Método autoradiográfico quantitativo para determinação das taxas regionais de síntese protéica cerebral in vivo

R. Michelle Saré; Anita Torossian; Michael Rosenheck; Tianjian Huang; Carolyn Beebe Smith

doi:10.3791/58503

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Artigo de método

Método autoradiográfico quantitativo para determinação das taxas regionais de síntese protéica cerebral in vivo

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DOI:

10.3791/58503

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28 de junho de 2019

R. Michelle Saré¹ , Anita Torossian¹ , Michael Rosenheck¹ , Tianjian Huang¹ , Carolyn Beebe Smith¹

¹Section on Neuroadaptation and Protein Metabolism, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

A síntese proteica é um processo biológico crítico para as células. No cérebro, é necessário para mudanças adaptativas. A mensuração das taxas de síntese proteica no cérebro intacto requer considerações metodológicas cuidadosas. Aqui nós apresentamos o L-[1-¹⁴C]-método Bakersfield quantitativo da leucina para a determinação de taxas regionais da síntese da proteína cerebral in vivo.

Resumo

A síntese protéica é necessária para o desenvolvimento e manutenção da função neuronal e está envolvida em mudanças adaptativas no sistema nervoso. Além disso, pensa-se que o desregulação da síntese da proteína no sistema nervoso pode ser um phenotype do núcleo em algumas desordens desenvolventes. A medida exata das taxas da síntese da proteína cerebral em modelos animais é importante para compreender estas desordens. O método que desenvolvemos foi projetado para ser aplicado ao estudo de animais acordados e comportados. É um método autoradiográfico quantitativo, de modo que pode render taxas em todas as regiões do cérebro simultaneamente. O método é baseado no uso de um aminoácido traçador, L-[1-¹⁴C]-leucina, e um modelo cinético do comportamento da L-leucina no cérebro. Nós escolhemos L-[1-¹⁴C]-leucina como o Tracer porque não conduz aos produtos metabólicos etiquetados estranhos. É incorporado na proteína ou metabolizado ràpida para render ¹⁴co₂que é diluído em uma grande associação de co₂sem rótulo no cérebro. O método e o modelo também permitem a contribuição da leucina sem rótulo derivada da proteólise tecidual para a associação precursora do tecido para síntese proteica. O método tem a resolução espacial para determinar as taxas de síntese protéica em camadas de células e neurópilo, bem como núcleos hipotalâmicos e do nervo craniano. Para obter dados quantitativos confiáveis e reprodutíveis, é importante aderir aos detalhes processuais. Aqui apresentamos os procedimentos detalhados do método quantitativo autoradiográfico L-[1-¹⁴C]-leucina para a determinação das taxas regionais de síntese protéica in vivo.

Introdução

A síntese proteica é um importante processo biológico necessário para a mudança adaptativa de longo prazo no sistema nervoso¹. A inibição da síntese proteica bloqueia o armazenamento de memória de longo prazo em invertebrados e vertebrados². A síntese proteica é essencial para a manutenção das fases tardias de algumas formas de potenciação a longo prazo (LTP) e depressão a longo prazo (Ltd)³, sobrevivência neuronal durante o desenvolvimento⁴, e para a manutenção geral do neurônio e sua conexões sinápticas⁵. A mensuração das taxas de síntese de proteí....