Aqui nós apresentamos um método para isolar as glândulas adrenal de ratos, corrigir os tecidos, seção-los e executar a mancha da imunofluorescência.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse
Neste artigo
Resumo
Resumo
Imunofluorescência é uma técnica bem estabelecida para a detecção de antígenos nos tecidos com o emprego de anticorpos conjugados a fluorocromo e tem um amplo espectro de aplicações. Deteção de antígenos permite a caracterização e identificação de vários tipos de células. Situada acima dos rins e encapsulado por uma camada de células mesenquimais, a glândula adrenal é um órgão endócrino, composto por dois tecidos diferentes, com diferentes origens embriológicos, o córtex exterior derivados mesoderme intermediário mesonéfricos e o neural crista-derivado de medula interna. O córtex adrenal secreta esteroides (ou seja, mineralocorticoides, glicocorticoides, hormônios sexuais), enquanto a medula adrenal produz catecolaminas (i.e., adrenalina, noradrenalina). Durante a realização de pesquisa de adrenal, é importante ser capaz de distinguir células únicas com funções diferentes. Aqui nós fornecemos um protocolo desenvolvido em nosso laboratório que descreve uma série de etapas sequenciais, necessários para a obtenção de mancha da imunofluorescência para caracterizar os tipos de células da glândula adrenal. Nós focamos primeiro a dissecação das glândulas supra-renais do mouse, a remoção microscópica de gordura periadrenal, seguida da fixação, processamento e incorporação de parafina do tecido. Descrevemos em seguida com um micrótomo rotativo de corte dos blocos de tecido. Por último, detalhamos um protocolo para coloração imunofluorescente de glândulas supra-renais que temos desenvolvido para minimizar tanto a ligação de anticorpos inespecíficos e autofluorescência para alcançar uma óptima do sinal.
Introdução
Imuno-histoquímica é uma técnica para a detecção de componentes de tecido com o uso de anticorpos contra moléculas celulares específicas e técnicas de coloração subsequentes para detectar os anticorpos conjugados1. Este procedimento de imuno-histoquímica requer fixação específica e processamento de tecidos que são frequentemente empiricamente determinados para o antígeno específico, tecido e anticorpo utilizaram2. A fixação é crucial para preservar o estado "original" de tecido e, mantendo intacta celular e subcellular estruturas e padrões de expressão. Mais processamento e incorporação de procedimentos são necessários p....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os métodos foram realizados em conformidade com protocolos institucionalmente aprovados sob o auspício da Comissão Universidade do uso e cuidar dos animais da Universidade de Michigan.
1. preparação para a cirurgia
- No dia antes da cirurgia, preparar paraformaldeído 4% (PFA) / tampão fosfato salino (PBS). No caso de alíquotas congeladas, prossiga para descongelar um e armazenar a 4 ° C.
Nota: 4% PFA não é estável por mais de 48 h.
Cuidado: PFA é tóxico, evitar contato com pele e olhos e descarte em um recipiente apropriado. - No dia da cirurgia, preparar os instrumentos cirúrgicos por esterilizar a tesoura e pin....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A Figura 1 representa um diagrama esquemático do todo protocolo descrito acima. As glândulas adrenais são colhidas de ratos, tecido adiposo adjacente é removido sob um microscópio de dissecação e a adrenal são então fixado em 4% PFA. Após esta etapa, supra-renais são processadas incorporadas em parafina e seccionadas com um micrótomo para corte o órgão em fatias finas depositadas em corrediças do microscópio. Após a secagem das seções, imunofluorescência é ef.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo descreve um método para o isolamento de rato glândulas supra-renais juntamente com a preparação e coloração de glândulas supra-renais secionado rato de parafina.
Em comparação com outros protocolos que testamos, este protocolo de imunofluorescência revelou-se adequado para a maioria dos anticorpos utilizados em nosso laboratório. No entanto, em certos casos pode exigir alguns ajustes para melhorar os resultados da coloração. Uma variável que pode ser facilmente modificada e test.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Mohamad Zubair por suas sugestões úteis e assistência técnica no estabelecimento do presente protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e digestivo e doenças renais, institutos nacionais de saúde Research Grant 2R01-DK062027 (de Games).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de células de 24 poços | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Agulhas descartáveis 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldeído (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Parafina para incorporação de tecidos |
| de biópsia Shandon II com tampa anexada | de 1001097 | Thermo scientific | para processamento de tecidos |
| Lâminas de micrótomo de alto perfil | Accu-Edge | 4685 | Lâminas descartáveis de aço inoxidável |
| Moldes de incorporação de tecido plástico descartável Peel-a-way | Polysciences Inc. | 18986 | Lâminas de microscópio Superfrost Plus truncadas, 22 mm quadradas no topo afilado para 12 mm |
| Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| Etanol de 200 provas | Decon Labs, Inc. | ||
| Almofadas de gaze Certi-Pad | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3" x 3. Almofadas de gaze sem látex estéril |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | Para detectar anticorpos primários de camundongo em tecido de camundongo |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Toalhetes 4.4 polegadas x 8.4 polegadas |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Caneta para desenhar em lâminas |
| Tampa de vidro do microscópio | Fisherbrand | 12-544-D | Tamanho: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Preparado em estoque de 20 mg / mL) |
| ProLong Gold antifade reagente | Molecular Probes | P36930 | Agente de montagem para imunofluorescência |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Fonte de luz | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Microscópio Nikon | ||
| micrótomo | American Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Processador de tecidos | Leica | ASP300S | |
| Soro de cabra normal | Sigma | G9023 | |
| Camundongo anti-TH | Millipore | MAB318 | Anticorpo primário |
| Coelho anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | anticorpo | primário |
| Alexa-488 IgG de camundongo | ImmunoResearch | 115-545-003 | Anticorpo secundário |
| Dylight-549 Coelho IgG cabra criada | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Anticorpo secundário |
| Citrato ácido anidro | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Software Nikon | para imagem |
Referências
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
