Ensaio da atividade da endotoxina para a deteção do endotoxemia do sangue inteiro em pacientes criticamente doentes

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para medir na cabeceira a atividade da endotoxina de amostras de sangue inteiras humanas. O ensaio da atividade da endotoxina é um teste simples a executar e pode ser um biomarcador útil em pacientes criticamente doentes com sepsis.

Resumo

Lipopolissacaríno, também conhecido como endotoxina, é um componente fundamental das bactérias Gram-negativas e desempenha um papel crucial no desenvolvimento da sepse e choque séptico. A identificação adiantada de um processo infeccioso que esteja evoluindo ràpida a uma doença crítica pôde alertar um tratamento mais rápido e mais intensivo, desse modo potencial conduzindo aos melhores resultados pacientes. O ensaio da atividade da endotoxina (ea) pode ser usado na cabeceira como um biomarcador de confiança do endotoxemia sistemático. A deteção de níveis elevados da atividade da endotoxina foi mostrada repetidamente para ser associada com uma severidade aumentada da doença nos pacientes com sepsis e choque séptico. O ensaio é rápido e fácil de executar. Brevemente, após a amostragem, uma alíquota de sangue total é misturada com um anticorpo antiendotoxina e com LPS adicionado. A atividade da endotoxina é medida como a explosão oxidativa relativa de neutrófilos primados como detectado pela chemioluminescência. A saída do ensaio é expressa em uma escala de 0 (ausente) para 1 (máximo) e categorizada como "baixa" (< 0,4 unidades), "intermediário" (0,4 – 0,59 unidades), ou "alta" (≥ 0,6 unidades). A metodologia detalhada e a justificativa para a implementação do ensaio EA são relatadas neste manuscrito.

Introdução

O lipopolissacarídeo (LPS), também conhecido como endotoxina, é um componente chave da estrutura da membrana de bactérias Gram-negativas (GN). Compõe-se cerca de 10% da parede celular, sendo vital para a integridade da membrana externa e homeostase. Além disso, é um ativador potente do sistema imunológico inata do hospedeiro^1,2.

A exposição in vitro de células inatas do sistema imunológico a LPS leva a alterações na expressão de múltiplos genes³. A administração de quantidades muito pequenas de LPs em voluntários humanos saudáveis desencadeia a cascata de inflamação sistêmica aguda, enquanto a sepse e choque séptico podem surgir com maiores concentrações de endotoxina^4,5.

A sepse é uma condição de risco de vida que, se não prontamente reconhecida, pode levar a falência de múltiplos órgãos e morte. Os pacientes sépticos devem ser tratados em tempo hábil, com ressuscitação agressiva, antibioticoterapia adequada, controle de fonte ideal e estratégias de apoio a órgãos. O diagnóstico da etiologia do sepsis é baseado primeiramente no reconhecimento clínico e na deteção cultura-baseada do micróbio patogénico⁶. No entanto, os resultados das culturas microbianas podem levar até 48 h e são inconclusivos em até 30% dos casos⁷. A identificação precoce e a intervenção podem levar a melhores resultados do paciente. Em pacientes em que a sepse é suspeita, as decisões são muitas vezes feitas com base em parâmetros fisiológicos e bioquímicos, sem um sinal claro de endotoxemia.

A medição da atividade da endotoxina (EA) pode ser obtida por meio de um ensaio comercial (ver tabela de materiais) em sangue total. Pode ser utilizado como biomarcador de endotoxemia sistêmica para a estratificação precoce da severidade da doença, particularmente em pacientes com risco de desenvolver choque séptico⁸. O teste foi usado para guiar a terapia do hemoperfusion de Polymyxin B em um ensaio clínico aleatorizado-controlado duplo-cego recentemente publicado nos pacientes com choque séptico⁹. Em pacientes criticamente enfermos, o estudo do MEDIC mostrou aumento dos níveis de EA para estar associado a disfunção de múltiplos órgãos, tempo de permanência na unidade de terapia intensiva (UTI) e mortalidade¹⁰.

Diferentes ensaios foram desenvolvidos para detectar endotoxina. O ensaio Limulus Amoebocyte lysate (LAL), seja como um teste de Gel-coágulo, turbidimétrico ou cromogênico, tem sido até agora o mais freqüentemente adotado para a estimativa da endotoxina sérica. Baseia-se na capacidade de endotoxina para induzir a coagulação da hemolinfa do caranguejo em ferradura, Limulus Polyphemus. No entanto, este ensaio tem algumas limitações em termos de especificidade. Em particular, ele também pode ser ativado por produtos microbianos que não seja endotoxina, tais como componentes da parede celular fúngica, e pode ser inibida por várias proteínas plasmáticas humanas¹¹.

Durante a última década, a medida da EA foi desenvolvida e validada como um biomarcador de endotoxemia circulante. Comparado ao teste LAL, a EA é mais rápida e fácil de implementar no ambiente clínico. Além disso, demonstrou-se ser mais acurado que a LAL em sangue total, com sensibilidade e especificidade aumentadas, tanto in vitro como in vivo¹².

Apesar de sua aplicação inicial como uma ferramenta diagnóstica adiantada para a identificação rápida de bactérias do GN como agentes causais do sepsis, o nível do ea foi estudado igualmente como um biomarcador da severidade da doença. Neste contexto, demonstrou-se ser particularmente útil avaliar o estado de hipoperfusão devido à doença crítica em curso, como choque séptico ou síndrome pós-parada cardíaca¹³. Mais recentemente, desde o desenvolvimento de sistemas de hemopurificação, um resultado positivo da EA também tem sido proposto como uma ferramenta de triagem para identificar com precisão potenciais candidatos para tal terapia¹⁴. Recentemente, realizou-se um estudo observacional retrospectivo sobre a prevalência e o significado clínico dos altos níveis iniciais de EA em 107 pacientes com choque séptico. Em consonância com outros resultados recentes, verificou-se que a EA é um marcador promissor de severidade da doença em pacientes com choque séptico¹⁵.

O objetivo do presente manuscrito é descrever o método de realização do ensaio EA, seja à beira do leito ou em laboratório, e descrever seu potencial de uso em um cenário representativo de choque séptico. Esta técnica pode detectar a atividade de LPS medindo o estouro oxidativo realçado nos neutrófilos que seguem seu priming por complexos de um anticorpo da antiendotoxina e de LPS. O aumento da ruptura respiratória é detectado por um quimiluminômetro e a quantidade de luz emitida é considerada proporcional à quantidade de endotoxina na amostra de sangue. O ensaio requer poucos reagentes, leva cerca de 30 min para executar e usa tão pouco como 40 μL de sangue total¹².

Protocolo

O protocolo é conduzido de acordo com as diretrizes institucionais relativas ao manuseio de bioespécimes humanos e seguindo os procedimentos operativos padrão atuais do nosso laboratório clínico. O uso de dados da EA e informações clínicas dos pacientes que estão sendo testados seguem as diretrizes do Comitê de ética em pesquisa humana da nossa instituição.

1. conteúdo do equipamento de laboratório e do kit de ensaio

1. Guarde o kit EA a 2 – 8 ° c quando não estiver a ser utilizado.
2. Cada teste do EA consiste em 5 tipos diferentes dos tubos; utilizar cada uma para uma parte diferente do teste (ver secção 2).
   1. Use o tubo #1 (o tubo "Control") para medir a atividade basal da explosão oxidativa não específica dos neutrófilos do paciente na ausência de um anticorpo específico.
   2. Use o tubo #2 (o tubo "Sample") para medir o estouro oxidativo em resposta ao complexo LPS-anticorpo.
   3. Use o tubo #3 (o tubo "Max") para medir a explosão oxidativa máxima dos neutrófilos do paciente em resposta a um excesso de endotoxina.
   4. Use o tubo #4 (o "LPS" tubo) como uma fonte de endotoxina exógena.
   5. Use tubo #5 ("aliquot" tubo) para o armazenamento de sangue.
      Nota: Duplicatas de tubos #1, #2 e #3 são fornecidos para um total de 8 tubos para ser usado para cada amostra de sangue a ser testado (o frasco de reagente EA e teste de controle de qualidade pode ser usado para todos os testes contidos em uma bolsa).
3. Colete amostras de sangue de pacientes em tubos estéreis contendo anticoagulante EDTA. Armazene amostras de sangue à temperatura ambiente antes de executar o teste EA.
4. Antes de iniciar o teste, gire sobre o chemiluminometer e o abanador da incubadora. Aqueça a incubadora à temperatura de 37 ° c.
5. Idealmente, comece a processar a amostra dentro de 30 minutos da coleta de sangue.

2. ensaio da atividade da endotoxina

1. Prepare os tubos de teste da EA para a amostra de sangue de cada paciente que você precisa testar. Coloque os tubos em racks de tubos. Em seguida, retire as tampas.
2. Usando um combipipette, pipeta um volume de 1 mL do reagente do EA da garrafa em tubos #1 (tubo de controle), #2 (tubo de amostra) e #3 (tubo máximo), cada um em duplicado.
   Nota: Pipetar para baixo do lado do tubo para evitar a solução de espirrar para trás.
3. Misture a amostra de sangue do paciente, invertendo suavemente o tubo de coleta de sangue por 20 vezes. Em seguida, pipete 0,5 mL de sangue do paciente para o tubo #4 (tubo máximo LPS) e #5 de tubo (tubo alíquota). Tubo Vortex #4 para 10 s.
4. Põr as cremalheiras do tubo com todos os tubos de teste do EA no abanador da incubadora. Fechar a tampa e incubar por 10 min na temperatura de 37 ° c.
5. Abra a tampa e retire as prateleiras do tubo do agitador da incubadora. Tubo de vórtice #5 (tubo alíquota). Usando uma ponta estéril, pipeta 40 μL de sangue em tubos #1 e #2, em duplicado.
6. Tubo Vortex #4 (LPS tubo). Usando a mesma ponta da pipeta, pipeta 40 μL do sangue do tubo #4 no tubo #3 (tubo máximo), em duplicado.
7. Vortex os seis tubos de ensaio final (#1, #2, #3 e respectivas duplicatas), em seguida, colocá-los de volta em seus racks.
   Nota: Assegure-se de que todos os tubos estejam vórtice para a mesma quantidade de tempo.
8. Coloque as prateleiras do tubo de volta no agitador de incubação e feche a tampa. Ajuste o abanador de incubação em 100 RPM, a seguir comece o movimento por 14 minutos.
9. Insira o cartão de memória da EA rotulado no quimiiluminômetro e pressione Start. Após a incubação de 14 min, siga as instruções exibidas no quimiluminômetro para ler os tubos EA na ordem correta.
10. Vórtice suavemente cada tubo por 10 s antes de colocá-lo no suporte da amostra do quimiiluminômetro. Abra a gaveta da amostra e coloque o tubo #1 no suporte da amostra. Em seguida, feche a gaveta da amostra e aguarde a leitura da unidade de luz relativa (RLU).
11. Repita o passo 2,10 para o tubo 2 e o tubo 3.
12. Repita a etapa 2,10 para tubos duplicados 1, 2 e 3.
    Nota: Tente Vortex todos os tubos para a mesma quantidade de tempo durante as etapas 2.10 – 2.12.
13. Depois de todos os tubos terem sido processados, observe que os resultados da EA serão calculados e impressos automaticamente. Os níveis são expressos como unidades EA e representam a média das determinações duplicadas das mesmas amostras.
14. Repita as etapas 2,2 a 2,13 para cada amostra de sangue que precisa ser testada.
15. Após a conclusão do ensaio, guarde os restantes tubos de ensaio e os reagentes EA a 2 – 8 ° c por até 30 dias.

Resultados

Um homem dos anos de idade 72 foi admitido ao departamento da emergência (ED) de um hospital urbano académico. Poucos dias antes, ele tinha apresentado ao seu médico de cuidados primários reclamando de queima em micção. Uma terapia do short-curso com Fosfomicina oral foi recomendada. Sua história médica incluiu a hipertensão, o diabetes tipo-2 uncomplicated e a hiperplasia prostática benigna. Seus medicamentos incluíram Enalapril, Atorvastatina, Tamsulosin e metformina.

Discussão

O choque séptico ainda hoje está associado a uma mortalidade tão alta quanto 40%, embora essa taxa varie de acordo com os relatos considerados¹⁶. A necessidade de novos e melhores biomarcadores é defendida pela maioria dos especialistas nos campos, a fim de auxiliar os clínicos no diagnóstico precoce, melhor manejo e prognosticação de pacientes com choque séptico⁶.

Realizar um teste de EA não requer conhecimento técnico prévio ou equipamento de l...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit EAA	Spectral Medical Inc.	EAAST-20	Pacote com 20 testes + 1 controle de qualidade
Smart Line TL	Berthold	EAASL	Luminômetro
Agitador de incubadora	GRANT	ES-20	Mini-agitador de incubadora
Vortexer	VWR	444-2790	Instrumento de vórtice