Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.

Resumo

O recrutamento de monócitos do sangue para os tecidos periféricos alvo é fundamental para o processo inflamatório durante a lesão tecidual, desenvolvimento de tumor e doenças auto-imunes. Isto é facilitado através de um processo de captura de fluxo livre para a superfície luminal das células endoteliais ativadas, seguido de sua migração de adesão e transendothelial (transmigração) no tecido afetado subjacente. No entanto, os mecanismos que suportam o recrutamento preferencial e contexto-dependente de subpopulações de monócitos são ainda não são totalmente conhecidos. Portanto, nós desenvolvemos um método que permite o recrutamento de subpopulações diferentes monócitos para ser visualizado e medido sob fluxo simultaneamente. Este método, baseado na imagem latente confocal lapso de tempo, permite a distinção inequívoca entre monócitos aderentes e transmigra. Aqui, descrevemos como esse método pode ser usado para estudar simultaneamente a cascata de recrutamento de monócitos pro-angiogênico e não-angiogênico in-vitro. Além disso, este método pode ser estendido para estudar as diversas etapas do recrutamento de até três populações de monócitos.

Introdução

Os monócitos constituem um componente fagocítica da imunidade inata que é essencial para o combate de patógenos, limpeza de tecidos danificados, angiogênese e a fisiopatologia de muitas doenças, incluindo câncer,^1,2,3 . Os monócitos são células derivadas da medula óssea, compostas de subpopulações heterogêneas que circulam no sangue, mas podem ser recrutadas para o local da inflamação no tecido periférico, através de mecanismos moleculares específicos. As cascatas de recrutamento de monócitos, quanto aos leucócitos em geral, implica diferentes etapas, incluindo captura, rolando, rastejando, prisão, migração de transendothelial (transmigração) e migração através da parede do vaso (membrana basal e mural células)⁴. Estes passos envolvem principalmente moléculas induzida por inflamação na superfície luminal endotelial como selectinas, ligantes de glicoproteína, quimiocinas, moléculas de adesão intercelular e juncional e seus receptores em leucócitos como selectina ligantes e integrinas. Vias de tráfico através das junções de célula endotelial (paracellular) ou através do corpo de célula endotelial (transcellular) podem ser usadas por leucócitos de atravessar a barreira endotelial⁵. Enquanto os monócitos historicamente foram documentados a transmigrar através da rota de transcellular, potenciais divergências no seu percurso migratório têm sido propostas como os monócitos já não são considerados uma população celular homogênea. Agora está se tornando claro que a diversidade de monócitos podem ser definidos por cada uma das suas diferenças e semelhanças, com relação a sua distintivo extravasamento cascatas de^3,6. Portanto, para inequivocamente discriminar entre subpopulações de monócitos, é crucial Visualizar e processar o fenótipo o comportamento de cada uma dessas subpopulações diferentes durante o recrutamento.

Monócitos do humano, porco, rato e rato foram subdivididos em subpopulações fenotípicas com determinadas funções anexam e comportamentos migratórios específicos^7,8,9. Por exemplo, em humanos, monócitos podem ser divididos em três subgrupos com base em sua expressão de superfície de CD14, um co-receptor para lipopolissacarídeo bacteriano e CD16, o receptor de Fc-gama III. Subpopulações de monócitos humanos incluem CD14 clássica⁺CD16^-, intermediário CD14⁺CD16⁺ e não-clássica CD14^dimCD16 células de^{+ 6,9}. O CD14 clássica⁺CD16^– monócitos foram mostrados para ser inflamatória principalmente considerando que a piscina de CD16⁺ monócitos coletivamente foram encontrados para apresentar TIE2 expressão e proangiogenic função¹⁰. Consistentemente, estimulação de células endoteliais com citocinas inflamatórias, tais como necrose de tumor humano fator α (TNF) ou interleucina (IL-1) beta (inflamação convencional) é suficiente para desencadear o recrutamento completo de CD14 clássica⁺CD16 monócitos ^– . No entanto, ações simultâneas de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) A e TNFa (angiogênico orientada por fatores inflamação) são necessárias para provocar a transmigração do CD16⁺ proangiogenic piscina de monócitos³. Historicamente, o sistema tradicional de Transwell sob condições estáticas, a câmara de fluxo paralelo placa e câmaras de fluxo de µ-slide têm sido utilizados para analisar quantitativamente o recrutamento da população de leucócitos de um em um tempo em vitro^{11 ,12,13}. Enquanto estes protocolos validados, um método mais robusto que permitiu a análise simultânea de várias subpopulações de monócitos seria considerado mais perspicaz. Tais metodologias devem contabilizar várias interações e as diferentes frequências de cada respectiva população e também fornecer uma compreensão mecanicista das semelhanças e especificidades para as cascatas de recrutamento que definem cada monócito subconjunto.

Aqui, apresentamos um método baseado sobre a lapso de tempo por imagens do recrutamento de monócitos sob fluxo que permite que o cascades migratórias de subpopulações diferentes monócitos para ser estudado simultaneamente usando microscopia confocal. Este método integra determinados recursos críticos que imitam a inflamação da célula endotelial, bem como a hemodinâmica de monócitos em vênulas pós-capilares, que circula o principal local de recrutamento de leucócitos em vivo. O método proposto utiliza células endoteliais veia umbilical humana (HUVEC), que são geradas através de um protocolo bem estabelecido de isolamento de cabos de cordão umbilical humanos. Este recurso clínico tem a vantagem de ser facilmente disponível como um subproduto biológico, e também proporcionar um rendimento razoável de células endoteliais, que podem ser isolados da veia umbilical. Também usamos corantes fluorescentes e imunofluorescência para distinguir entre os diferentes componentes celulares e microscopia confocal para definir inequivocamente monócito posicionamento (luminal vs abluminal) ao longo do tempo. O protocolo aqui apresentado foi desenvolvido a medida simultaneamente os níveis de transmigração de subpopulações de monócitos. Além disso, deve notar-se que esta metodologia pode ser estendida para estudar outras subpopulações de leucócitos e processos de recrutamento, pelo uso de diferentes biomarcadores e rotulagem.

Protocolo

Materiais humanos foram usados com o consentimento dos doadores voluntários e de acordo com os suíços comités de ética em pesquisa clínica.

1. isolamento e congelamento do Cordão Umbilical humano veia células endoteliais (HUVEC)

1. Adicione 5 mL da solução de revestimento para um balão de T75 (0,1 mg/mL colágeno G e gelatina de 0,2% em tampão fosfato salino PBS pH 7,4) por 30 min a 37 ° C antes de iniciar o isolamento HUVEC.
2. Limpe o cabo com PBS, limpe-a com compressas estéreis e colocá-lo em uma estéril 20 cm placa de Petri. Corte as extremidades do cabo com uma tesoura esterilizada.
3. Identifica a única grande veia e duas artérias pequenas. Suavemente Insira uma cânula com uma torneira de três vias ligada a ele em veia extremidades nas extremidades do cabo.
4. Aperte o cabo e a conexão da cânula firmemente com um comprimento de fio.
5. Perfundir o cordão duas vezes com 20 mL de meio RPMI contendo 100 penicilina U/mL, de 100 U/mL Estreptomicina e de 250 ng/mL anfotericina B para lavar as veias do fio. Este processo faz a aparência do cordão mais brancos e mais clara. Esvazie a veia antes da adição de colagenase, recolhendo o RPMI com uma seringa em uma extremidade.
6. Perfundir a veia com 12 mL de 1 mg/mL colagenase tipo eu (0,22 µm-filtrada).
7. Fechar a torneira na medula termina e incubar o cabo a 37 ° C por 12 min.
8. Massageie suavemente o cabo para desanexar células endoteliais do lúmen da veia.
9. Tomar 30 mL de RPMI contendo 10% de soro fetal bezerro com uma seringa de 50 mL e conectá-lo a uma extremidade do cordão umbilical.
10. Conecte uma seringa vazia de 50 mL para a outra extremidade do cordão umbilical
11. Abra a torneira e perfundir a veia de uma ponta, enquanto que coletando reciprocamente do outro lado.
    Nota: A suspensão coletada contém células endoteliais.
12. Centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min.
13. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células com 10 mL de meio M199 completo (M199 suplementos contendo 20% FCS, crescimento das células endoteliais 15 µ g/mL, sódio de heparina 100 µ g/mL, 0,5 µM de hidrocortisona, 10 µ g/mL de ácido L-ascórbico, 100 penicilina U/mL, 100 U/mL estreptomicina e 250 ng/mL anfotericina B).
14. Remover a solução de revestimento de balão T75 e lave uma vez com PBS.
15. Sementes das células colhidos passo 1.13 para o balão de T75 e colocá-lo na incubadora a 37 ° C com 5% de CO₂.
16. No dia seguinte, lave o balão 3 vezes com o meio M199 completo para remover células vermelhas do sangue residuais e depois mudar o médio a cada 2 dias até a confluência.
17. Na confluência de 80-90%, enxágue a monocamada HUVEC uma vez com 5 mL de PBS e separar as células com 5 mL de tripsina 0,05% em 1 mM EDTA a 37 ° C por 5 min. Adicione 4 mL de M199 e 1 mL de FCS para parar a ação da tripsina. Lave o balão para desanexar todos HUVEC.
18. Recolha uma alíquota de 50 µ l para ser usado para coloração de VE-caderina, PECAM-1 e gp38 e analisar por citometria de fluxo para verificar a pureza HUVEC.
19. Colete o restante do HUVEC da etapa 1.18 em um tubo de 15 mL e centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
20. Descartar o sobrenadante da etapa 1.19, Ressuspender as células em congelamento solução (FCS contendo 10% de DMSO) com uma densidade de 5 x 10⁵ células/mL em cryotubes e congelar a-80 ° C ou em nitrogênio líquido até o uso.
21. Para verificar a pureza HUVEC:
    1. Adicione 1 µ l de anticorpo de VE-caderina-FITC anti-humano, 1 µ l de anticorpo de PECAM1-PE anti-humano e 1 µ l de anticorpo de Podoplanin-APC anti-humano a alíquota de 50 µ l de HUVEC coletado na etapa 1.18.
    2. Incube a temperatura ambiente por 10 min.
    3. Adicionar 100 µ l de PBS e centrifugar a 400 x g durante 30 s.
    4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 100 µ l de PBS. Dados podem agora ser adquiridos por técnicas de citometria de fluxo.
       Nota: HUVEC são positivas para VE caderina e PECAM-1 e negativo para Podoplanin.

2. HUVEC descongelação

Nota: Usar HUVEC na passagem baixa para experimentos (máximos 5 passagens).

1. Revesti um balão T75 com 1 mL da solução de revestimento, a 37 ° C por 30 min.
2. Rapidamente HUVEC de descongelar a 37 ° C por 2 min e ressuspender as células em 10 mL de M199 completa.
3. Centrifugar as células a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min e descartar o sobrenadante.
4. Ressuspender as células em 10 mL de M199 completa.
5. Transferi a suspensão de eritrócitos no frasco pré-pintados. Coloque o frasco na incubadora a 37 ° C com 5% de CO₂. Altere o meio de cultura celular a cada 2 dias.

3. HUVEC cultura na câmara de 0,4 µ-Slide

1. Cinco dias antes de iniciar o experimento de fluxo, pre-revesti as câmaras de um 0,4 µ-slide com 30 µ l de PBS contendo colágeno de 0,1 mg/mL G, gelatina de 0,2% a 37 ° C por 30 min.
2. Lave as câmaras com 100 µ l de PBS.
3. Separe as células de um HUVEC confluente de 80-90% de um balão T75.
4. Enxágue HUVEC com 5 mL de PBS e desanexá-los com 5 mL de tripsina 0,05% a 37 ° C por 5 min.
5. Lave e coletar a suspensão de eritrócitos em M199 completa e contar as células pelo método mais conveniente. Centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
6. Ressuspender as células em 10⁶ células/mL e 30 µ l (30.000 células) por câmara de distribuir.
7. Incube as células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO₂ por 1h.
8. Adicionar 150 µ l de M199 completa para cada câmara e cultura das células durante 5 dias na incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂. Altere o meio em 2 dias.

4. HUVEC mancha para ensaio de recrutamento de monócitos sob fluxo

1. Prepare o suporte de rotulagem de M199 e 1 µM de CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetato) e aquecê-lo a 37 ° C por 5 min antes de rotulagem de célula.
2. HUVEC lavar duas vezes com meio M199 aquecido a 37 ° C.
3. Substituir o medium com 30 µ l de aquecido médio rotulagem contendo 1 µM de CMFDA e coloque dentro da incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂ por 10 min.
4. Lave uma vez com M199 completa e incube as celulas com M199 completa na incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂ por 30 min.
   Nota: É importante remover todos os vestígios de soro antes da adição da solução de etiquetagem, caso contrário ele pode alterar HUVEC coloração.
5. Substituir o medium com M199 completa contendo qualquer TNFa humana (500 U/mL) ou uma mistura de TNFa humana (500 U/mL) com a célula humana (1 µ g/mL) para 6 h na incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂.

5. isolamento de monócitos humanos Pan e coloração de subpopulações

1. Use um casaco de buffy de concentrado de sangue humano, ou 20 mL de sangue humano fresco isolado, coletado no dia do experimento em tubos vacutainer de EDTA.
2. Diluir o sangue em PBS-1 mM EDTA (1:1) e suavemente Pipetar 20 mL do sangue diluído em cima a 20 mL de mídia gradiente de densidade. Centrifugar a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente com aceleração lenta e sem freio.
3. Recolher a células mononucleares do sangue periférico (PBMC)-camada de plaquetas (entre mídia de gradiente de densidade e camadas de plasma) em um novo tubo de 50 mL contendo 40 mL de PBS - 1 mM EDTA. Top com PBS - 1 mM EDTA até 50 mL.
4. Centrifugar a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min. descartar o sobrenadante.
5. Ressuspender as células com 10 mL de tampão de coloração (PBS - 1 mM EDTA contendo albumina de soro bovino 0,5% BSA).
6. Centrifugar a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min. descartar o sobrenadante.
7. Repita os passos de 5.5 e 5.6.
8. Ressuspender as células com 10 mL de tampão de coloração. Tome uma alíquota de 10 µ l para uma contagem de células.
9. Populações de PBMC de verificar e contar as células rapidamente com um citômetro de fluxo.
   Nota: As populações de linfócitos e monócitos características podem ser observadas (figura 1A). De 50 mL de sangue humano fresco esperar sobre 50-100 x 10⁶ PBMC.
10. Para o recrutamento de CD14 + contra CD14-PBMC sob fluxo:
    1. Lave o pellet três vezes com buffer de fluxo (M199 contendo 0,5% BSA) e ressuspender as células mononucleares no buffer de fluxo em 6 x 10⁶ células / mL.
    2. Fazer alíquotas de 200 µ l para cada ensaio. Incube a 37 ° C até 20 min antes do ensaio.
    3. Adicione 5 µ l de anti-CD14-PE e Hoechst 33342 em uma concentração final de 2 µM para cada alíquota. Misturar e incubar a 37 ° C por 10 min.
    4. Centrifugue a alíquota a 400 x g durante 30 s.
    5. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 200 µ l de buffer de fluxo.
11. Para o recrutamento de subpopulações de monócitos sob fluxo:
    1. Isole os monócitos com um kit de isolamento de monócitos pan de acordo com as instruções do fabricante.
       Nota: O seguinte protocolo de isolamento é de 50 x 10⁶ células. Pode ser escalado acima ou para baixo, enquanto está dentro as recomendações do fabricante.
    2. Centrifugar a suspensão de PBMC 200 x g em temperatura ambiente por 5 min.
    3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 400 µ l de tampão de coloração.
    4. Adicione 50 µ l de reagente de bloqueio de receptores Fc e 50 µ l de anticorpo Pan monócito cocktail.
    5. Incube a temperatura ambiente por 10 min.
    6. Adicione 400 µ l de tampão e 100 µ l de conjugado anticorpo de antimagnético biotina grânulos de coloração. Incube a temperatura ambiente por 15 min.
    7. Adicionar 2 mL de tampão de coloração e usar uma coluna de MACS LS juntamente com um ímã.
    8. Coloque a coluna é sobre o ímã e adicionar 1 mL de tampão de coloração. Descarte o escoamento.
    9. Passar a suspensão PBMC na coluna e coletar o fluxo desobstruído, embora contendo os monócitos pan em um novo tubo de 15 mL.
    10. Adicione o buffer de coloração para cima até 5 mL.
    11. Tomar uma alíquota e verificar a qualidade do isolamento de monócitos com um citômetro de fluxo.
    12. Determine a contagem de monócitos do pan.
        Nota: População de monócitos só pode ser observada (figura 1B).
    13. Centrifugue o restante de monócitos da etapa 5.11.11 a 200 x g por 5 min.
    14. Desprezar o sobrenadante.
    15. Ressuspender as células em 5 mL de tampão de fluxo (M199 contendo 0,5% BSA).
    16. Repeti 5.11.13 para 5.11.14 duas vezes para eliminar qualquer vestígio de EDTA.
12. Fazer suspensão de monócitos no fluxo de buffer (M199 com 0,5% BSA) em 6 x 10⁶ células/mL.
13. Fazer alíquotas de 200 µ l de monócitos para cada ensaio de recrutamento.
14. Manter a alíquota em 37 ° C na incubadora até 20 minutos antes da injeção.
15. Adicione 5 µ l de anticorpo anti-CD16-PE e Hoechst 33342 (final de 2 µM) para cada alíquota.
16. Misturar e incubar a 37 ° C por 10 min.
17. Centrifugue a alíquota a 400 x g durante 30 s.
18. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 250 µ l de buffer de fluxo.
19. Adicione 30 µ l de suspensão de monócitos em uma câmara do slide para servir para definir os parâmetros de aquisição em microscópio confocal.
20. Manter as alíquotas de suspensão de monócitos da etapa 5.18 a 37 ° C.
    Nota: Esta suspensão está pronta para ser injetado no sistema de fluxo.

6. preparação do sistema fluídico

1. Assegurar que a incubadora de célula para a imagem, defina a 37 ° C.
   Nota: Um diagrama do sistema de fluxo é mostrado na Figura 2.
2. Montar a parte de tubulação i: inserir um macho do conector Luer para uma extremidade de um pedaço de tubo de silicone (8 cm comprimento e 3 mm de espessura) e ligue a outra extremidade a um conjunto de injeção de Luer em linha. Conecte o conector Luer este último para um pedaço de tubo de silicone (40 cm e 3 mm de espessura) em uma extremidade.
   Nota: Opcionalmente, uma torneira de 3 vias, conectada a uma seringa de 5 mL pode ser inserida entre o conjunto de injeção de Luer em linha e o silicone tubulação para remoção de bolha de ar eventual.
3. Montar a parte do tubo II: conectar uma extremidade de um comprimento de tubo de silicone (1 m de comprimento e 3 mm de espessura) com uma seringa de 20 mL. Inserir um macho do conector Luer para a outra extremidade do tubo.
4. Conectar parte I e parte de tubulação II, inserindo os machos de conector Luer para um acoplador de trava Luer fêmea (Figura 2A).
5. Colocar a extremidade livre do tubo de silicone no reservatório contendo o buffer de fluxo (M199 + 0,5% BSA) aquecido a 37 ° C.
6. Puxe o êmbolo da seringa de 20 mL para encher o tubo com buffer de fluxo.
7. Coloque a seringa na bomba e fixá-lo.
8. Conjunto da bomba em retirar o modo (em oposição para infundir) e especificar a taxa de fluxo.
9. Determine a taxa de fluxo de acordo com o slide IBIDI usado, usando a seguinte fórmula:
   
   Nota: O fator de slide é dependente o slide IBIDI usado para o experimento. Para o µ-slide eu^0.4 Luer-lock usada neste exemplo, o fator de slide é 131,6. Para fatores de slide específico, consulte o site de empresa¹⁴. A viscosidade de buffer de fluxo é 0.0072 dyn.s/cm². Tensão de cisalhamento nas vênulas pós-capilares é cerca de 0.5 dyn/cm².
10. Conecte o slide (Figura 2B):
    1. Prenda o tubo de silicone ao redor o acoplador-fêmea Luer Lock e desconecte os dois machos de conector Luer o acoplador.
    2. Conectá-los para os reservatórios do slide contendo estimulada HUVEC e encha-o com o meio. Evite bolhas de ar durante esta etapa.
    3. Tire os grampos e certifique-se de que a conexão não está vazando.
11. Coloque a lâmina ao microscópio para a imagem latente de lapso de tempo e comece a bomba.

7. imagem lapso de tempo de recrutamento de monócitos sob fluxo por microscopia Confocal

1. Use um objectivo de 40x (ver Tabela de materiais) para a imagem latente.
2. Ativar a 405 nm (núcleo de monócitos azul) 488 nm (células endoteliais verdes) e 561 lasers de nm (subconjunto CD16 + vermelho).
3. Use a câmara que contém os monócitos para definir os parâmetros de aquisição.
   Nota: Para detectar tanto não-transmigra e transmigra monócitos, a pinhole e intensidade de laser 405 nm são definidas altas. Assim, não transmigra os monócitos são ligeiramente visíveis no plano basal. Entretanto somente transmigra monócitos apresentam uma área imaculada ao redor do núcleo correspondente para o novo espaço ocupado por baixo de células endoteliais.
4. Coloque a câmara para ser adquirida sob o microscópio.
5. Escolha 3 campos de pontos de vista num raio de 1 cm para a imagem latente confocal multi-posição.
6. Definir o basal e os lados apicais das células endoteliais
7. Defina um z-pilha ao intervalo 10 – 12 µm (passo de 0,5 µm). Execute uma aquisição de lapso de tempo cada 1 min.
8. Após 3 min da imagem latente, injete 200 µ l de suspensão de monócitos (6 x 10⁶ células/mL) através do orifício de injecção de Luer em linha.
   Nota: Rapidamente os monócitos aparecem no plano focal apical, aderir e começar a transmigração (trânsito do apical ao plano basal).
9. Imagem pelo menos 30 min. Uma vez terminado, parar a imagem e parar o fluxo. Fixe o tubo para desconectá-los a partir do slide.
10. Fixe o slide com paraformaldeído 4%, a 4 ° C por 10 min.
11. Lave o slide com PBS e armazenar o slide a 4 ° C para posterior análise, se necessário.

8. analisar os dados com ImageJ

1. Conte o número de monócitos aderentes totais em cada campo. Determine a contagem de células por mm².
2. Contagem de monócitos transmigra que estão presentes no plano basal por baixo de células endoteliais e identificados pela presença de um buraco negro (no canal verde) ao redor do núcleo.
3. Divida a contagem de leucócitos transmigra pelo número total de leucócitos aderentes. A taxa de transmigração é apresentada como uma porcentagem de monócitos aderentes.
4. Para ilustração, o apical e basais laterais podem ser mostradas simultaneamente para ilustrar os eventos que ocorrem em cada um desses compartimentos endoteliais.

Resultados

Determinando o estado de ativação HUVEC induzida por TNFa

A bio-atividade das citocinas inflamatórias TNFa pode ser variam de acordo com o lote e o repletion do ciclo de congelamento-descongelamento. É importante verificar o status de ativação de HUVEC com tratamento de TNFa. Isso poderia ser realizada pela coloração em paralelo algumas amostras de HUVEC confluente para a indução inflamatória de selectinas, ICAM-1 e VCAM-1

Discussão

Aqui, nós relatamos um método detalhando um estudo de como subpopulações de monócitos transmigrar através da monocamada endotelial inflamada. O método discutido usado microscopia confocal em vez de microscopia de contraste de fase, que também é usada para estudar o recrutamento de monócitos sob fluxo de^11,3,19. Uma das principais vantagens do uso de microscopia confocal para a imagem latente de lapso de tempo é a capacidade de d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos de cultura de tecidos 75 cm2	TPP	90076	Cultura de rotina de HUVEC&
micro;-Slide VI isolado 0,4	IBIDI	80606
Tubos de centrífuga 15 mL	TPP	191015
Tubos de centrífuga 50 mL	TPP	191050
Colágeno G	Biochrom	L 7213	Para revestimento de cultura de células frascos
de gelatina	Sigma-Aldrich	1393	Para revestimento de frascos de cultura de células
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (sem MgCl2 e CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (com MgCl2 e CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662
RPMI-1640 Médio	Sigma-Aldrich	R8758
torneiras de 3 vias	BIO-RAD	7328103
penicilina 10.000 μ/mL estreptomicina 10.000 μ g/mL fungizone 25 μ/mL	AMIMED	4-02F00-H
Colagenase tipo 1	Worthington	LS004216
Medium 199 1x avec Sais de Earle, L-Glutamina, 25 mM Hepes	GIBCO	22340020
Fração de Albumina Bovina V	ThermoFisher	15260037
Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais, 150 mg	Millipore	02-102
Heparina sódica	Sigma-Aldrich	H3149RT
hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H6909
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich	A 4544
EDTA sal dissódico di-hidratado C10H14N2Na2O8 · 2H2O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), clone recombinante humano: REA199, FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
anticorpo CD31-PE, clone recombinante humano: REA730, PE	Miltenyi Biotech	130-110-807	AB_2657280
Anti-Podoplanina-APC, clone recombinante humano: REA446, APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína)	ThermoFisher	C2925
TNF humano recombinante e alfa;	Peprotech	300-01A
Peprotech	100-20
NE-1000	KF Technology	NE-1000
Ficoll  Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
CD14-PE anti-humano, clone recombinante humano: REA599, PE	Miltenyi Biotech	130-110-519	AB_2655051
Kit de isolamento de monócitos Pan, humano	Miltenyi Biotech	130-096-537
CD16-PE anti-humano, clone recombinante humano: REA423, PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
colunas LS	Miltenyi Biotech	130-042-401
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342, Tricloridrato, Trihidrato	ThermoFisher	H1399
Tubo de silicone	IBIDI	10841
Cotovelo Luer Conector	IBIDI	10802
Fêmea Luer Lock Acoplador	IBIDI	10823
Conector Luer Lock Fêmea	IBIDI	10825
In-line Luer Injection Port	IBIDI	10820
Ar1 microscópio confocal	Nikon
40x objetiva	Nikon	40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correção 0-2mm
ImageJ Software	NIH