Análise temporal de translocação Nuclear e citoplasmática de uma Herpes Simplex vírus 1 proteína pela microscopia Confocal imunofluorescência

Resumo

ICP0 sofre translocação nuclear-para-citoplasmática durante a infecção HSV-1. O mecanismo molecular deste evento não é conhecido. Aqui nós descrevemos o uso do microscópio confocal como uma ferramenta para quantificar o movimento de ICP0 na infecção pelo HSV-1, que estabelece as bases para a análise de quantitativamente ICP0 translocação em futuros estudos mecanicistas.

Resumo

Célula infectada proteína 0 (ICP0) de herpes simplex vírus 1 (HSV-1) é uma proteína de início imediata contendo um anel tipo E3 ubiquitina ligase. É responsável pela degradação proteasomal de fatores restritivos do hospedeiro e a ativação do gene viral subsequentes. ICP0 contém uma sequência canônica de localização nuclear (NLS). Ele entra no núcleo imediatamente após a síntese de novo e executa suas funções de defesa do antiprincipalmente hospedeiro no núcleo. No entanto, mais tarde em infecção, ICP0 é encontrada exclusivamente no citoplasma, sugerindo a ocorrência de uma translocação nuclear-para-citoplasmática durante a infecção HSV-1. Presumivelmente ICP0 translocação permite ICP0 modular as suas funções de acordo com sua localização subcellular em fases diferentes de infecção. A fim de delinear a função biológica e mecanismo regulatório de translocação nuclear e citoplasmático ICP0, nós modificamos um método de microscopia de imunofluorescência para monitorar o tráfico de ICP0 durante a infecção HSV-1. Este protocolo envolve a coloração imunofluorescente, microscópio confocal de imagem e nuclear vs citoplasmática análise da distribuição. O objetivo do presente protocolo é adaptar as imagens confocal de estado estacionário, tomadas em um curso de tempo em uma documentação quantitativa do movimento ICP0 em toda a infecção lítica. Propomos que este método pode ser generalizado para analisar quantitativamente nuclear vs localização citoplasmática de outras proteínas virais ou celulares sem envolvendo tecnologia de imagem ao vivo.

Introdução

Herpes simplex vírus 1 (HSV-1) faz com que uma ampla gama de leves a graves doenças herpéticas incluindo herpes labial, herpes genital, ceratite estromal e encefalite. Uma vez infectado, o vírus estabelece uma infecção latente ao longo da vida nos neurônios do gânglio. Ocasionalmente, o vírus pode ser reativado por várias razões, tais como febre, estresse e imunossupressão¹, levando a infecção de herpes recorrente. Célula infectada proteína 0 (ICP0) é um regulador de viral chave crucial para a infecção de HSV-1 lítica e latente. -Preferencialmente a jusante vírus genes através de contrariar o anfitrião intrínseco/inata defesas antivira....

Protocolo

1. célula propagação e infecção pelo vírus

1. A 20 – 24 h antes da infecção pelo vírus, semente de 5 x 10⁴ de células de fibroblastos de pulmão embrionário humano (HEL) ou outras células a ser examinado em um slide escalonada de 11 mm 4-bem no meio de crescimento (de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de bovino fetal soro (FBS)). Incube as células a 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO₂).
   Nota: Cada um bem deve ter confluência de célula de 70-80% no momento da infecção.
2. No dia seguinte, retire o meio de crescimento e infectar as células com vírus em médio-199 a uma distância de 4-10 pfu/célula. Incu....

Resultados

Para entender a base molecular e funções biológicas de ICP0 tráfico durante a infecção HSV-1, usamos um método de microscopia de imunofluorescência para analisar ICP0 distribuição subcellular em fases diferentes de infecção. A Figura 1 mostra as células representativas com distintiva localização ICP0 no decorrer da infecção. Para quantificar a translocação nuclear e citoplasmática de ICP0, analisamos a distribuição de ICP0 em relação ao núcleo categorizando c.......

Discussão

Este protocolo tem sido costumava estudar a translocação nuclear e citoplasmática de HSV-1 ICP0. ICP0 sofre tráfico subcellular durante a infecção HSV-1 (Figura 1). Provavelmente, ICP0 interage com várias vias de célula para realizar diferentes funções em diferentes locais. Isso permite que o ICP0 afinar suas múltiplas funções no cabo de guerra com hospedeiro humano¹³. No entanto, como ICP0 coordenadas as múltiplas funções de forma espaço-temporal não foi bem estudada.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células e vírus
Fibroblastos de pulmão embrionário humano (células HEL)	Dr. Thomas E. Shenk (Universidade de Princeton)		células HEL foram cultivadas em DMEM suplementadas com 10% de estoque viral FBS
HSV-1 (cepa F)	Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM)	Invitrogen	11965-092
Soro Fetal Bovino (FBS)	Sigma	F0926-500ml
Médio-199 (10x)	Gibco	11825-015
Reagentes
4- poço 11 mm lâmina escalonada	Cel-Line/Thermofisher Scientific	30-149H-BLACK
16% Solução de paraformaldeído (w / v) Sem metanol	Thermo Scientific	28908
Triton X-100	Fisher reagentes	BP151-1C0
Soro bovino Abumin (BSA)	Calbiochem	CAS 9048-46-8
Soro de cavalo	Sigma	H1270
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)	Dr. Haidong Gu lab
NaCl	Biorreagente Fisher	BP358-212
KH2PO4	Bioreagente Fisher	BP362-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
Na2HPO4	Fisher Bioreagent	BP332-500
Tampão de bloqueio (PBS com 1% BSA e 5% de soro de cavalo)	Dr. Haidong Gu laboratório
Rabiit Anti-ICP0 anticorpo	Dr. Haidong Gu laboratório
PML (PG-M3) - IgG monoclonal de camundongo	santa Cruz Biotecnologia	SC-966
Alexa Fluor 594 - cabra anti-coelho IgG	invitrogen	A11012
Alexa Fluor 488-cabra anti-rato IgG	invitrogen	A11001
Vectashield Mouting meio com DAPI	Vector laboratories	H-1200
Pasteur pipeta	Fisher Brand	13-678-20D
Esmalte	Sally Hansen
Equipment
Confocal	Leica SP8
Software Confocal	Leica LAS X Suíte
de aplicativos Software Excel	Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubadora	Thermo Scientific	Código de pedido 51026282