Visualização da migração celular tangencial no desenvolvimento Tectum óptica de Chick

Summary

Descrevemos os métodos para a rotulagem fluorescente de tangencialmente migração células por eletroporação e para a imagem latente de lapso de tempo do movimento de célula rotulada em uma cultura de montagem plana a fim de visualizar a migração celular comportamento no tectum óptica do pintinho em desenvolvimento .

Abstract

Imagem de lapso de tempo é um método poderoso para analisar o comportamento de migração celular. Após a célula fluorescente rotulagem, o movimento das células em cultura etiquetados pode ser gravado sob microscopia de vídeo. Para a análise de migração celular no cérebro em desenvolvimento, fatia cultura comumente é usada para observar a migração celular paralela à seção de fatia, tais como migração celular radial. No entanto, informação limitada pode ser obtida o método de cultura de fatia para analisar a migração celular perpendicular à seção de fatia, tais como migração celular tangencial. Aqui, apresentamos os protocolos para Time-Lapse de imagens para visualizar a migração celular tangencial no tectum óptica do pintinho em desenvolvimento. Uma combinação de célula rotulagem por eletroporação no ovo e uma cultura de montagem plana subsequente na inserção da cultura de célula permite a detecção de movimento de células migratórias no plano horizontal. Além disso, nosso método proporciona detecção de comportamento de célula individual e a ação coletiva de um grupo de células a longo prazo. Potencialmente, este método pode ser aplicado para detectar a alteração sequencial da fluorescente-etiquetadas microestrutura, incluindo o alongamento axonal no deslocamento de tecidos ou células neural nos tecidos não-neurais.

Introduction

O estudo da migração celular tem sido progredindo com a técnica de avançada de imagem ao vivo. Após a célula fluorescente rotulagem, o movimento temporal de pilhas etiquetadas em um prato de cultura ou na vivo pode ser gravado sob microscopia de vídeo. No estudo do desenvolvimento neural, foram analisadas as mudanças morfológicas da migração de células ou alongando axônios utilizando imagens de lapso de tempo. Para a imagem latente eficaz, é essencial para aplicar um método adequado para a preparação de rotulagem e tecido fluorescente célula, baseado sobre a finalidade do experimento e análise. Para analisar a migração celular no cérebro em desenvolvimento, f....

Protocol

1. Electroporation no Ovo

1. Prepare o plasmídeo de expressão para a rotulagem fluorescente em alta concentração. Isole o DNA de 200 mL de cultura bacteriana pelo método de Lise alcalina, utilizando colunas permutadora de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de materiais). Mix pCAGGS-EGFP e pCAGGS-mCherryNuc em uma concentração final de 4 µ g / µ l cada.
   Nota: A purificação de DNA de plasmídeo livre de endotoxinas pode ser preferencial para eletroporação.
2. Incube ovos férteis de galinha horizontalmente a 38 ° C, em 70% de humidade relativa.
3. Após 2,5 dias, eliminar 5 mL de albumina (clara de ovo) do lado po....

Results

A Figura 2 mostra a migração tangencial superficial visualizada em uma cultura de plano de montagem em um tempo decorrido (0, 9, 18, 27 h) após o início da gravação. Filme 1 é um filme lapso de tempo de 10 min-intervalos durante um período de 28 h e 50 min. O quadro está selecionado para enfocando as células migrando do canto inferior esquerdo etiquetado do quadro para o espaço sem rótulo (Figura 3A

Discussion

O protocolo descrito acima é otimizado para a detecção de migração celular em camadas superficiais^6,8. É aplicável para a detecção de camada média migração córregos (filme 5),^6,7, só pelo momento da eletroporação (5.5 a e 4.5) e o início da cultura de movimento e imagem (E7.0 a E6.0).

O procedimento apresentado é composto de células rotulagem .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	kit de purificação de DNA de plasmídeo livre de endotoxinas
Seringa de 20 ml	TERUMO	SS-20ESZ
Agulha de calibre 18	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicilina e estreptomicina	Gibco	15140-122
tubo capilar de vidro	Narishige	G-1
inserção de cultura de células	Millipore Millicell	CM-ORG
Laminina	SIGMA	L2020	revestimento de inserção de cultura
poli-L-Lisina	Peptídeo Instituto	3075	revestimento de inserção de cultura
prato de fundo de vidro	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	meio de cultura
F12	Gibco	11765-054	meio de cultura
fetal soro bovino	Gibco	12483	meio de cultura
soro de pintinho	Gibco	16110082	meio de cultura
10xHBSS	Gibco	14065-056
faca microcirúrgica	Cooperação de especialidades cirúrgicas	72-1501
Nome	Empresa<	strong>Número de catálogo	Comentários
Equipamento >
fortecurva	AS ONE	No.11
processador de micropipetas	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
com eléctrodo tipo pinça	BEX	LF646P3x3
gerador de impulsos	BEX	CUY21EX	microscópio
estereoscópico de fluorescência de fluorescência	Leica	MZ16F
microscópio de fluorescência invertida	Controlador
	Controlador de temperatura Tokken	MIGM/OL-2
Unidade confocal a laser