Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

قياس تفاعلات البروتينات كروي والخيطية مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58537
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Alberta

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج وتنقية البروتينات المسماة بالنظائر، وتوصيف اللاحقة لتفاعلات البروتين البروتين باستخدام مطيافية "الرنين المغناطيسي النووي" (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة تجارب ثيرموفوريسيس (MST).

Abstract

توفير البروتينات الخيطية مثل فيمنتين يكرر المنظمة داخل الخلايا بتوفير سقالة هيكلية مع المواقع التي تربط بين البروتينات التي تحتوي على بلكين. هنا، هو وصف بروتوكول لكشف وقياس هذه التفاعلات باستخدام المجال تكرار بلكين كروي من انفوبلاكين ولفائف حلزونية من فيمنتين. وهذا يوفر أساسا لتحديد ما إذا كان بروتين يربط فيمنتين (أو البروتينات الخيطية مماثلة) وقياس تقارب التفاعل. بروتين كروي للاهتمام هو المسمى مع 15ن ومعاير مع البروتين فيمنتين في الحل. ويكتسب طيف الرنين النووي المغناطيسي ثنائية الأبعاد للكشف عن التفاعلات بمراقبة التغييرات في شكل الذروة أو التحولات الكيميائية، وتوضيح آثار شروط الحل، بما في ذلك مستويات الملح، والتي تؤثر على هيكل رباعي فيمنتين. إذا كان بروتين المصالح تربط يجند الخيطية، هو كمياً التفاعل ملزم باستخدام البروتينات المنقاة MST. هذا النهج طريقة مباشرة لتحديد ما إذا كان بروتين لمصلحة تربط خيوط، وتقييم كيفية تأثير التعديلات، مثل الطفرات أو شروط الحل، على التفاعل.

Introduction

التفاعلات بين البروتينات السماح بتشكيل الأجهزة الجزيئية التي إنشاء النظام داخل الخلايا. التفاعلات الفردية غالباً ما تكون ضعيفة ولكن عادة ما تسهم في مجمعات متعددي يمكن أن التعاونية وتنظيمها بشكل حيوي. فحوصات الحساسة التي توفر القرار الذري والمعلومات الكمية عن هذه التفاعلات المعقدة ضرورية للاستدلال على آليات وتصميم التدخلات مثل جزيئات شبيهة بالمخدرات. مطيافية الرنين المغناطيسي النووي هو وسيلة فعالة للحصول على هذه المعلومات حول تفاعلات البروتين، ويستخدم أيضا لفحص سريع يغاندس بما في ذلك تلك التي تربط ضعيف1. ويمكن تصنيف الرنين المغناطيسي الأساليب المستخدمة في تلك التي هي مراقبة البروتين أو يجند مراقبة. ويستخدم هذه المخطوطة النهج السابق الذي يتم الحصول على طائفة من أحد نظائر مستقرة المسمى بروتين صغيرة نسبيا (عادة تحت كاتشين 20) ويجند غير مسمى هو معاير. وهذا يسمح بقايا المسمى تشارك في التفاعل ليتم تعيينها في حالات إيجابية. مرة النماذج المعقدة، هناك تغييرات في البيئات الكيميائية لبقايا المتفاعلة التي تعبر عن نفسها كالتغيرات في التحول الكيميائي والشكل إشاراتها الرنين المغناطيسي النووي. يرتبط مدى هذه التغيرات بدرجة مشاركة هذه المجموعات في التفاعل. ويمكن قياس الاضطرابات التحول الكيميائي (Csp) بمقارنة سلسلة من أطياف الرنين المغناطيسي من البروتين التي تم جمعها في غياب ووجود كميات متفاوتة من يجند. يغاندس أكبر أو التفاعلات المعقدة، يمكن قياس التغيير في شكل الذروة أو كثافة للاستدلال على التفاعلات.

التجربة 2D الأكثر شيوعاً المستخدمة للكشف عن التفاعلات يجند هو تجربة الارتباط (هسقك) الكم واحد 15N-هيتيرونوكلير2. وهذا يتطلب أن بروتين واحد موحد يكون المسمى مع 15ن، الذي يتحقق عادة بالإعراب لهم كإصدارات معلم تقارب الثقافات البكتيرية كولاي تزرع في 15ن إثراء وسائل الإعلام. الربط الواضح عندما يتم فرضه الأطياف هسقك التي تم جمعها أثناء المعايرة، الكشف عن التغييرات الذروة لمجموعة فرعية مخلفات تشارك في تشكيل معقدة. يمكن أن يحدث التفاعل في نظام الصرف السريع حيث طي إشارات الدولة الحرة ويجند المشبعة إلى أحد السكان بلغ الذروة. بدلاً من ذلك، في حالة بطء تبادل بين الدول، تراعي كل الإشارات مع التكاملات التي تمثل تلك المبالغ النسبية. بينما يمكن استخدام التحليل لينيشابي الرنين المغناطيسي لتقدير الصلات ملزمة في بعض الحالات، أساليب مثل MST أثبتت أيضا مريحة وتوفر المصادقة عبر تفاعلات حقيقية.

المثال المقدم من اثنين من البروتينات وجدت داخل desmosomes. أنهم التوسط الوصلات بين سطوح الخلايا وسيتوسكيليتون والتوسط متعددي التفاعلات بين آلات التصاق الخلايا وخيوط متوسطة الحفاظ على سلامة الجلد وأنسجة القلب وتحمل من القص القوات. يمكن أن تؤدي الأمراض عندما تجدان البروتينات ديسموسومال مثل ديسموبلاكين أو فيمنتين بالطفرات أو الأجسام المضادة، مما يؤدي إلى زعزعة الاستقرار من تقاطعات خلية خلية، وبالتالي تفاعلاتها من الأهمية البالغة3. يمكن وصف الأساس الهيكلي ليجند ملزم بالبروتينات ديسموسومال مطيافية الرنين المغناطيسي النووي، بينما يمكن قياسها كمياً التفاعلات التي MST. واستخدمت أساليب هنا لوصف التفاعلات بين المجالات بلكين تكرار (المكتب) التي غالباً ما تكون موجودة كمجموعات جنبا إلى جنب التي تقدم الأخاديد الأساسية، وفيمنتين، خيوط وسيطة التي تتفاعل من خلال سطح حمضية تقدمها لها حلزونية حزمة4. وتتشكل هذه المجمعات في غشاء الخلية حيث أنها مرساة خيوط متوسطة من سيتوسكيليتون الخلية إلى desmosomes التي تتصل بالخلايا المجاورة، مما يشكل شبكة سندات التصاق الذي يشع في جميع أنحاء أنسجة.

Protocol

1-المؤتلف البروتين التعبير

  1. التعبير عن الحزب الثوري الدومينيكاني انفوبلاكين (E-دلتا نهر اللؤلؤ) و 99 فيمنتين-249 (فيمرود)
    1. تحويل الخلايا BL21(DE3) كولاي مع بلازميد المحتوية على الجين المطلوب. انتشار الخلايا على لوحات أجار تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. اختيار مستعمرة واحدة وتلقيح 20 مل مرق رائع (السل) التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين لتحديد بلازميد. تنمو ثقافة عند 37 درجة مئوية مع الهز (180 لفة في الدقيقة) بين عشية وضحاها.
    3. نقل ثقافة كاملة 20 مل إلى 1 لتر السل الذي يحتوي على 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. احتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية مع الهز 180 لفة في الدقيقة حتى OD600 = 0.6-0.8.
    4. خفض درجة الحرارة إلى 18 درجة مئوية وحمل التعبير البروتين بإضافة الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) بتركيز نهائي من 1 مم. تستمر الحضانة عند 18 درجة مئوية مع الهز 160 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها السماح بالتعبير البروتين.
    5. حصاد الخلايا من سينتريفوجينج الثقافة في 8,000 س ز على 15 دقيقة صب وتجاهل المادة طافية.
    6. أغسل الخلايا المقطوع من ريسوسبيندينج بيليه الخلية في حوالي 40 مل فوسفات مخزنة المحلول الملحي (برنامج تلفزيوني: العازلة فوسفات عيار 20 ملم، ودرجة الحموضة 7.4، 120 مم كلوريد الصوديوم). نقل استثارة لأنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 8,000 س ز لمدة 15 دقيقة.
    7. صب وتجاهل المادة طافية. أما فورا تبدأ البروتوكول تنقية أو تجميد الكريات الخلية في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  2. التعبير عن البروتين المسمى نظير
    1. تحويل الخلايا BL21(DE3) كولاي وإعداد ثقافة كاتب مل 20 كما هو الحال في 1.1.1-1.1.2.
    2. نقل ثقافة كاملة 20 مل للأم 1 تيرابايت المخصب الذي يحتوي على تريبتوني ز 4.0 إضافية و g 5.0 كلوريد الصوديوم و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. احتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية مع الهز 160 لفة في الدقيقة حتى OD600 = 1.6-1.9.
    3. حصاد الثقافة 1 لتر بالطرد المركزي في 8000 x ز عن 15 دقيقة صب وتجاهل المادة طافية.
    4. أغسل بيليه الخلية التي ريسوسبيندينج برفق في حوالي 40 مل من برنامج تلفزيوني ونقل استثارة لأنبوب 50 مل.
    5. الطرد المركزي مرة أخرى في 8,000 س ز على 15 دقيقة صب وتجاهل المادة طافية.
    6. ريسوسبيند بيليه الخلية في 20 مل M9 الحد الأدنى من وسائل الإعلام (الجدول 1) ونقل إلى ما تبقى من 950 مل M9 الحد الأدنى الوسائط التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
    7. إضافة 50 مل مزيج فلتر تعقيم المواد الغذائية (الجدولان 2 و 3).
    8. التأقلم الثقافة إلى 18 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل إضافة إيبتج إلى تركيز نهائي من 1 مم.
    9. تبني بين عشية وضحاها في 18 درجة مئوية مع الهز 160 لفة في الدقيقة.
    10. حصاد الخلايا كما هو الحال في قسم 1.1.4-1.1.6.

2. تثبيت تنقية اللوني (ايماك) تقارب معدنية فيمرود والإلكترونية-دلتا نهر اللؤلؤ

  1. تنقية لمعلم His6 فيمرود
    1. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل/ز من برنامج تلفزيوني يتضمن حوزتي المانع كوكتيل يدتا تفتقر إلى. تجانسه مع 12 جلدة في الخالطون أنسجة دونسي لتحسين تحلل الخلية في الخطوة التالية.
    2. على الجليد، sonicate تعليق خلية في نبض من 1/1 ق ق قبالة، كرر السعة 80% بما مجموعة 1.5 دقيقة sonication إضافيين مرات، ويحوم بلطف على الجليد بين تشغيلات لمنع الانهاك.
    3. الطرد المركزي العينة في 75,000 س ز عن 45 دقيقة صب وتصفية المادة طافية باستخدام عامل تصفية المحاقن (0.45 ميكرومتر).
    4. حجته عمود ايماك 5 مل مع العمود 5 مجلدات (CV) ربط المخزن المؤقت (20 مم هيبيس، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 ملم) بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة باستخدام نظام بروتين سريعة لوني سائل (فبلك).
    5. تحميل المادة طافية المصفاة على العمود بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة.
    6. أغسل العمود مع المخزن المؤقت 5 "السيرة الذاتية ليغسل" (20 مم حبيس، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 50 ملم) بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة.
    7. الوت البروتين مع 3 السيرة الذاتية شطف المخزن المؤقت (20 مم حبيس، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 350 مم) بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة جمع 1.5 مل الكسور. إذا كانت متوفرة، حدد وضع شطف تدفق أعلى لزيادة تركيز البروتين التيد.
    8. تحديد الكسور من تشروماتوجرام فبلك التي تحتوي على البروتين الاهتمام من جانب الحزب الديمقراطي الصربي صفحة واستخدام الأساليب القياسية لقياس تركيز البروتين5.
    9. تجمع وتركز شطف الكسور التي تحتوي على كميات أعلى من البروتين باستخدام جهاز الطرد مركزي أولترافيلتريشن (كاتشين موكو 3, 5 مل) إلى 2 مل. الطرد المركزي في 21,000 س ز إزالة أي ترسبات وتمريرها من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
    10. حجته 120 مل حجم استبعاد لوني (S) عمود مع السيرة الذاتية S 2 العازلة (20 مم حبيس، 150 مم كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 7.5، 0.5 مم تسيب) بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة باستخدام فبلك.
    11. حقن البروتين مركزة من 2.1.9 على العمود والوت مع المخزن المؤقت السيرة الذاتية S 1 بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة، جمع الكسور 1 مل.
    12. تحديد الكسور التي تحتوي على بروتين الفائدة قبل.
    13. تجمع الكسور التي تحتوي على البروتين مبالغ أعلى.
    14. تخزين في 4 درجات مئوية لاستخدامها على المدى القصير أو إضافة الجلسرين إلى 20% ومخزن في-80 درجة مئوية في مختبرين الصغيرة.
  2. تنقية البروتين ه-دلتا نهر اللؤلؤ مع إزالة العلامة His6
    1. اتبع الخطوات الموجودة في 2.1.1-2.1.8 لتنقية البروتين ه معلم His6-دلتا نهر اللؤلؤ. تجمع الكسور الذروة وتحديد تركيز البروتين.
    2. إضافة التبغ أحفر حوزتي الفيروس (TEV) (1 ملغ/مل) في 2 ميليلتر/ملغ من البروتين المجمعة. نقل للغسيل الكلوي الأنابيب (6 كاتشين) ودياليزي في المخزن المؤقت S بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تسمح هذه الخطوة انقسام علامة His6 وإزالة ايميدازول سوف تتداخل مع الربط إلى الراتنج ني-الإدارة الوطنية للسياحة في الخطوة التالية.
    3. حجته 5 مل راتنج ني-الإدارة الوطنية للسياحة في عمود جاذبية مع المخزن المؤقت للسيرة الذاتية S 3. استنزاف الاحتياطي الزائد من الراتنج.
    4. من أجل البروتين ه-الحزب الثوري الدومينيكاني ملصوق على الراتنج واحتضانها لمدة ساعة واحدة على منصة هزاز للسماح في أونكليفيد معلم His6 ه-دلتا نهر اللؤلؤ والعلامة His6 ملصوق بربط. حوزتي TEV هو أيضا معلم His6 وسيتم ربط الراتنج. التدفق من خلال جمع، والذي يتضمن PRD ه خالية من العلامة. يتم استرداد يغسل الراتنج مع المخزن المؤقت للسيرة الذاتية S 2 لضمان كل من ه-دلتا نهر اللؤلؤ.
    5. تركز ه-دلتا نهر اللؤلؤ في التدفق من خلال إلى 2 مل باستخدام جهاز الطرد مركزي أولترافيلتريشن (كاتشين موكو 3, 5 مل). الطرد المركزي في س 21 000 ز إزالة أي ترسبات وتمريرها من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
    6. حجته عمود 120 مل S مع السيرة الذاتية S 2 العازلة (20 مم حبيس، 150 مم كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 7.5، 0.5 مم تسيب MST أو 20 مم تريس-HCl، 1 مم DTT، الأس الهيدروجيني 7 للرنين المغناطيسي النووي) بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة باستخدام فبلك.
    7. حقن البروتين ه-دلتا نهر اللؤلؤ مركزة من 2.2.5 على العمود والوت مع المخزن المؤقت السيرة الذاتية S 1 بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة، جمع الكسور 1 مل.
    8. تحديد الكسور التي تحتوي على بروتين الفائدة قبل.
    9. تجمع الكسور التي تحتوي على البروتين مبالغ أعلى.
    10. تخزين في 4 درجات مئوية لاستخدامها على المدى القصير أو إضافة الجلسرين إلى 20% ومخزن في-80 درجة مئوية في مختبرين الصغيرة.

3. أساليب الرنين المغناطيسي النووي

  1. إعداد عينة الرنين المغناطيسي النووي
    1. تنقية 15المسمى ن البرية من نوع أو البروتين R1914E ه-دلتا نهر اللؤلؤ كما تم وصفه مسبقاً باستخدام 20 مم تريس-HCl، 1 مم DTT، الأس الهيدروجيني 7 كالمخزن المؤقت S للخطوة 2.2.6. الحلول مخزون البروتين عادة تتراوح بين 0.3 إلى 1 ملم مع وحدات تخزين حوالي 1 مل.
      ملاحظة: يمكن أن تتركز على بروتين > 100 ميكرومتر استخدام 3 موكو كاتشين، وجهاز الطرد المركزي أولترافيلتريشن 5 مل لإحضار التركيز إلى مجموعة مناسبة لإعداد نموذج.
    2. تنقية عينة من غير مسمى فيمرود البروتين باستخدام 20 مم تريس-HCl، 1 مم DTT، الأس الهيدروجيني 7 كالمخزن المؤقت S للخطوة 2.1.10.
    3. في وحدة تخزين نهائي من 500 ميليلتر، إضافة البروتين ه-دلتا نهر اللؤلؤ البرية من نوع أو متحولة إلى تركيز نهائي ل 100µM، أكسيد الديوتريوم (د2س) بتركيز نهائي 10% (v/v)، وإدارة السلامة والأمن (حمض 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic) بتركيز نهائي من 20 ميكرومتر. إحضار حجم عينة تصل إلى 500 ميليلتر استخدام 20 مم تريس-HCl، 1 مم DTT، الأس الهيدروجيني 7. إعداد عينة تمثيلية يرد في الجدول 4.
      ملاحظة: جزء في المليون 0 صدى مفاجآت يستخدم لمعايرة التحولات الكيميائية 1ح كذلك للرجوع إلى غير المباشر لهذه المادة الكيميائية 15ن تحولات البروتين6. د2س يستخدم للإشارة قفل الديوتريوم إبقاء مطياف العاملة في حقل مغناطيسي ثابت صافي.
    4. تشكل عينة ثانية من ه-دلتا نهر اللؤلؤ، د2س ومفاجآت كما في الخطوة السابقة، وإضافة فيمرود إلى تركيز 50 ميكرومتر نهائي قبل أن يصل حجم ما يصل إلى 500 ميليلتر.
    5. نقل العينات 500 ميليلتر لأنابيب الرنين المغناطيسي 5 مم واسعة للتجربة.
  2. الرنين المغناطيسي النووي الإعداد التجريبية
    1. بدوره على تدفق الهواء مع الأمر إخراج "اكساجولا"؛ هذا سوف إحضار العينة من المغناطيس. الآن، ضع العينة داخل الزيادة ونقصان على رأس المغناطيس بفتح وأدخل مع الأمر "ij". انتظر حتى يستقر عينة داخل المغناطيس قبل المتابعة.
    2. إنشاء مجموعة بيانات جديدة باستخدام الأمر "تنمية الصادرات" وتحميل المعيار 1"ح الرنين المغناطيسي" المعلمات عن طريق تحديد تجربة "زجبر" (الشكل 1). ملء الاسم اكسبنو (رقم التجربة) وحقول بروكنو (رقم المجلد البيانات المجهزة). حدد المذيب في حقل "تعيين المذيبات" وانقر على "Execute' جيتبروسول '" لقراءة بروبيهيد القياسية والمعايير المعتمدة على المذيبات (بروسول).
    3. قفل العينة الديوتيريوم المذيبات، أي د2س، واستخدام الأمر "قفل" وانتظر حتى يتم الانتهاء كاسحة ويحقق قفل.
    4. تصحيح تردد الرنين المغناطيسي بضبط العينة باستخدام الأمر ضبط تلقائي "عتمة". رصد المنحنى تمايل حتى اكتمال ضبط تلقائي.
    5. شيم الحقل المغناطيسي باستخدام توبشيم (الأمر "توبشيم"). الملئ عملية إدخال تعديلات على المجال المغناطيسي لتحقيق التوحيد حول العينة. أنها ممارسة جيدة تخزين قيم الرقاقة مع الأمر "wsh" وقراءتها باستخدام "rsh" قبل توبشيم، في حالة استخدام عينات متشابهة أو بنفس.
    6. ضبط كسب المتلقي مع الأمر "رجا" لتحقيق الحد الأقصى من إشارة إلى نسبة الضوضاء.
    7. وضع مركز الطيف على إزاحة المياه الرنين (o1) وتعيين نبض بروتون 90 درجة (p1) في الطاقة العالية باستخدام "calibo1p1".
    8. جمع الذهاب الطيف بروتون الصفر باستخدام الأمر "زج" وعملية "efp" الذي يتضمن الضرب الأسية ("م")، تعريفية مجانية تسوس (FID) تتضمن توسيع خط "قدم" تحويل فورييه FID و "كيه" في تطبيق المرحلة تصحيح.
    9. تطبيق التصحيح التلقائي المرحلة "أية بي كيه" والتصحيح التلقائي الأساس "أبسن" باستخدام متعدد الحدود دون خيار الاندماج.
    10. قم بإنشاء مجموعة بيانات جديدة (كما هو الحال في 3.2.2) للتجربة همبك سوفاست عن طريق تحديد "SFHMQC3GPPH" في التجربة.
    11. نسخة الأمثل P1 و O1 من الطيف بروتون وتعبئة البقول يعتمد P1 باستخدام الأمر "جيتبروسول ح 1 p1 plw1"، حيث p1 هي قيمة P1 الأمثل وهو plw1 مستوى طاقة ل P1.
    12. تحسين المستمر CNST54 لتعيين الإزاحة من أجل التحول الكيميائية أميد و CNST55 لتحديد عرض النطاق الترددي لتشمل المناطق الطيفية للاهتمام الذي يسمح لكسب المتلقي لتكون الأمثل (الشكل 2). لتحديد هذه المعلمات، استخراج FID الأولى (تسوس تعريفية مجاناً) من الطيف ثنائي الأبعاد وابحث عن إشارة الملحوظ لتعريف لهم. وبالإضافة إلى ذلك، تختلف الاسترخاء التأخير (D1)، عدد عمليات التفحص (NS)، ومسح وهمية (DS) للحصول على حساسية إشارة مقبولة مع الأمر "ع"، التي تمكنك من الذهاب والمسح الضوئي لمراقبة جودة البيانات في الوقت الحقيقي.
    13. تسجيل الأطياف باستخدام الذهاب صفر "زج".
  3. تجهيز البيانات الرنين المغناطيسي النووي
    1. تعيين معلمات معالجة حجم F2 المباشر (1ح) وغير المباشرة F1 الأبعاد (15ن) لاستخدام الطيف "SI F2 = 2048، F1 = 512" مع التنبؤ الخطي الاختياري في البعد غير المباشرة (الشكل 3).
    2. حدد "قسيني" كوظيفة النافذة وأدخل تحولاً بيل جيبية (تضمين أحادي الجانب) من 2 معالجة الطيف ثنائي الأبعاد.
    3. أدخل الأمر "إكسفب" لمعالجة البيانات في كلا الاتجاهين مع تحويل فورييه ووظيفة نافذة.
    4. استخدم الأمر "apk2d" لإجراء التصحيح التلقائي المرحلة في كلا الاتجاهين. إذا كانت عملية تلقائية لا تحقيق مستوى مرض من مرحلة التصحيح، استخراج التنويه باستخدام الأمر "رسير"، وحساب قيم المرحلة من تجهيز د 1، وتطبيقها على البيانات 2D.
    5. تصحيح خط الأساس مع وظيفة التصحيح التلقائي الأساس "abs2" للبيانات 2D. وهذا يتم تطبيق دالة متعدد الحدود بين جزء في المليون القيم المعرفة في معالجة معلمات وسوف تنتج طائفة 2D لمزيد من التحليل.
    6. إذا كان التخطيط لتنفيذ معالجة المسلسل لمقارنة البيانات التفاعل مع جزيء آخر، تخزين معالجة معلمات مع الأمر "وبار" وأذكر لهم مع "ربار". وبهذه الطريقة سيتم تجهيز جميع مجموعات البيانات مع نفس المعلمات وتباينات لا سيقدم نظراً لمعالجة الخلافات.
  4. تحليل بيانات الرنين المغناطيسي النووي
    1. أدخل الأمر "ص" البدء في عملية الانتقاء الذروة.
    2. تعريف جزء في المليون النطاق والحد الأدنى كثافة/الحد الأقصى لعدد من قمم استناداً إلى قمم المتوقعة (الشكل 4). انقر فوق موافق، والتحقق من النتائج عن طريق التفتيش البصري. إذا لزم الأمر، أعد تشغيل عملية حتى تكون النتائج مرضية استناداً إلى نوعية الأطياف.
    3. تولد من بيكليست باستخدام الأمر "ص".
      ملاحظة: هذا بيكليست يحتوي على بيانات الارتفاع/ذروة كثافة المعلومات بشكل افتراضي ويمكن تصديرها إلى أطياف اللاحقة ويمكن قراءتها بواسطة برامج أخرى.
    4. مراقبة التغيرات في كثافة الذروة أو حركة في التحولات الكيميائية في أطياف هسقك البروتين التي تشير إلى التفاعل مع جزيء آخر. إذا كان التفاعل جزيء كبير، يتوقع تخفيضات في ذروة الشدة جنبا إلى جنب مع اختفاء بعض قمم.
    5. استيراد قائمة الذروة إلى مجموعة البيانات التالية بالنقر فوق علامة التبويب "الذروة" وتحديد "استيراد" مع حق انقر في نافذة قمم.
    6. تصور القمم عبر الطيف، وإذا لزم الأمر تحول منهم إلى مواقع جديدة. انقر فوق "إعادة تعيين كثافة" من أجل "الجدول الكامل" لتوليد بيكليست الطيف مع كثافات (الشكل 5). سوف تحمل هذه القائمة ذروة أكثر المعلومات موقف من قائمة ذروة المخزنة.
    7. تصدير قوائم الذروة من مجموعات مختلفة من البيانات إلى جدول بيانات أو برنامج آخر الرياضية للتحليل بتحديد الدالة "تصدير".
    8. حساب التغير في كثافة الذروة مع الدالة "كثافة الذروة في كثافة الطيف/ذروة المعقدة في الطيف البروتين" لكل ذروة. يمكن تحويل القيم إلى النسبة المئوية للتغير بضرب 100. علما بأن أحجام الذروة أيضا مفيدة على الرغم من كثافة الذروة الأسهل لقياس للقمم التي يتم وضعها قريبة من بعضها البعض، كما الحال للبروتينات ذات كثافة عالية من قمم واسعة نسبيا عادة.

4-MicroScale ثيرموفوريسيس (MST)

  1. إعداد يجند البروتين ه-دلتا نهر اللؤلؤ
    1. تبادل يجند في مؤقت MST متوافقة من دياليزينج ما يصل إلى 800 ميكروليتر من البروتين في وحدة غسيل الكلي المصغرة كاتشين 3.5 أوقف في 1 لتر من عيار 20 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.5، 10 مم كلوريد الصوديوم، مع التحريك ببطء في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    2. تركز يجند استخدام وحدة الطرد مركزي أولترافيلتريشن (كاتشين موكو 3) التي سينتريفوجينج في غ س 14000 مستودع لأدنى 10 نقل البروتين تتركز في أنبوب نظيف.
    3. الطرد المركزي يجند في س 21,000 ز لمدة 10 دقائق ونقل المادة طافية بعناية إلى أنبوب جديد لإزالة أي البروتين سرع. تحديد تركيز يجند تستخدم في امتصاص في 280 نانومتر ومعامل الانقراض [ليغند]. إضافة 10% توين-20 لإعطاء تركيز نهائي 0.015%. يتم إضافة توين-20 إلى المخزن المؤقت بالانزيم لمنع الامتزاز بالشعيرات الدموية. المخزن المؤقت الذي يتم استخدامه لتجارب MST الفحص النهائي 20 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.5، 10 مم كلوريد الصوديوم، 0.015% توين-20.
  2. إعداد الهدف المسمى صبغ البروتين فيمرود
    1. إعادة تشكيل الصبغ الأحمر-تريس-الإدارة الوطنية للسياحة بإضافة 50 ميكروليتر من 1 x برنامج تلفزيوني-T المتوفرة مع تريس جاتا الأحمر لإعطاء تركيز من 5 ميكرومترات. الاستغناء عن 2 ميكروليتر مختبرين في 200 ميكروليتر أنابيب وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    2. تمييع البروتين المستهدف إلى 0.34 ميكرومتر مع المخزن المؤقت للمقايسة. إضافة ميكروليتر 58 هدف قاسمة 2 ميكروليتر من الصبغ الأحمر-تريس-جاتا واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تركيز الصبغ المسمى الهدف النهائي 0.33 ميكرومتر. الطرد المركزي الهدف المسمى في 21,000 س ز لمدة 10 دقائق ونقل المادة طافية بعناية إلى أنبوب جديد لإزالة أي ترسبات. الصبغ الأحمر-تريس-الإدارة الوطنية للسياحة بالبروتين من خلال علامة His6 وثابت تفكك ملزمة (كد) في نطاق nanomolar الفرعية. هو فعال 100% منضمة إلى البروتين المستهدف حتى لا تنقية المزيد مطلوب.
    3. قم بتشغيل الأداة MST وفتح "برنامج التحكم". حدد الإعداد الحمراء للصبغ الأحمر-تريس-الإدارة الوطنية للسياحة. قم بتشغيل التحكم في درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية.
    4. حدد الاختبار الأولى للتحقق من صحة العلامات للهدف وتحقق للتجميع أو الامتزاز للترعة. إجراء تقييم لهذه المعلمات يتم توفيرها تلقائياً.
    5. 17 مزيج ميكروليتر من المخزن المؤقت للمقايسة وميكروليتر 3 البروتين المستهدف ومزيج من قبل بيبيتينج. سد الشعيرات الدموية الموحدة هما بغمس لهم في الهدف المخفف ووضع السائل داخل المركز شعري. ضع الشعيرات الدموية في العلبة والصكوك. بدء القياس.
    6. مراجعة النتائج التي تبحث عن مستوى كاف من الأسفار وأي علامات على الامتزاز (التشويه في شكل خط شعري) أو التجميع (تشوهات في تتبع MST) الذي سوف يتم وضع علامة في تحليل البرامج. إذا كانت نتائج التحرك الإيجابي إلى يجند الخطوات، أن لم يكن المخزن مؤقت مختلفة يجب أن يحاكم أو يمكن زيادة مقدار 20 توين إلى 0.05% أو أعلى.
  3. إعداد سلسلة تمييع شقين يجند ه-دلتا نهر اللؤلؤ
    1. إعداد سلسلة تمييع بوسم 16، 200 ميكروليتر أنابيب من 1-16.
    2. إضافة 17 ميكروليتر من يجند في 1.17 x تركيز أكبر من تركيز يجند الحد الأقصى المطلوب إلى Tube1. هذا المجلد هو ضعف المبلغ المطلوب (8.5 ميكروليتر) كما ثم ستنقل قاسمة للأنبوب القادم في سلسلة. حجم التحليل النهائي 10 ميكروليتر لذلك سوف تضعف ميكروليتر 8.5 1.17 x تركيز ليجند إلى س 1 بإضافة 1.5 ميكروليتر من البروتين المستهدف، فيمرود. هذا التركيز الأقصى المختارة يجب أن تكون على الأقل 20 مرة قيمة كد المقدرة.
    3. إضافة ميكروليتر 8.5 الإنزيم المخزن المؤقت إلى Tubes2-16 استخدام تلميح ماصة جديدة لكل قاسمة. إعادة استخدام ماصة نصائح يمكن أن يؤثر على الدقة (لتقديم المشورة بشأن إرشادات الشركة المصنعة انظر بيبيتينج دقيقة). نقل ميكروليتر 8.5 من يجند من Tube1 إلى Tube2 ببطء الإفراج عن الحل في المخزن المؤقت للمقايسة دون توليد الفقاعات. مزيج يجند والعازلة التي بيبيتينج صعودا ونزولاً من 6 مرات على الأقل، مرة أخرى دون توليد الفقاعات. ﻫ-دلتا نهر اللؤلؤ في الأنبوب الأكثر تركيزاً 1.5 مم وحضر فيمرود المسمى بتركيز نهائي 50 نانومتر.
    4. نقل ميكروليتر 8.5 من يجند من Tube2 إلى Tube3 وتخلط مع المخزن المؤقت المقايسة. كرر تمييع المسلسل إلى جميع الأنابيب كان يجند المضافة. تجاهل ميكروليتر 8.5 من Tube16 حيث تحتوي جميع الأنابيب ميكروليتر 8.5 من يجند في سلسلة من تخفيف شقين.
  4. إعداد تجربة رد فعل ملزم و MST
    1. إضافة 1.5 ميكروليتر من البروتين المسمى المستهدفة لكل من الأنابيب وتخلط بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع الحرص على تجنب الفقاعات. احتضان لمدة 15 دقيقة.
    2. حدد "وضع الخبير" للمقايسة ملزمة وإدخال المعلمات لسلسلة تمييع مسلسل. تأكد من تعيين التحكم في درجة الحرارة 25 درجة مئوية، يتم تعيين قوة الإثارة إلى 40 في المائة، وسلطة MST المتوسطة. يجب أن يكون الأمثل هذه المعلمات للشركاء ملزمة أخرى قيد الدراسة.
    3. ملء الشعيرات الدموية مع ردود فعل ملزم ووضع في علبة الشعرية. تحميل علبة الورق في الصك، والانتظار لدرجة الحرارة إلى استعادة 25 درجة مئوية، وتبدأ القياس.
  5. تحليل البيانات
    1. فتح ملف المقايسة ملزمة في برمجيات تحليل النسب. استعراض عمليات التفحص الشعرية؛ وينبغي أن لا تختلف مستويات الأسفار أكثر من 10 في المائة من المتوسط، لا تجميع أو الامتزاز ينبغي الكشف عنها كما هو موضح في المقطع 3.6.
    2. حدد التحليل MST في اللوحة اليسرى واسحب البيانات المقايسة في المجموعة تحليل. إذا كان هناك تشغيل متعددة نفس الهدف-يجند ملزمة المقايسة تحت ظروف مماثلة يمكن دمجهما بإسقاط في نفس المجموعة. بدلاً من ذلك، يمكنك إسقاط كل تشغيل في التحليل بشكل مستقل.
    3. الانتقال إلى علامة التبويب "الجرعة ردا مناسباً" البيانات الرسم البياني. اختيار نموذج كد إذا كان من المتوقع على موقع واحد ملزم. نموذج هيل أيضا خياراً لعدة مواقع الربط مع السلوك التعاوني. يمكن إزالة النقاط الخارجة التي لم يمر مراقبة الجودة من مناسباً في هذه المرحلة. سوف يكون متوسط مجموعات الدمج مع فحوصات متعددة وأخطاء حساب الانحراف المعياري.
    4. فتح علامة التبويب النهائي ومقارنة النتائج بين جميع المؤامرات على رسم بياني واحد. استرداد نتائج ملائمة لكل منحنى من الجدول الذي تم إنشاؤه. تصدير البيانات أو منحنيات المجهزة للبرامج الأخرى عرض تقديمي أو التحليل إذا رغبت في ذلك.

Representative Results

ﻫ-دلتا نهر اللؤلؤ المجال (بقايا 1822-2014 المستنسخة في هتك بروكس) الجينات البشرية انفوبلاكين والملك فيمرود (بقايا المستنسخة في pET21a 99-249) أعربت مع العلامات His64 فيمنتين البشرية وتنقيتها. رقم 6 و رقم 7 تبين مستويات نقاء فيمرود (18.8 كاتشين) وهاء-دلتا نهر اللؤلؤ (21.8 كاتشين) التي تم الحصول عليها من هذا الأسلوب لتنقية البروتين. إزالة His6 العلامة من بناء ه-حزب الثورة الديمقراطية أمر ضروري للتجارب MST يسمى البروتين فيمرود استخدام صبغة ملزمة علامة His6، وقد تتنافس أي ه-دلتا نهر اللؤلؤ الاحتفاظ العلامة His6 لربط الصبغة. إزالة العمود ايماك الثاني بعد انشقاق العلامة بحوزتي TEV حوزتي TEV، والعلامة ملصوق، وأي أونكليفيد His6-ه-دلتا نهر اللؤلؤ التي ظلت. خطوة الصقل النهائي للتنقية هو حجم الاستبعاد اللوني. على الرغم من كل البروتينات ذات حجم مماثل، التيس فيمرود من العمود في مل 51 بينما يتركز في ذروة شطف ه-دلتا نهر اللؤلؤ في 72 مل حيث يتوقع مونومر بروتين هذا الحجم. الزيادة الواضحة في حجم فيمرود من المحتمل نظراً لخصائصه كقضيب طويل الخيطية على شكل البروتين وتحليلي ultracentrifuge التجارب أثبتت أن فيمرود كان أحادي4. يتم الحصول على غلة أقل من البروتين من الثقافات نمت في M9 من تلك من مرق الغنية بسبب كمية أقل من الخلايا التي تنتجها وسائل الإعلام الحد الأدنى. الأولى نمو الثقافات كاتب أكبر للأعمال التحضيرية M9 في السل يتيح تحسين غلة الخلية مع الحفاظ على مدى 15ن وضع العلامات اللازمة لتجارب الرنين المغناطيسي النووي.

تم اقتناء 15N-1"هسقكس ح" لنوع البرية والمسخ R1914E من ه-دلتا نهر اللؤلؤ في وجود أو عدم وجود فيمرود (الشكل 8 أ-د 8). طيف ه-دلتا نهر اللؤلؤ في الشكل 8 (أ) يوضح العدد المتوقع من قمم حل جيد، يدل على بروتين مطوية بشكل صحيح. حضور فيمرود (الرقم 8B) يظهر الطيف توسيع خط واسعة واختفاء الذروة، المقابلة للربط بين ه-دلتا نهر اللؤلؤ وفيمرود. يتم فقدان هذا الربط بطفرة R1914E كما يتضح بالمقارنة الرقم 8 و 8 د. ولوحظ تغير ضئيل في الطيف عند إضافة فيمرود للمسخ R1914E التي تشير إلى عدم الربط بين هذا المسخ ه-دلتا نهر اللؤلؤ وفيمرود. مقارنة كثافات ذروة ه-دلتا نهر اللؤلؤ في الوجود/عدم وجود فيمرود ورسم ككثافة الذروة النسبية في 8E الشكل، الذي يشير إلى نطاق توسيع الذروة في المجمع ه-دلتا نهر اللؤلؤ. المسخ R1914E من ه-حزب الثورة الديمقراطية (غير معروضة) الإبقاء على حوالي 97 في المائة قمم في 20 في المائة أو أعلى ذروة الشدة في وجود فيمرود مقارنة بحوالي 20% لنوع البرية (8E الشكل). هذا يمثل خسارة للدالة نقطة متحولة، مع طفرات إضافية لها آثار متوسطة أيضا بعد أن درس4.

للتحقق من صحة وقوانتيتاتي ربط التحليل فيمرود و MST ه-دلتا نهر اللؤلؤ باستخدام His6-فيمرود المسمى بالصبغ الأحمر-تريس-جاتا فلوري كالهدف مختلطة مع تناقص تركيزات يجند ه-دلتا نهر اللؤلؤ من 1.28 مم إلى 39.1 أجريت شمال البحر الأبيض المتوسط. نفذت ثلاثة الربط المعايرة وبلغ متوسط النتائج وهو موضح في الشكل 9. البيانات كانت تتناسب مع نموذج قياسي ليجند موقع واحد ملزم وأعطى كد من 25.7 ± 2، 1 ميكرومتر. وقدم التقييم للربط بين فيمرود والإلكترونية-دلتا نهر اللؤلؤ بالرنين السطحية مأكل مثل الطحين مماثلة كد قيمة 19.1 ± 1.3 ميكرومتر4.

Figure 1
رقم 1: شاشة القبض على الإعداد للتجربة الرنين المغناطيسي النووي- يتم استخدام النافذة سيظهر لإعداد تجربة قياسية لجمع مجموعة من بيانات هسقك. تتم قراءة المعلمات التجربة في مجاورة للتجربة. يتم اختيار التجربة زجبر سيظهر كتجربة أولية لتحميل المعلمات بروتون تعتمد القياسية والمذيبات. إطار العنوان يستخدم لإدخال تفاصيل التجريبية لأغراض حفظ السجلات. جمع الطيف هسقك، يتم استبدال التجربة زجبر مع SFHMQC3GPPH. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: ضبط معلمات الرنين المغناطيسي النووي التجريبي. يتم استخدام النافذة سيظهر لإدخال البارامترات الأساسية لتسلسل نبض الرنين المغناطيسي النووي بغية تحسين الإشارة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تجهيز البيانات الرنين المغناطيسي النووي- يتم عرض المعلمات المستخدمة لمعالجة كل من البعدين طيف الرنين المغناطيسي النووي، مع الأسهم التي تشير إلى تلك التي يتم تعديلها بشكل عام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: معايير للانتقاء ذروة الرنين المغناطيسي النووي- تظهر المعلمات المستخدمة لانتقاء قمم الرنين المغناطيسي النووي في طيف الرنين المغناطيسي المجهزة مع القيم النموذجية. ضبط النطاق جزء في المليون، وكثافة وعدد القمم لتحسين الأطياف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: بيكليست الممثل مع كثافات. يعطي كل من الذروة التي يتم انتقاؤها في طيف الرنين المغناطيسي النووي عددا، و 1ح والتحولات الكيميائية 15ن وكثافة إشارة يتم عرضها. ثم يمكن استخدام هذا بيكليست مقارنة الأطياف التي تم الحصول عليها في الوجود/عدم وجود شريك المتفاعلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: تنقية فيمرود معلم His6 ايماك وألف س. ويبين chromatogram شطف من العمود ايماك ذروة رئيسية واحدة من فيمرود. باء-chromatogram شطف من العمود S يظهر ذروة رئيسية واحدة. جيم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة كسور التي جمعت على مدى تنقية: معايير ميغاواط مع الرعاية الاجتماعية المشار إليها في كاتشين لليسار هلام (M)، خلية ليستي (1)، ايماك التدفق عبر (2)، والغسيل (3)، وشطف المجمعة (E1)، تجمع S شطف (E2). تكون الأشرطة المرئية في أعلى الأوزان الجزيئية في حارات E1 و E2 ليغومرات فيمرود نقية كما أكدته لطخة غربية (البيانات لا تظهر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: تنقية ه-دلتا نهر اللؤلؤ ايماك وألف س. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لتنقية ايماك عرض معايير الوزن الجزيئي مع ميغاواط المشار إليه في كاتشين إلى يسار الهلام (M)، والنذره من ايماك العمود الأول (E1)، TEV الانقسام والمنتجات (+ TEV)، والتدفق من خلال من العمود الثاني ايماك (قدم). باء-اللوني من العمود S يظهر ذروة رئيسية واحدة. جيم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة معايير الوزن الجزيئي (M) والكسور من ذروة S. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: أطياف هسقك البرية من نوع والمسخ R1914E من ه-دلتا نهر اللؤلؤ في وجود وغياب فيمرود. إظهار الأطياف هسقك البرية من نوع ه-دلتا نهر اللؤلؤ (100 ميكرومتر) في 20 مم تريس-HCl، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم DTT، الأس الهيدروجيني 7 في غياب (A) أو وجود 50 ميكرون فيمرود (ب). لوحات ج ود هي الأطياف هسقك متحولة R1914E (100µM) في غياب أو وجود 50 ميكرون فيمرود، على التوالي. في لوحة ه ذروة15ن النسبي 1ح-تظهر كثافة ه--دلتا نهر اللؤلؤ مع أو بدون فيمرود ملزمة كدالة لعدد الذروة، الذي هو تعيين تعسفياً ولا يستند إلى موقف تسلسل. يمكن استخدام هذه القيم لتعريف قطع من أهمية للحد من كثافة الذروة عند إضافة يجند. إذا كانت التعيينات متوفرة، يمكن غالباً ما ينظر القيم الهامة خريطة لمنطقة ملزمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الشكل 9: ملزمة من ه-دلتا نهر اللؤلؤ إلى فيمرود- كان مخفف ه-دلتا نهر اللؤلؤ في سلسلة من تخفيف شقين من 1.28 مم إلى 39.1 نانومتر والمحتضنة مع المسمى فيمرود قبل إجراء تحليل MST. تم دمج البيانات من ثلاثة فحوصات مستقلة. تم احتواء البيانات إلى نموذج كد يعطي كد من ميكرومترات 25.7 بثقة كد ميكرومترات ± 2.1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كاشف الكمية
فوسفات الصوديوم، مائي (لا مائي) ز 6.0
فوسفات البوتاسيوم، مونوباسيك (لا مائي) ز 3.0
كلوريد الصوديوم ز 0.5
ح2س يصل إلى 950 مل

الجدول 1. M9 وسائل الإعلام "وسم النظائر".

كاشف الكمية
15 NH4Cl ز 1.0
الجلوكوز (أو 13ج-الجلوكوز) ز 2.0
1 م MgSO4 2 مل
كاكل 50 مم2 4 مل
20 ملغ/مل الثيامين مل 1.0
3 مم فيكل3 400 ميليلتر
المعادن ميكس (الجدول 3) 500 ميليلتر
ح2س يصل إلى 50 مل

الجدول 2. مزيج المغذيات لمكملات M9 وسائط الإعلام.

كاشف الكمية
4 مم زنسو4 323 ملغ
1 مم منسو4 مغ 75.5
بو 4.7 مم ح33 145 ملغ
خصصت 0.7 ملم4 مغ 55.9
ح2س تصل إلى 500 مل

الجدول 3. مزيج معدني الملحق لإثراء مزيج المغذيات طن متري.

عينة 1 ملم ه-دلتا نهر اللؤلؤ في المخزن المؤقت A1 (ميليلتر) 1 مم فيمرود في المخزن المؤقت A (ميليلتر) المخزن المؤقت (ميليلتر) 200 ميكرومتر مفاجآت في س د2(ميليلتر) المخزن المؤقت ب2 (ميليلتر) إجمالي الحجم (ميليلتر)
ه-حزب الثورة الديمقراطية وحدها 50 0 50 50 350 500
ﻫ-دلتا نهر اللؤلؤ + فيمرود 50 50 0 50 350 500
1 المخزن المؤقت ج: 20 مم تريس-HCl، 1 مم DTT، الأس الهيدروجيني 7
2 المخزن المؤقت ب: 23 ملم تريس-HCl، 1.14 مم DTT، الأس الهيدروجيني 7

الجدول 4. إعداد عينة الرنين المغناطيسي النووي.

Discussion

2D 15تجربة حل ن الرنين المغناطيسي واحدة من الأكثر استخداماً أساليب لإظهار كيف اثنين من جزيئات تتفاعل. هو الأسلوب الأكثر الغنية بالمعلومات التي تتيح إشارات كل من الشركاء يتعين رصدها بشكل مستمر طوال تجربة معايرة في الدولة الحل. على الرغم من أن نوعية عادة في حالة المجمعات الكبيرة، الأسلوب يمكن أيضا استخدام في حالات إيجابية لقياس الانتماءات الملزمة حيث يمكن تتبع إشارات الرنين المغناطيسي النووي في الأطياف عالية الدقة. حيث يمكن إجراء تعيينات مريح، كما هو الحال في حالة العديد من البروتينات تحت كاتشين 20 في حجمها، ومواقع الربط يمكن أيضا تعيين. فحوصات تكميلية مثل MST توفير معلومات كمية عن التفاعلات في الحل، وتتطلب أقل من البروتين في الدول غير مسمى. مقارنة متحولة ربط البيانات مفيد في توفير الضوابط لضمان حقيقي يتجلى في الرنين المغناطيسي خط توسيع التفاعلات ولا التحف، على سبيل المثال، تغيير التجميع أو اللزوجة.

تعبير البروتين

تبسيط عملية التعبير يقلل كمية إنتاج البروتين كثيفة العمالة. ويشمل جزء من عملية التحسين هذه التعرف سلالة كولاي المناسبة للتعبير المؤتلف من البروتين. سلالة التفضيل يعتمد على العناصر بما في ذلك طبيعة الموجه في استخدام، وأكثر تحديداً، الاستقرار في نهاية المطاف للبروتين المؤتلف الذي أعرب عن7. الخطر تدهور البروتين مغايرة بالذاتية كولاي يمكن الحد من البروتياز باستخدام حوزتي ناقصة كولاي مثل سلالة BL21. للجينات التي تحتوي على codons النادرة، قد يكون سلالة مثل BL21-كودونبلوس (DE3) RIPL المفضل. هذه السلالة تجمع بين طبيعة حوزتي ناقصة من سلالة BL21 مع نسخ محلية إضافية من ترنس كودون نادرة ارجينين، آيسولوسين، برولين، ولوسين. وبدلاً من ذلك، قد تجنب codons النادرة التي يمكن أن تنال من أوفيريكسبريشن حسب ترتيب بناء كودون الأمثل من مصدر تجاري. تتوفر العديد من سلالات كولاي التعبير الجيني المؤتلف، كل الأمثل للتحايل على مشكلة خاصة أثناء التعبير7. في حالة هذه الدراسة، أنتجت سلالة ناقصة حوزتي القياسية BL21(DE3) كميات كافية من البروتين للذوبان لتنقية اللاحقة والتحليل.

تنقية البروتين

بروتوكول تنقية بروتين معين في كثير من الأحيان فريدة من نوعها بمعنى أن كل البروتين لا تزال مستقرة وقابلة للذوبان تحت ظروف مختلفة مثل درجة الحرارة، وتركيز الملح، أو الأس الهيدروجيني. الفعالية الشاملة لتنقية من خلال التقارب اللوني أيضا حساسة إلى تركيز الأنواع التينج مثل ايميدازول في الخطوات المختلفة أثناء عملية التنقية. في هذا العمل، وكانت ظروف حرجة المخزن المؤقت ايماك الأس الهيدروجيني لهاء-دلتا نهر اللؤلؤ، وتركيز ايميدازول فيمرود. وكان الرقم الهيدروجيني 7.5 المطلوبة لتجنب ترسيب ه-دلتا نهر اللؤلؤ بعد شطف الأولى من العمود ايماك. لتنقية ايماك فيمرود، عثر على زيادة تركيز ايميدازول من 30 إلى 50 ملم خلال الخطوة أغسل العمود إلى تحسن كبير في نقاء الكسور شطف النهائي. لخطوة شطف، زيادة تركيز ايميدازول من 250 إلى 350 مم كما وجد أن زيادة غلة شطف النهائي. المحاولات الأولى للبروتين باستخدام 250 ملم ايميدازول الوت أدت إلى شطف ناقصة من فيمرود كما كشف شريط ايميدازول م 1 نهائي من العمود (البيانات لا تظهر). زيادة تركيز ايميدازول إلى 350 ملم شطف كان كافياً لاستعادة كل من البروتين ملزمة للعمود. S يمكن أن تخدم غرضاً مزدوجاً لأنها بمثابة خطوة الصقل لتنقية البروتين أثناء أداء exchange المخزن المؤقت في وقت واحد. تبادل المخزن المؤقت خطوة حاسمة لتحليل ملزمة اللاحقة حيث أنه يزيل ايميدازول المستخدمة إلى الوت معلم His6 البروتين. أنها أيضا بمثابة فرصة لتغيير ظروف مثل تركيز الملح أو درجة الحموضة، مما قد يؤثر في فعالية تقنيات المصب أو فحوصات معينة. البروتين التحول الحراري (PTS) يمكن استخدامها لتحديد المخازن المؤقتة الأمثل لفحوصات المصب، خاصة بالنسبة لتلك التي تتطلب البروتين مستقرة لإطالة فترات زمنية في درجة حرارة الغرفة8،9.

تحليل ملزمة

البروتين الذي هو طازج أمر بالغ الأهمية لفحوصات دقيقة ملزمة، على الرغم من أن يمكن أيضا استخدام البروتين المجمدة طالما يتم مقارنة النتائج. البروتينات الخيطية مثل مولتيميريزي فيمنتين بطريقة تعتمد الملح والحموضة، ومن ثم الحل شرط الحاجة إلى أن يكون الأمثل والدولة oligomeric المقدرة باستخدام أسلوب مثل ثانية10،11، دينامية تناثر الضوء 12 أو التحليلية تنبيذ فائق13،،من1415. مطيافية الرنين المغناطيسي النووي أيضا مناسبة لقياس التفاعلات يجند البروتينات الصغيرة في القرار الذري. ومع ذلك، عند بروتين يتفاعل مع جزيء أكبر، وتستتبعه الهبوط أبطأ، وهذا يؤدي إلى فقدان الإشارات، التي يمكن أن تؤكد ملزم على الرغم من أنه لا بالضرورة السماح لرسم الخرائط لربط المواقع، مما سيتطلب أيضا انتداب على الأقل العمود الفقري الأصداء. في هذا السيناريو، لا تسمح تجارب الرنين المغناطيسي تعريف الموقع التفاعل. ومن ثم توجه الموقع الطفرات يتم تطبيق تحديد المخلفات الحيوية اللازمة للربط. ولذلك لا يحمل هذه طفرات فقدان إشارة. في هذا البروتوكول، يحتفظ بكثافة الذروة في وجود فيمرود نموذج متحولة مع استبدال في موقف عام 1914 ويؤكد ذلك اختلال تفاعل ه-دلتا نهر اللؤلؤ وفيمرود. تعيين الأصداء العمود الفقري و sidechain ستضيف قيمة إلى هذا النهج، لا سيما وأن هيكل ه الحرة--دلتا نهر اللؤلؤ قد حلت بعلم البلورات بالأشعة السينية4. التطبيقات المستقبلية للرنين المغناطيسي النووي تشمل توصيف للتفاعلات المعقدة بين الجزيئات أكبر وسوف تستفيد من المغناطيس الحقل عالية جداً، واستخدام جماعات أخرى يمكن ملاحظتها مثل 13ج المسمى ومجموعات الميثيل تريفلورو كالصحفيين.

MST يحتوي على عدد من المزايا لدراسة التفاعلات ملزمة16. الشركاء ملزمة حرة في الحل وليس المعطل تداولها. تحليل نوعية العينات هو في صلب البرنامج مع الإبلاغ عن مراقبة الجودة للتجميع، الامتزاز بالشعيرات الدموية أو وضع العلامات الفلورية غير كافية للجزيء المستهدف. يتم عادة استخدام كميات صغيرة من الهدف، وتركيز الهدف المسمى عادة ما بين 20-50 نانومتر في 10-20 ميكروليتر حجم/رد فعل. هذا البروتوكول يستخدم كميات صغيرة جداً من رد فعل (10 ميكروليتر) لتحقيق أقصى التركيز ليجند التي يمكن تحقيقها في المعايرة السماح للتفاعلات ملزمة ضعيفة تتسم. وهذا يستدعي بيبيتينج والحرص على تجنب إدخال فقاعات بينما لا يزال دقة خلط دقيقة. خلط الكافية أمر بالغ الأهمية للقياسات fluorescence دقيقة ومتسقة على طول مجموعة تخفيف المسلسل. تم تخفيض مبلغ 20 توين في التجارب MST من معيار 0.05% إلى 0.015% إلى انخفاض الميل إلى خلق فقاعات وتحسين الاختلاط.

الصبغ الأحمر-تريس-جاتا يوفر طريقة سريعة وسهلة ومريحة لتسمية أي البروتين الذي يحتوي بلده فلوريسسينتلي العلامة. العلامات فعالية كاملة في 30 دقيقة فقط، وهو ضيق جداً بحيث لا إجراء إزالة الصبغة ضروري. يتم إجراء لا تعديلات مخلفات الأحماض الأمينية في البروتين الذي قد يغير خصائص ملزم يجند. تحذير أن يكون فقط البروتين يكون المسمى علامة His6. وهذا يتطلب الانقسام والعلامة من البروتين يجند، ﻫ-دلتا نهر اللؤلؤ، وإزالة العلامة وه أونكليفيد--دلتا نهر اللؤلؤ مع خطوة ايماك عمود ثاني. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي إعداد البروتين يجند دون استخدام له علامة. بدلاً من ذلك، قد يكون المسمى البروتينات تساهمي مع فلوروفوري من خلال اقتران لبقايا يسين أو ثيول اقتران لبقايا السيستين أمين. ومع ذلك، يجب توخي الحذر عند استخدام هذه النظم منذ إلحاق fluorophore التساهمية قد تؤثر على التفاعلات الربط الكهربائي أو القطبية تعتمد على بقايا يسين أو سيستين. وكان التحديد الكمي لملزمة تقارب بين فيمرود وهاء-دلتا نهر اللؤلؤ من MST الحساسة غير عادي للملح تركيز. كان التخفيف من هذه المشكلة بالبداية دياليزينج كل من الهدف ويجند في نفس الدفعة من المخزن المؤقت للمقايسة. ومع ذلك، لا يمكن تحقيق التشبع المنحنى ملزمة MST عند إجراء المقايسة MST حضور 150 مم كلوريد الصوديوم بسبب سلوك معقدة من فيمرود. تم الحصول على بيانات موثوق بها وكاملة بمجرد خفض تركيز كلوريد الصوديوم إلى 10 ملم يسمح حساب دقيق من كد. ومن ثم، ينصح الأمثل دقيق لشروط الحل والمقارنة مع فحوصات مكملة لتحقيق نتائج قوية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام MST التحديد الكمي للاعتماد على الملح لوجود تفاعل معين، وتحديد خصائص المقايسة لتفاعلات البروتين، ورصد طي البروتين، والتحقيق في حركية إنزيم17.

Disclosures

المؤلفون بالكشف عن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

هذا المشروع قد حظي بمقدمة رجبين-2018-04994، برنامج الابتكار ألبرتا للحرم الجامعي (ج RCP-12-002) ومعهد بحوث بريون ألبرتا/"ألبرتا يبتكر الحلول الحيوية" (201600018)، منح M.O والجينوم كندا و "المؤسسة الكندية" ل الابتكار المنح المقدمة إلى مركز الابتكار جميع (تميك) ونانوك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Monolith NT.115, includes control and analysis software NanoTemper Technologies MO-G008 Instrument for microscal thermophoresis
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA NanoTemper Technologies MO-L008 RED-tris-NTA dye for MST
Standard capillaries NanoTemper Technologies MO-K022 capillaries for MST
HisTrap HP, 5 mL GE Healthcare 17524801 IMAC column
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL Thermo Fisher Scientific 88222 IMAC resin
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 SEC column
TEV protease Sigma Aldrich T4455 cleavage of his tag from E-PRD
BL21(DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527H cells for protein expression
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free Sigma Aldrich 11873580001 protease inhibitors for protein purification by IMAC
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706 reducing agent for protein purification
Reagents (HEPES, NaCl, etc) Sigma Aldrich various Preparation of media and buffers
Ammonium chloride (15N, 99%) Cambridge Isotope Laboratories NLM-467 isotope labelling for NMR
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-2259 NMR sample preparation
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-8206 reference for NMR
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long SJM/Deuterotubes BOROECO-5-7 NMR tubes
NMR spectrometer (14.1 Tesla) Bruker acquisition of NMR data
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe Bruker acquisition of NMR data
Name Company Catalog Number Comments
Software
Bruker TopSpin 4.0.1 Bruker processing of NMR data
MO.Control NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115
MO.Affinity Analysis NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinogradova, O., Qin, J. NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions. Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).
  2. McKercher, M. A., Wuttke, D. S. NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions. Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).
  3. Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases. Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).
  4. Fogl, C., et al. Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin. Nature Communications. 7, (2016).
  5. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).
  6. Wishart, D. S., et al. 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).
  7. Casali, N. Escherichia coli Host Strains. E. coli Plasmid Vectors. , Humana Press. 27-48 (2003).
  8. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  9. Kozak, S., et al. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).
  10. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. , In Press (2018).
  11. Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  12. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  13. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  14. Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).
  15. Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).
  16. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
  17. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، 141 قضية، خلية أدهيسيونديسموسومي، ديسموبلاكين، والبروتينات الخيطية، الشعيرة المتوسطة، ثيرموفوريسيس microscale، مطيافية الرنين المغناطيسي النووي، التفاعل البروتين، فيمنتين
قياس تفاعلات البروتينات كروي والخيطية مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar,… More

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST). J. Vis. Exp. (141), e58537, doi:10.3791/58537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter