Artigo de método

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

DOI:

10.3791/58528

⸱

27 de novembro de 2019

 , 
1Department of Clinical Sciences, Division of Infection Medicine, Lund University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.

Resumo

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As armadilhas extracelulares neutrófilas (NETs) são estruturas antimicrobianas semelhantes à teia, consistindo de proteínas antimicrobianas derivadas de DNA e grânulo. A microscopia de imunofluorescência e os métodos de quantificação à base de imagem continuam a ser ferramentas importantes para quantitar a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos. No entanto, existem limitações fundamentais para os métodos baseados em imunofluorescência que estão atualmente disponíveis para quantificar NETs. Métodos manuais de quantificação NET baseada em imagem são muitas vezes subjetivos, propensos a erros e tediosos para os usuários, especialmente usuários não experientes. Além disso, as opções de software atualmente disponíveis para quantificação são semi-automáticas ou exigem treinamento antes da operação. Aqui, demonstramos a implementação de um método automatizado de quantificação de imagem baseado em imunofluorescência para avaliar a formação NET chamada NETQUANT. O software é fácil de usar e tem uma interface gráfica de usuário (GUI) amigável ao usuário. Considera parâmetros biologicamente relevantes, como um aumento na área de superfície e dna:net marcador proteína razão, e deformação nuclear para definir a formação NET. Além disso, esta ferramenta é construída como um aplicativo disponível gratuitamente e permite a quantificação e análise de resolução de células únicas.

Introdução

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Neutrófilos são mediadores cruciais de respostas inatas de defesa do hospedeiro contra uma grande variedade de patógenos microbianos1. Eles executam suas funções antimicrobianas liberando seus grânulos contendo uma grande variedade de proteínas antimicrobianas2,produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS) e hipoclorite1,e através da fagocitose3. Além disso, Brinkmann et al. 4 descreveram armadilhas extracelulares neutantes (NETs) como um novo mecanismo pelo qual os neutrófilos prendem e eliminam patógenos invasores. Desde a sua descoberta ....

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Protocolo

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O comitê de ética da Universidade de Lund aprovou a coleta de sangue venoso de voluntários saudáveis de acordo com a Declaração de Helsínquia (2013/728). Todos os voluntários forneceram seu consentimento informado por escrito.

1. Isolamento de neutrófilos de sangue periféricos usando centrífugação de densidade-gradiente

  1. Coletar sangue venoso humano em tubos contendo heparina e permitir que os tubos para atingir a temperatura ambiente.
    Nota: Um mínimo de 16 mL de sangue de um doador saudável é necessário para produzir uma pelota de célulasuficientemente grande.
  2. Misture o sangue com um volume de 2% dextran em saline (0,....

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Resultados

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5 x 105 neutrophils/mL foram semeados em coverslips colocados em uma placa de 12 poços e estimulados com 20 nM PMA ou deixados sem estímulo por 150 min. As amostras foram então manchadas usando anticorpos primários de nêutrons anti-humanos de coelho, anticorpos conjugados de fluorofiforas anticoelho de cabra secundário e DAPI - um corante fluorescente rotulado que mancha DNA (Veja a Tabela de Materiais para obter detalhes). Um mínimo de 5 imagens foram então ad.......

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Discussão

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A formação NET é uma adição relativamente recente ao diverso armamentarium neutrófilo4 e tem havido uma onda notável de interesse para estudar a implicação de NETs em uma ampla gama de áreas de pesquisa5,7,14,15. A aquisição de imagens usando microscopia de imunofluorescência e quantificação subsequente baseada em imagem é um método amplamente utilizado para quantificar .......

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Divulgações

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TM e PN têm uma patente pendente relacionada aos algoritmos utilizados na NETQUANT.

Agradecimentos

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O trabalho foi financiado pela Fundação Crafoord (TM e PN), concessão de Pesquisa do Governo Sueco (PN, TM), conselho de pesquisa sueco (PN) e Groschinsky Foundation (TM, PN).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BD Vacutainer Tubos de plástico heparinizadoBD Biosciences367885
LymphoprepAxis-Shield114547
RPMI-1640 com L-GlutaminaGibco11835-030
Balões cônicos de 50mLSarstedt62.547.004
Frascos cônicos de 15mLSarstedt62.554.002
Tecido de 12 poços placas de culturaFalcon10626491
#1 Lamínulas 10mmMenzel GlaserCS10100
Lâminas de vidroMenzel Glaser631-0098
Elastase primária anti-humanaDAKODAKO coelho 1373, contrair imunização
Fluoróforo secundário conjugado cabra anti-coelhoTecnologias de vidaA-11072, A-11070
PROLONG-Gold Reagente antifade com DAPILife technologiesP36930Meio de montagem
Soro de cabraSigma-AldrichG9023
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma-Aldrich79346
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Nikon Ti-E Microscópio de epifluorescênciaNikon
Câmera CCDAndor Zyla
Plano Apocromático 20x, 40xobjetivas Nikon
Windows 10operacionalMicrosoft
macOS Sierra 10.12operacionalApple
MATLABMathworks
Sistema Sistema

Referências

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  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
  3. Nordenfelt, P., Tapper, H.

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