Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

Patricia Ropraz; Beat A. Imhof; Thomas Matthes; Bernhard Wehrle-Haller; Adama Sidibé

doi:10.3791/58509

Artigo de método

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

DOI:

10.3791/58509

⸱

26 de novembro de 2018

Patricia Ropraz¹ , Beat A. Imhof² , Thomas Matthes¹ , Bernhard Wehrle-Haller³ , Adama Sidibé³

¹Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, ²Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, ³Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.

Resumo

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O recrutamento de monócitos do sangue para os tecidos periféricos alvo é fundamental para o processo inflamatório durante a lesão tecidual, desenvolvimento de tumor e doenças auto-imunes. Isto é facilitado através de um processo de captura de fluxo livre para a superfície luminal das células endoteliais ativadas, seguido de sua migração de adesão e transendothelial (transmigração) no tecido afetado subjacente. No entanto, os mecanismos que suportam o recrutamento preferencial e contexto-dependente de subpopulações de monócitos são ainda não são totalmente conhecidos. Portanto, nós desenvolvemos um método que permite o recrutamento de subpopulações diferentes monócitos para ser visualizado e medido sob fluxo simultaneamente. Este método, baseado na imagem latente confocal lapso de tempo, permite a distinção inequívoca entre monócitos aderentes e transmigra. Aqui, descrevemos como esse método pode ser usado para estudar simultaneamente a cascata de recrutamento de monócitos pro-angiogênico e não-angiogênico in-vitro. Além disso, este método pode ser estendido para estudar as diversas etapas do recrutamento de até três populações de monócitos.

Introdução

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Os monócitos constituem um componente fagocítica da imunidade inata que é essencial para o combate de patógenos, limpeza de tecidos danificados, angiogênese e a fisiopatologia de muitas doenças, incluindo câncer,¹^,²^,³. Os monócitos são células derivadas da medula óssea, compostas de subpopulações heterogêneas que circulam no sangue, mas podem ser recrutadas para o local da inflamação no tecido periférico, através de mecanismos moleculares específicos. As cascatas de recrutamento de monócitos, quanto aos leucócitos em geral, implica diferentes etapas, incluindo captura, rolan....

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Protocolo

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Materiais humanos foram usados com o consentimento dos doadores voluntários e de acordo com os suíços comités de ética em pesquisa clínica.

1. isolamento e congelamento do Cordão Umbilical humano veia células endoteliais (HUVEC)

Adicione 5 mL da solução de revestimento para um balão de T75 (0,1 mg/mL colágeno G e gelatina de 0,2% em tampão fosfato salino PBS pH 7,4) por 30 min a 37 ° C antes de iniciar o isolamento HUVEC.
Limpe o cabo com PBS, limpe-a com compressas estéreis e colocá-lo em uma estéril 20 cm placa de Petri. Corte as extremidades do cabo com uma tesoura esterilizada.
Identifica a única grande vei....

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Resultados

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Determinando o estado de ativação HUVEC induzida por TNFa

A bio-atividade das citocinas inflamatórias TNFa pode ser variam de acordo com o lote e o repletion do ciclo de congelamento-descongelamento. É importante verificar o status de ativação de HUVEC com tratamento de TNFa. Isso poderia ser realizada pela coloração em paralelo algumas amostras de HUVEC confluente para a indução inflamatória de selectinas, ICAM-1 e VCAM-1

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Discussão

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Aqui, nós relatamos um método detalhando um estudo de como subpopulações de monócitos transmigrar através da monocamada endotelial inflamada. O método discutido usado microscopia confocal em vez de microscopia de contraste de fase, que também é usada para estudar o recrutamento de monócitos sob fluxo de¹¹^,³^,¹⁹. Uma das principais vantagens do uso de microscopia confocal para a imagem latente de lapso de tempo é a capacidade de d.......

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Divulgações

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Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos o Dr. Paul Bradfield para manuscrito lendo e feedbacks. A.s. recebeu apoio financeiro do senhor Jules Thorn caridade ultramarinos Trust reg.,

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos de cultura de tecidos 75 cm²	TPP	90076	Cultura de rotina de HUVEC&
micro;-Slide VI isolado 0,4	IBIDI	80606
Tubos de centrífuga 15 mL	TPP	191015
Tubos de centrífuga 50 mL	TPP	191050
Colágeno G	Biochrom	L 7213	Para revestimento de cultura de células frascos
de gelatina	Sigma-Aldrich	1393	Para revestimento de frascos de cultura de células
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (sem MgCl₂ e CaCl₂)	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (com MgCl₂ e CaCl₂)	Sigma-Aldrich	D8662
RPMI-1640 Médio	Sigma-Aldrich	R8758
torneiras de 3 vias	BIO-RAD	7328103
penicilina 10.000 μ/mL estreptomicina 10.000 μ g/mL fungizone 25 μ/mL	AMIMED	4-02F00-H
Colagenase tipo 1	Worthington	LS004216
Medium 199 1x avec Sais de Earle, L-Glutamina, 25 mM Hepes	GIBCO	22340020
Fração de Albumina Bovina V	ThermoFisher	15260037
Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais, 150 mg	Millipore	02-102
Heparina sódica	Sigma-Aldrich	H3149RT
hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H6909
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich	A 4544
EDTA sal dissódico di-hidratado C10H14N2Na2O8 · 2H₂O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), clone recombinante humano: REA199, FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
anticorpo CD31-PE, clone recombinante humano: REA730, PE	Miltenyi Biotech	130-110-807	AB_2657280
Anti-Podoplanina-APC, clone recombinante humano: REA446, APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína)	ThermoFisher	C2925
TNF humano recombinante e alfa;	Peprotech	300-01A
Peprotech	100-20
NE-1000	KF Technology	NE-1000
Ficoll Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
CD14-PE anti-humano, clone recombinante humano: REA599, PE	Miltenyi Biotech	130-110-519	AB_2655051
Kit de isolamento de monócitos Pan, humano	Miltenyi Biotech	130-096-537
CD16-PE anti-humano, clone recombinante humano: REA423, PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
colunas LS	Miltenyi Biotech	130-042-401
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342, Tricloridrato, Trihidrato	ThermoFisher	H1399
Tubo de silicone	IBIDI	10841
Cotovelo Luer Conector	IBIDI	10802
Fêmea Luer Lock Acoplador	IBIDI	10823
Conector Luer Lock Fêmea	IBIDI	10825
In-line Luer Injection Port	IBIDI	10820
Ar1 microscópio confocal	Nikon
40x objetiva	Nikon	40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correção 0-2mm
ImageJ Software	NIH

Bomba de Seringa Programável Recombinante humana

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L.

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Monocyte Recruitment Flow Cytometry Confocal Microscopy HUVEC Stimulation Monocyte Isolation Transendothelial Migration Time Lapse Imaging CD16 Antibody TNF Alpha VEGFA Stimulation

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

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