmente disponível para análise de imagem juntamente com uma câmera CCD e uma caixa de luz fluorescente com iluminação uniforme. As densidades ópticas relativas na película iluminada são detectadas pela câmera do CCD.

1. Construa uma curva de calibração de densidade óptica (OD) v. concentração de ¹⁴C de tecido com base nos ODS do conjunto de padrões calibrados no filme. Ajuste esses dados (incluindo o espaço em branco ou plano de fundo) para uma equação polinomial. Ou uma equação polinomial de segundo ou terceiro grau se encaixa muito bem.
2. Para analisar regiões cerebrais específicas, localize a região de interesse (ROI) em seis a oito seções em comparação com um Atlas cerebral. Registre os ODs dos pixels dentro de um ROI em todas as seções e, com base na curva de calibração, calcule a concentração de ¹⁴C de tecido em cada pixel. Calcule a concentração média do tecido ¹⁴C no ROI.

7. computação de rCPS. Computar rCPS em cada ROI por meio da seguinte equação:

Onde p * (t) é a concentração média ponderada do tecido de ¹⁴c no ROI, c_p(t) e c^*_p(t) são as concentrações plasmáticas arteriais de leucina sem rótulo e rotulada no momento, t, t é o tempo que o animal morreu ( cerca de 60 min), e λ é a fração de leucina na piscina precursora do tecido que vem do plasma. A avaliação do λ é realizada em um experimento separado ⁶. λ foi avaliado nos camundongos WT, Fmr1 knockout, TSC^+/-e PKU ^6,22,25,28. Se um experimento envolver alterações genéticas ou farmacológicas que possam afetar as taxas de síntese protéica, degradação ou metabolismo da leucina, λ deve ser avaliado as novas condições.

Resultados

Aqui nós mostramos uma experiência representativa que demonstra os efeitos da administração prévia de um inibidor da síntese da proteína em rCPS. Anisomycin no soro fisiológico normal foi administrado a um rato selvagem-tipo masculino adulto de C57/BL6 por via subcutânea (100 MGS/quilograma) 30 minutos antes do início da determinação de RCPS. Os efeitos do tratamento com anisomicina em comparação com um animal de controle tratado pelo veículo mostram que o rCPS é quase indetectável no cam...

Discussão

Nós apresentamos um método quantitativo para a determinação de taxas regionais da síntese da proteína cerebral (rCPS) in vivo em animais experimentais. Este método tem vantagens consideráveis sobre os métodos existentes: 1. as medidas são feitas no animal de comportamento acordado, assim que refletem processos contínuos no cérebro de funcionamento. 2. as medições são feitas por meio de autoradiografia quantitativa, proporcionando a capacidade de determinar os rCPS em todas as regiões e sub-regiões do cérebro simultaneame...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos	The Jackson Laboratory	003024	Fmr1 knockout casais reprodutores
Anisomicina	Tocris Bioscience	1290
Tubos de microhematócrito	capilares	Drummond Scientific	1-000-3200-H
Selante de tubo capilar Critoseal Selante	39215003	Leica	Microsystems
Frasco de vidro inserções	Agilent	5183-2089	usadas para coletar amostras de sangue
Digi-Med Blood Pressure Analyzer	Micro-Med Inc.	Analisador de pressão arterial	BPA-400
Sistema de monitoramento de glicose no sangue Bayer Breeze 2	Medidor de glicose	Bayer Breeze	9570A
Seringa estanque	a gás Hamilton Co.	Seringa de vidro tuberculínico	1710
HeatMax HotHands-2 Aquecedores de mãos	HeatMax	Modelo HH2	almofadas de aquecimento
Solução de descarga de bloqueio de heparina	Fresenius Kabi USA, LLC	504505	solução salina de heparina
Recipiente transparente para animais	Instech	MTANK/W	recinto para animais
Correia de mola	Tubo de cateter/acessório para roedores	Instech	PS62
Ganchos giratórios	Instech	375/25	para amarração de mola
Braço giratório e montagem	Ganchos	SMCLA	Instech para giro e recinto de animais
Botão de amarração	Instech	VAB62BS/22	anexa à parte inferior da corda de mola
Tubo de aço inoxidável	Feito internamente	N/A	usado para serpentear cateteres através do mouse
Matrx VIP 3000	Matrx	91305430	vaporizador de isoflurano
Isoflurano	Stoelting Co.	50207	adsorvente de isoflurano/halotano
Clippers	Oster Finisher	Modelo 59
Ganchos cirúrgicos	para pele Fabricado internamente (??)	N/A (??)
0,9% de cloreto de sódio Salino	APP Pharmaceuticals LLC	918610
Fórceps	Fine Science Tools	11274-20
Tesoura cirúrgica	Fine Science Tools	14058-11
Microscissors	Fine Science Tools	15000-00
UNIFY suturas cirúrgicas de seda	AD Surgical	#S-S618R13	6-0 USP, tubulação de
polietileno PE-8	SAI Infusion Technologies	PE-8-25
Seringa	Becton Dickinson and Co.	309659	de 1cc/mL
	Argila Adams	427400
MCID Analysis	Imaging Research Inc.	de densidade óptica	versão 7.0
Lâminas revestidas com gelatina (75x25mm)	FD Neurotechnologies	PO101
Cryostat	Leica	CM1850
Super RX-N filme de raio-x médico	Fuji	47410-19291
Hypercassettes (8x10 in)	Amersham Pharmacia Biotech	11649
[1-14C]leucina	Moravek	MC404E
	Sarstedt Aktiengesellschaft & Co.	72.692.005	usado para desproteinizar amostras de sangue
Pipeta pasteur de vidro	Wheaton	357335
Lã de vidro	Sigma-Aldrich	18421
Nitrogênio	NIH Supply Center	6830009737285
Fluido de cintilação	CytoScint	882453
Contador de cintilação líquida	Packard Tri-Carb	2250CA
Analisador de aminoácidos	Pickering Laboratories	Pinnacle PCX
HPLC unit	Agilent Technologies	1260 Infinity	inclui 1260 Bomba Bio-Inerte
Microscópio cirúrgico	Wild Heerbrugg	M650
Ácido sulfossalicílico	Sigma-Aldrich	MKBS1634V	Ácido 5-sulfossalicílico di-hidratado
Norleucina	Sigma	N8513
1.0 N HCl	Sigma-Aldrich	H9892
[H3]leucina	Moraevk	MC672
Tubo Falcon	Thermo Scientific	339652	tubos de centrífuga cônicos 50 mL
Cronômetro	Heuer Microsplit	Modelo 1000	1/100 min
Solução de Eutanásia	Vet One	H6438
Northern Light Precision Illuminator	Imaging Research Inc.	luz fluorescente	modelo B95
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8	Nikon	1442	Câmera CDD