Artigo de método

Análise temporal de translocação Nuclear e citoplasmática de uma Herpes Simplex vírus 1 proteína pela microscopia Confocal imunofluorescência

DOI:

10.3791/58504

⸱

4 de novembro de 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

Neste artigo

Resumo

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ICP0 sofre translocação nuclear-para-citoplasmática durante a infecção HSV-1. O mecanismo molecular deste evento não é conhecido. Aqui nós descrevemos o uso do microscópio confocal como uma ferramenta para quantificar o movimento de ICP0 na infecção pelo HSV-1, que estabelece as bases para a análise de quantitativamente ICP0 translocação em futuros estudos mecanicistas.

Resumo

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Célula infectada proteína 0 (ICP0) de herpes simplex vírus 1 (HSV-1) é uma proteína de início imediata contendo um anel tipo E3 ubiquitina ligase. É responsável pela degradação proteasomal de fatores restritivos do hospedeiro e a ativação do gene viral subsequentes. ICP0 contém uma sequência canônica de localização nuclear (NLS). Ele entra no núcleo imediatamente após a síntese de novo e executa suas funções de defesa do antiprincipalmente hospedeiro no núcleo. No entanto, mais tarde em infecção, ICP0 é encontrada exclusivamente no citoplasma, sugerindo a ocorrência de uma translocação nuclear-para-citoplasmática durante a infecção HSV-1. Presumivelmente ICP0 translocação permite ICP0 modular as suas funções de acordo com sua localização subcellular em fases diferentes de infecção. A fim de delinear a função biológica e mecanismo regulatório de translocação nuclear e citoplasmático ICP0, nós modificamos um método de microscopia de imunofluorescência para monitorar o tráfico de ICP0 durante a infecção HSV-1. Este protocolo envolve a coloração imunofluorescente, microscópio confocal de imagem e nuclear vs citoplasmática análise da distribuição. O objetivo do presente protocolo é adaptar as imagens confocal de estado estacionário, tomadas em um curso de tempo em uma documentação quantitativa do movimento ICP0 em toda a infecção lítica. Propomos que este método pode ser generalizado para analisar quantitativamente nuclear vs localização citoplasmática de outras proteínas virais ou celulares sem envolvendo tecnologia de imagem ao vivo.

Introdução

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Herpes simplex vírus 1 (HSV-1) faz com que uma ampla gama de leves a graves doenças herpéticas incluindo herpes labial, herpes genital, ceratite estromal e encefalite. Uma vez infectado, o vírus estabelece uma infecção latente ao longo da vida nos neurônios do gânglio. Ocasionalmente, o vírus pode ser reativado por várias razões, tais como febre, estresse e imunossupressão1, levando a infecção de herpes recorrente. Célula infectada proteína 0 (ICP0) é um regulador de viral chave crucial para a infecção de HSV-1 lítica e latente. -Preferencialmente a jusante vírus genes através de contrariar o anfitrião intrínseco/inata defesas antivirais2,3. ICP0 tem uma atividade de ligase E3 ubiquitina, que tem como alvo a diversos fatores de célula para degradação de proteossomo dependente3. Também interage com várias vias de célula para regular as suas actividades e, posteriormente, para compensar o anfitrião restrições antiviral3. ICP0 é conhecido para localizar em diferentes compartimentos subcellular enquanto a infecção prossegue3,4,5. A proteína tem um sinal de localização nuclear de lisina e arginina-rich (NLS), situado em resíduos 500 para 5066. A síntese de novo no início infecção HSV-1, ICP0 imediatamente é importado para o núcleo. Primeiro é detectado em uma dinâmica nuclear estrutura denominado domínio nuclear 10 (ND10)7. A atividade E3 ubiquitina ligase ICP0 provoca a degradação de proteínas de organizador ND10, promielocítica leucemia (PML) proteína e proteína salpicados 100 kDa (Sp100)8,9,10. Após a perda de proteínas do organizador, ND10 corpos nucleares estão dispersos e ICP0 é difundida para preencher o núcleo inteiro4,11.

Curiosamente, após o início da replicação do DNA viral, ICP0 desaparece a partir do núcleo. Pode ser encontrada exclusivamente no citoplasma, sugerindo a ocorrência de uma translocação nuclear-para-citoplasmática no final de4,de infecção HSV-112. A exigência da replicação de DNA implica o envolvimento potencial de um tarde antisentido viral em facilitar a translocação citoplasmática de HSV-1 ICP04,12. Aparentemente ICP0 tráfico entre diferentes compartimentos durante infecção capacita ICP0 modular suas interações para vários caminhos celulares de forma espaço-temporal, e, portanto, coordenar suas funções múltiplas à multa ajustar o equilíbrio entre o lítico e latente HSV-1 infecção13. Para entender melhor a multifuncionalidade do ICP0 e a coordenação de ICP0 domínios funcionais durante a infecção lítica, dissequei cuidadosamente a base molecular da dinâmica translocação ICP012. Para realizar os estudos mecanicistas anteriormente relatados12, nós aplicamos um método de coloração imunofluorescente para visualizar a Localização subcellular ICP0 no status de infecção diferentes sob microscópio confocal. Também desenvolvemos um protocolo quantitativo para analisar a nuclear vs citoplasmática distribuição de ICP0 usando o software confocal. A população de células infectadas HSV-1 foi tabulada ao longo das fases de infecção e as tendências do movimento de ICP0 foram analisadas, sob diferentes tratamentos bioquímicos12. Aqui descrevemos o protocolo detalhado a translocação de documentos ICP0 em infecção HSV-1. Propomos que este método pode ser adotado como um método geral para estudar a nuclear vs translocação citoplasmática para outras proteínas virais ou celulares, que pode servir como uma alternativa para imagens ao vivo quando a técnica de imagem ao vivo não é aplicável devido a problemas tais como rotulagem método, intensidade de sinal ou abundância de proteína.

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Protocolo

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1. célula propagação e infecção pelo vírus

  1. A 20 – 24 h antes da infecção pelo vírus, semente de 5 x 104 de células de fibroblastos de pulmão embrionário humano (HEL) ou outras células a ser examinado em um slide escalonada de 11 mm 4-bem no meio de crescimento (de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de bovino fetal soro (FBS)). Incube as células a 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO2).
    Nota: Cada um bem deve ter confluência de célula de 70-80% no momento da infecção.
  2. No dia seguinte, retire o meio de crescimento e infectar as células com vírus em médio-199 a uma distância de 4-10 pfu/célula. Incubar as células infectadas por vírus durante 1 h a 37 ° C. Abanando o slide durante o período de incubação.
  3. Após a incubação de 1 h, remover médio-199 e completar com meio de cultura.
    Nota: Medicamentos que interferem com fases diferentes de infecção podem ser adicionados a esta etapa ou antes da absorção viral.
  4. Incube as células infectadas por vírus, a 37 ° C com 5% de CO2 para vários comprimentos do período de infecção.

2. fixação e permeabilização

  1. Hora de infecção adequada, rapidamente lavar as células infectadas com tampão fosfato salino (PBS) 3 vezes e adicionar 200 μL de paraformaldeído 4% preparado na PBS. Incube as celulas com paraformaldeído para 8 – 10 min à temperatura ambiente para consertar as células em cada poço.
  2. Paraformaldeído, Aspire e lavar os poços com 200 µ l de PBS por 3 vezes. PBS, Aspire completamente após a lavagem 3rd .
  3. Adicione 100 μL de 0,2% de tensoativo não-iônico para cada poço para permeabilize as células por 5-10 min.
  4. Aspirar o tensoativo não-iônico e lavar os poços com 200 µ l de PBS por 3 vezes.

3. imunofluorescência coloração

  1. Completamente, Aspire PBS e adicionar 200 μL de tampão de bloqueio (1% albumina de soro bovino (BSA) e 5% de soro de cavalo em PBS) em cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 1 h, ou a 4 ° C durante a noite.
  2. Adicionar determinada experimentalmente a concentração do anticorpo primário (coelho anti-ICP0 anticorpo policlonal12) em tampão de bloqueio e incubar o anticorpo primário em temperatura ambiente por 2 h ou a 4 ° C durante a noite.
  3. Lavar com tampão de bloqueio 3 vezes com incubação de 10 min. Adicione o anticorpo secundário de Alexa 594-conjugados de cabra anticoelho (1: 400, diluído em tampão de bloqueio) e a incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Em seguida, lave as lâminas 3 vezes com tampão de bloqueio no intervalo de 10 min.
  4. Finalmente, lave o slide uma vez com PBS para remover BSA residual e soro de cavalo.
  5. Adicione uma gota de meio de montagem antidesgaste com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para montar o slide e selá-lo com lamela usando esmalte transparente.

4. confocal Imaging

  1. Com um microscópio confocal, defina o comprimento de onda em 590 – 650 nm para Alexa 594 e 410 – 520 nm para DAPI. Selecione o formato de imagem em 1024 x 1024 e linha média de 8 para adquirir imagens de alta resolução.
  2. Analise cada poço no slide 4-bem sob microscópio confocal. Adquira imagens de células representativas no âmbito do objectivo de X 100, como mostrado na Figura 1 e Figura 2.
  3. Para contar com grande número de células, com imagens dos campos consecutivos no âmbito do objectivo de X 40.
    Nota: Requer 5 – 10 imagens para acumular mais de 200 células infectadas de cada ponto de tempo de cada infecção.
  4. Em cada experimento, tire fotos com parâmetros confocal constantes para todas as amostras precisa ser comparado.

5. analisando Nuclear vs distribuição citoplasmática

  1. Abrir o projeto com o software aplicativo confocal. Selecione uma imagem da qual células precisam ser tabulados para nuclear vs distribuição citoplasmática de ICP0.
  2. Clique na guia "Quantidade" no menu superior e selecione "ROIs de classificar" no menu ferramentas.
  3. Desenhe uma linha longitudinal em toda a célula a ser analisado, selecionando "Limite" no menu superior.
    Nota: Histograma aparecerá mostrando a intensidade de fluorescência ao longo da linha para ICP0 e DAPI. No histograma, a linha azul representa DAPI pixels e marca a fronteira do núcleo, Considerando que a linha vermelha representa ICP0 pixels.
  4. Com base na coloração de fundo, configure um limite constante de intensidade ICP0 analisar a distribuição subcellular de ICP0 em cada experimento.
    1. Como exemplificado na Figura 2, se o vermelho do sinal em média é inferior ao limiar da região nuclear mas é acima do limiar além do limite da azul, categorizar o sinal vermelho como predominantemente localizados no citoplasma.
    2. Se o sinal vermelho estiver acima do limite em todo o núcleo e os limites do sinal azul, grupo o sinal vermelho como núcleo mais localização citoplasmática.
    3. Se o sinal vermelho estiver acima do limite no núcleo, mas em média é abaixo dele fora do limite do sinal azul, do grupo o sinal vermelho como localização nuclear.
  5. Tabulate mais de 200 células infectadas de cada amostra em tempo de infecção diferentes e trama em gráfico de barras para ilustrar o movimento de ICP0 de acordo com o tempo (Figura 3).

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Resultados

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Para entender a base molecular e funções biológicas de ICP0 tráfico durante a infecção HSV-1, usamos um método de microscopia de imunofluorescência para analisar ICP0 distribuição subcellular em fases diferentes de infecção. A Figura 1 mostra as células representativas com distintiva localização ICP0 no decorrer da infecção. Para quantificar a translocação nuclear e citoplasmática de ICP0, analisamos a distribuição de ICP0 em relação ao núcleo categorizando c...

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Discussão

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Este protocolo tem sido costumava estudar a translocação nuclear e citoplasmática de HSV-1 ICP0. ICP0 sofre tráfico subcellular durante a infecção HSV-1 (Figura 1). Provavelmente, ICP0 interage com várias vias de célula para realizar diferentes funções em diferentes locais. Isso permite que o ICP0 afinar suas múltiplas funções no cabo de guerra com hospedeiro humano13. No entanto, como ICP0 coordenadas as múltiplas funções de forma espaço-temporal não foi bem estudada...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos o apoio financeiro de uma subvenção de NIH (RO1AI118992), atribuído a Haidong Gu. Agradecemos a instalação de microscopia, imagem & Core Cytometry recursos (MICR) Universidade Estadual de Wayne para suporte técnico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células e vírus
Fibroblastos de pulmão embrionário humano (células HEL)Dr. Thomas E. Shenk (Universidade de Princeton)células HEL foram cultivadas em DMEM suplementadas com 10% de estoque viral FBS
HSV-1 (cepa F)Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM)Invitrogen  11965-092
Soro Fetal Bovino (FBS)SigmaF0926-500ml
Médio-199 (10x)Gibco11825-015
Reagentes
4- poço 11 mm lâmina escalonadaCel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% Solução de paraformaldeído (w / v) Sem metanolThermo Scientific28908
Triton X-100Fisher reagentesBP151-1C0
Soro bovino Abumin (BSA)CalbiochemCAS 9048-46-8
Soro de cavaloSigmaH1270
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)Dr. Haidong Gu lab
NaCl           Biorreagente FisherBP358-212
KH2PO4                       Bioreagente FisherBP362-500
KCl                         Fisher Scientific BP366-500
Na2HPO4                         Fisher BioreagentBP332-500
Tampão de bloqueio (PBS com 1% BSA e 5% de soro de cavalo)Dr. Haidong Gu laboratório
Rabiit Anti-ICP0 anticorpoDr. Haidong Gu laboratório
PML (PG-M3) - IgG monoclonal de camundongosanta Cruz BiotecnologiaSC-966
Alexa Fluor 594 - cabra anti-coelho IgGinvitrogenA11012
Alexa Fluor 488-cabra anti-rato IgGinvitrogenA11001
Vectashield Mouting meio com DAPIVector laboratoriesH-1200
Pasteur pipetaFisher Brand13-678-20D
EsmalteSally Hansen
Equipment
ConfocalLeica SP8
Software ConfocalLeica LAS X Suíte
de aplicativos Software ExcelMicrosoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubadoraThermo ScientificCódigo de pedido 51026282
As

Referências

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Transloca o Nucleocitoplasm ticaProte na ICP0 do HSV 1An lise de Tr fego ProteicoLocaliza o SubcelularProtocolo de Imagem ConfocalMedi o de Intensidade de Fluoresc nciaColora o Nuclear com DAPICurso Temporal de Infec oAtiva o de Gene Viral

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