Morfométricos protocolo para a avaliação objetiva do comportamento de blastocisto durante a vitrificação e aquecimento passos

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo morfométricos lapso de tempo para acompanhar a intensidade do encolhimento de blastocisto e re-expansão durante as intervenções de previtrification e recuperação pós-aquecimento. A aplicação do protocolo, é possível em vitro laboratórios fertilização equipados com microscópios de lapso de tempo e recomenda-se no desenvolvimento de um método de vitrificação de blastocistos ideal.

Abstract

Este artigo descreve o método não-invasivo de blastocisto morfometria baseada em microfotografia lapso de tempo para o controlo rigoroso do volume de um blastocisto mudando durante as fases individuais antes e após a vitrificação. O método pode ser útil na busca para o sincronismo mais ideal de exposição de blastocisto a diferentes concentrações de crioprotectores observando o encolhimento de blastocisto e re-expansão em diferentes pré- e pós-vitrificação fases. Com esta metodologia, o protocolo de vitrificação de blastocistos pode ser otimizado. Para uma melhor demonstração da utilidade deste método morfométrico, dois protocolos de preparação diferente blastocisto para vitrificação são comparados; com o uso de um blastocoel artificial em colapso e sem esta intervenção antes de vitrificação. Ambas as variações de volume dos blastocistos são seguidas por lapso de tempo microfotografia e medidas por ferramentas de software de edição de fotos. As medidas são feitas em 20 segundos em fases de previtrification e a cada 5 minutos no período pós-aquecimento. As alterações das dimensões blastocisto por unidade de tempo são apresentadas graficamente em diagramas de linha. Os resultados mostram uma fase de previtrification longo de equilibração, no qual o blastocisto intacto encolhe-se primeiro e então lentamente recargas a blastocoel, entrando em vitrificação com um blastocoel cheio de líquido. O blastocisto artificialmente recolhido permanece na sua fase encolhido pela fase de equilibração inteira. Durante a fase de vitrificação, ele também não altera seu volume. Desde que o blastocisto morfometria mostra um volume constante dos blastocistos artificialmente recolhidos durante a etapa de previtrification, parece que esta etapa pode ser mais curta. O protocolo descrito fornece muitos parâmetros comparativos adicionais de comportamento de blastocisto durante e após a criopreservação em função da velocidade e intensidade das variações do volume, o número de contrações blastocoel parcial ou total blastocisto colapsos e o tempo para um total de blastocoel re-expansão ou o tempo de incubação.

Introduction

Criopreservação de embriões humanos de pré-implantação do in vitro fertilização programa (FIV) hoje em dia é uma prática de rotina na maioria dos laboratórios de fertilização in vitro. O embrião lento congelando o método começou a ser utilizado clinicamente em 1985, com a introdução de crioprotectores específicos e congeladores controlado por computador, que permitiram o resfriamento controlado de embriões até-7 ° C, quando a nucleação de gelo (semeadura) foi induzida na circundante cryoprotective médio¹. Por resfriamento contínuo, iria crescer cristais de gelo, causando a hiperosmolaridade da fração líquida restante e, consequentemente, a desidratação e contração das células embrionárias. A-30 ° C ou -80 ° C, os embriões que mergulhou o nitrogênio líquido para conservação mais longa. O que estava acontecendo com os embriões e oócitos durante o resfriamento podia ser observada apenas por cryomicroscopes especialmente adaptados, que ajudou a melhorar os protocolos de criopreservação². O congelamento de blastocistos, um volume maior e mais fluido contido fase embrionária, deu resultados clínicos menos promissores naqueles dias³.

O grande avanço na criopreservação do blastocisto foi a introdução do método de vitrificação, em que a desidratação das células ocorreu antes de refrigeração usando altas concentrações de crioprotectores⁴. A remoção do fluido do blastocoel antes de vitrificação também pode ser conseguida fazendo uma abertura mecânica entre dois trofectoderma células⁵. Embora a taxa de sobrevivência de blastocisto imediata após a vitrificação e aquecimento está acima de 90% e os seguintes resultados clínicos a transferência de blastocisto vitrificados/aquecido na cavidade uterina é quase comparável aos resultados após a transferência do fresco embriões, esse método de criopreservação ainda não foi padronizada^6,7. Protocolos de vitrificação variam de acordo com o tipo e a concentração dos crioprotectores, (b) o número de passos previtrification, (c) a duração das etapas individuais, (d) o uso de um blastocoel artificial em colapso antes de vitrificação, ou não, (e). colapso (g) a temperatura de equilíbrio/vitrificação, fase (f) a expansão de blastocisto e métodos em que os embriões devem ser vitrificados⁸. Desde crioprotectores podem ser tóxicos para as células, o tempo de exposição do blastocisto para essas soluções tem que ser bem definidos. No entanto, alguns fabricantes de mídia de criopreservação permitam protocolos muito flexíveis.

O interesse dos cientistas é geralmente focado em estudar a capacidade de re-expansão do blastocisto com o objectivo de encontrar novos biomarcadores com uma melhor previsão de implantação^6,9,10. Como humanos blastocistos desidrata-se em diferentes etapas de adição de crioprotectores antes de vitrificação e o que acontece com blastocistos após a vitrificação e aquecimento, quando os crioprotectores têm ser retiradas as células, e como os blastocistos hidratar e re-expandir após o aquecimento, é não bem descrito nem compreendido. O desenvolvimento de uma metodologia para o objectivo e quantificados monitoramento do comportamento de blastocisto durante etapas diferentes de criopreservação é, portanto, lógica.

Com microscópios de lapso de tempo de vários fabricantes, agora é possível acompanhar o comportamento do blastocisto no pré e pós-vitrificação fases. Incluindo ferramentas de computador adicional, medições de seu tamanho (morfometria) também podem ser realizadas. Por medição a diminuição ou aumento no tamanho do embrião em um determinado momento, é possível objetivar a avaliação da morfodinâmica de embriões durante a desidratação e reidratação.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Nacional de ética médica em 19 de abril de 2016 (n º 0120-204/2016 – 2).

1. instalação do sistema de gravação de microscópio

1. Desliga a placa de aquecimento do microscópio.
2. Antes de qualquer tratamento, tirar um instantâneo de um blastocisto sob um microscópio invertido câmera equipada. Lembre-se de observar a ampliação na qual foi gravado o blastocisto.

2. seleção e Prepreparation de blastocistos para vitrificação

1. Selecione somente blastocistos dia 5 ou 6-dia totalmente expandidos para Criopreservação com pelo menos algumas células de (ICM) massa celular interna e trofectoderma coesa.
2. Para blastocistos laser-tratado com um blastocoel recolhido, assunto um blastocisto para um pulso de laser curto (0,4 - 0,7 ms) com um diâmetro de furo, variando de 4,3 a 9,4 µm, dirigido tangencialmente a zona pelúcida e uma junção de duas células adjacentes trophectodermal. Permitir que o blastocisto para totalmente ou parcialmente em colapso por 5 min.
3. Para blastocistos não tratados com um blastocoel intacto, não realizar nenhum tratamento específico antes de vitrificação.
   Nota: Esses blastocistos são considerados intactos.

3. preparação do crioprotetor e uma placa de Petri para a fase de equilíbrio

1. Pipeta de pithe uso de desnudamento do oócito (µm de diâmetro 135) preencher assepticamente mídia equilibração (média de tampão HEPES M-199 com 7,5% DMSO, glicol de etileno de 7,5%, 20% DSS) nos furos da área microdroplet de um prato de Petri 9-bem projetado especialmente para microscopia de lapso de tempo e gravação.
   Nota: Desnudamento do oócito é um processo de remoção de células do cumulus rodeiam o oócito. A utilização de uma pipeta de desnudamento do ovócito vai ajudar a evitar a criação de bolhas de ar.
2. Sobreposição de área de microdroplet com 30 µ l de mídia de equilibração.

4. transferência do blastocisto na solução de equilíbrio

1. Mergulhe um blastocisto tratada com laser ou intacto o equilibrio medium para o fundo da área de microdroplet do prato microdroplet por 10 min à temperatura ambiente (fase de equilibração).
2. Começa uma contagem regressiva 10-min, assim que o blastocisto é transferido para o equilibrio medium.

5. gravação do blastocisto na fase de equilíbrio

1. Transferi a cápsula de microdroplet com o blastocisto para um microscópio câmera equipada. Use a mesma ampliação como anteriormente para obter um instantâneo do blastocisto mesmo. Posição do microdroplet do prato para que o blastocisto é posicionado aproximadamente no centro da gravação.
2. Inicie a gravação com o microscópio software de gravação. Observe o tempo de contagem regressiva, em que a gravação é iniciada.
   Nota: Ver resultados representativos de gravações de uma intacta (Figura 1, Video 1) e um blastocisto recolhido (Figura 2, vídeo 2) durante a exposição de 10 min para uma solução de equilíbrio.

6. vitrificação de blastocisto

1. Assepticamente dispense uma gota de 50 µ l da solução de vitrificação (M-199 tampão HEPES médio com 15% DMSO, glicol de etileno de 15%, 20% DSS, 0,5 M de sacarose) em uma placa de Petri 2min antes da contagem regressiva acabar.
2. Parar a gravação quando a contagem regressiva 10-min termina e transferir rapidamente o blastocisto para solução de vitrificação por 30 s, à temperatura ambiente.
3. Pipetar suavemente o blastocisto pelo menos 1 x dentro da solução de vitrificação.
4. Use uma palha de vitrificação para carregar o blastocisto. Carregar, selar e mergulhar a vitrificação palha em nitrogênio líquido (LN) dentro de 80 s, não superior a 110 s após a exposição inicial para a solução de vitrificação.

7. a edição de vídeo do blastocisto gravado durante a fase de equilíbrio

1. Importe um arquivo de vídeo gravado em software de edição de vídeo.
2. Mova o controle deslizante cronograma para 20 nota s. o número de quadro neste momento.
   Nota: Este número será usado para dizimar os quadros de vídeo desnecessários. Só quadros cada 20 s será usado.
3. Clique na guia vídeo , então a taxa de quadros.... Em conversão de taxa de quadros, verificar o campo de dizimar por e insira o número do quadro observado anteriormente. Confirme clicando Okey. Clique em arquivo → Exportar → sequência de imagens.
4. Escolha JPEG como formato de saída, defina o diretório para armazenar a salva sequência de imagens e clique Okey.
   Nota: Isto criará um diretório com até 30 imagens do blastocisto gravado em sequência durante a fase de equilibrio da vitrificação.

8. medições de área de seção transversal do blastocisto de imagens criadas durante a fase de equilíbrio

1. Abra o software de análise de vídeo. Clique na guia da janela e selecione a linha do tempo.
2. No painel Timeline, clique no sinal de tira de filme e escolha Adicionar mídia... para adicionar uma imagem do blastocisto antes da fase de equilibrio de vitrificação — e antes da intervenção do laser, se houvesse qualquer.
   Nota: Esta imagem mostrará o blastocisto no seu estado mais expandido e sua área de seção transversal servirá como uma referência.
3. Adicione a sequência de imagem do blastocisto correspondente gerado anteriormente com software de edição de vídeo (da fase de equilibrio de vitrificação).
4. Ir para imagem análise → → → Selecionar pontos de dados personalizado para abrir a janela selecionar pontos de dados .
5. Cancele a seleção de todos os pontos de dados, em seguida, selecione apenas a área e confirme clicando Okey.
6. Mova o controle deslizante cronograma na janela do cronograma para a primeira imagem.
7. Clique na guia da janela e escolha ferramentas.
   Nota: Isto irá ativar o painel de ferramentas do lado esquerdo.
8. Escolha a ferramenta Seleção rápida.
9. Posição do marcador de ferramenta dentro do blastocisto para tocar a borda do blastocisto. Delinear o blastocisto, colocando o marcador da ferramenta na borda externa do blastocisto, clicando e segurando o botão esquerdo do mouse e arrastar o marcador da ferramenta ao longo da borda externa do blastocisto até a área de seção transversal do blastocisto inteiro é selecionado.
   Nota: a Zona pelúcida não é uma parte da medição, por isso deve ser excluído (Figura 5).
10. Na janela Timeline, clique em Log de medição e pressione o botão de Registro de medições .
    Nota: Isto irá gravar a área selecionada.
11. Retorno de volta para a linha do tempo, com o botão direito na imagem e escolha Deselect.
12. Mover o controle deslizante cronograma para a próxima imagem e clique na correspondente telha por baixo.
13. Delinear o blastocisto na nova imagem com a ferramenta Seleção rápida. Repita a medição.
14. Repita este procedimento (etapas 8,9-8,13) imagem por imagem até áreas transversais de todas as imagens são medidas e registadas.
15. No final, vá para o Log de medições, selecione todas as medições sob a área variável e exportá-los em um arquivo. txt.
    Nota: As unidades de área transversal são pixels quadrados.

9. a edição do arquivo de dados, com áreas de seção transversal do blastocisto gravado de imagens criado durante a fase de equilíbrio

1. Transferi os dados das áreas transversais do blastocisto gravado do arquivo. txt para um editor de planilhas.
2. Use o primeira área transversal valor como valor de referência 1 e expressa (transform) valor de referência de todos os outros valores para ser uma fração disso.
3. Criar uma nova variável Area_r e colar os valores de área transcodificado (exceto o valor de referência) sob ele.
4. Junto a variável Area_r, criar uma variável de tempo e adicionar o primeiro valor de tempo.
   Nota: O valor de tempo a primeira representa o tempo que passou desde o momento em que o blastocisto foi exposto para a solução de equilíbrio para o início da gravação sob um microscópio câmera equipada.
5. Calcular cada valor de vez consecutiva a próxima adicionando 20 s para o valor de tempo anterior.
   Nota: Este é o intervalo de tempo usado no dizimando desnecessários quadros de vídeo criados durante a gravação.

10. aquecimento do blastocisto

1. Prepare a mídia para o aquecimento.
   1. Um dia antes do aquecimento o blastocisto, assepticamente dispense três gotas de 150 µ l de meio de recuperação em um prato bem-4. Também, em condições de esterilidade dispense médio de recuperação em um prato de 9-bem microdroplet, especialmente concebidos para microscopia de lapso de tempo e gravação. Cobrir o meio de recuperação com óleo de parafina e preincubate-lo a 37 ° C, com 6% de CO₂ e de 5% O₂.
      Nota: O meio de recuperação é um meio de cultivo de embriões blastocisto com albumina de soro humano (HSA) adicionado. A HSA no meio de recuperação deve ser de 12 mg/mL. Para preencher os buracos no prato 9-bem, use uma pipeta para desnudamento do oócito para evitar a criação de bolhas de ar e, em seguida, sobreposição de área de microdroplet com 30 µ l do meio de recuperação.
   2. No dia do aquecimento o blastocisto, assepticamente dispensar 500 µ l de solução (TS) em um único poço de um prato de 4-poço de descongelar e deixe-o aquecer a 37 ° C numa incubadora sem CO₂.
   3. À temperatura ambiente, dispense assepticamente uma gota de 50 µ l de solução de diluição (DS) e duas gotas de 50 µ l de solução (WS) de lavagem em uma placa de Petri estéril. Cubra os DS e o WS1 e WS2 gotas com óleo de parafina.
      Nota: Em vez de uma placa de Petri, um prato bem-4 também pode ser usado.
2. Aquecer o blastocisto.
   1. Identifica a palha HSV com o blastocisto vitrificado para ser removido do armazenamento de LN e transferir rapidamente a palha para um reservatório portátil cheio de LN em preparação para o processo de aquecimento.
   2. Levantar a palha com fórceps, apenas o suficiente para expor a haste de manipulação de cor. Use um alicate de descarnar auto-ajustáveis para cortar a palha no auge da haste de manipulação de cor.
   3. Pegue a vara de manipulação e extraí-lo da palha com um movimento rápido, ainda controlada e mergulhe imediatamente a espátula curva da haste de manipulação a 37 ° C TS.
   4. Agite suavemente a haste de manipulação para desanexar o blastocisto e deixá-lo para um total de 1 min no TS.
   5. À temperatura ambiente, transfira o blastocisto consecutivamente para DS, WS1 e WS2 por 4 min em cada meio.
   6. Após o procedimento de aquecimento, transferir o blastocisto para um prato de 4-bem com o meio de recuperação e lavá-lo em todos os três gotas pipetando-lo suavemente.
      Nota: A lavagem é feita em cerca de 1 min.
   7. Transferência de blastocisto ao lapso de tempo 9-bom prato com meio de recuperação. Coloque o prato 9-poço sob uma câmera lapso de tempo em uma incubadora (a 37 ° C, com 6% de CO₂ e de 5% O₂).
      Nota: O procedimento de aquecimento Thre, que continua com a colocação do prato de 9-poço sob uma câmera lapso de tempo em uma incubadora, dura aproximadamente 17 min.

11. Time-Lapse gravação da Re-expansão do blastocisto durante a recuperação pós-aquecimento

1. Execute o software de gravação de lapso de tempo.
2. Escolha uma câmera de gravação.
3. Pressione o botão de modo de viver .
4. Coloque o cursor do mouse sobre a imagem e use o botão de rolagem para ampliá-la. Clique e segure o botão esquerdo do mouse e mova o cursor para colocar o poço com o blastocisto no meio da tela.
5. Sob foco, use as setas verdes de cima para baixo para concentrar o avião de gravação do blastocisto. Sob intensidade de luz, defina a intensidade da luz.
6. Clique no botão parâmetros de microscópio para definir o tempo de exposição e gama.
7. Pressione fechar o modo de viver.
8. Pressione o botão iniciar o projeto e inserir os dados de projeto, selecione o tipo de prato de cultura (3x3 ou 4x4) e desmarque todas as posições, exceto aquele a ser gravado.
9. Defina a hora de captura para tirar uma foto a cada 5 min.
10. Inicie a gravação, pressionando o botão de aprovar . Grave pelo menos 150 min.
11. Pare a gravação, pressionando o botão parar o projeto .
    Nota: Consulte os resultados representativos da gravação de um intacto (Figura 3) e um blastocisto recolhido (Figura 4) durante o período de recuperação pós-aquecimento.

12. a edição de vídeo do blastocisto gravado durante a Re-expansão pós-aquecimento

1. Vá para a pasta do projeto e localizar imagens gravadas que são de aproximadamente 80 KB em tamanho.
2. Criar outra pasta e transferir estas imagens para isso. Renomear as imagens em números, de acordo com o tempo criado. Importá-los para o software como uma sequência de imagem de edição de vídeo.
3. Vá para a guia vídeo → filtro → Add e selecione filtro transformar Null .
4. Clique no botão do lado direito recorte e cortar a imagem, deixando visível apenas o campo com o blastocisto gravado. Confirme com Okey e novamente com Okey.
5. Clique em arquivo → Exportar → sequência de imagens. Escolha JPEG como formato de saída, defina o diretório para armazenar a salva sequência de imagens e clique Okey.
   Nota: Isto irá criar imagens redimensionadas (cortadas), preparadas para medições adicionais do software de análise de vídeo.

13. a definição de uma escala de medida em Software de análise de vídeo para as imagens criadas com o Software de gravação de lapso de tempo

1. Execute o analisador do software de gravação de lapso de tempo.
2. Abra o projeto com o blastocisto gravado.
3. Clique no botão analisar no campo com o blastocisto gravado.
   Nota: Uma nova janela de Analyze vai abrir. Clique no botão para mostrar a ferramenta de medição de medição .
4. Use a ferramenta de medição para medir a largura da imagem inteira.
5. Botão direito do mouse na imagem e salvá-lo. Nas propriedades, verificar a largura da imagem em pixels.
6. Divida a largura real da imagem com sua largura em pixels.
   Nota: Isto calcula o comprimento real de um único pixel na imagem.
7. Execute o software de análise de vídeo.
8. Clique na guia da janela e selecione a linha do tempo.
9. No painel Timeline, clique no sinal de tira de filme e escolha Adicionar mídia... para adicionar a sequência de imagem do blastocisto re-expansão pós-quente.
10. Clique imagem análise → → → Definir escala de medida personalizada para abrir a janela de escala de medida. Para comprimento de Pixel, digite 1; para comprimento lógico, insira o comprimento calculado anteriormente real de um pixel (etapa 13,6); para unidades lógicas, digite µm. Salve a predefinição.

14. medições de área de seção transversal do blastocisto de imagens criadas durante o pós-quente Re-expansão

1. Uma vez que a escala de medição é o conjunto e a sequência de imagens importadas, medir áreas transversais do blastocisto da mesma forma como descrito na etapa 8, com a única diferença é que as áreas transversais medidas nestas medições têm unidades em µm² .

15. a edição do arquivo de dados, com áreas de seção transversal do blastocisto gravado de imagens criado durante o pós-quente Re-expansão

1. Transferi os dados das áreas transversais do blastocisto gravado do arquivo. txt para um editor de planilhas.
2. Criar uma variável de tempo junto a variável área e adicionar o primeiro valor de tempo.
   Nota: neste caso, o primeiro valor de tempo é definido como 10 minutos, que é o início da gravação do tempo-lapso. Cada valor de vez consecutiva a seguinte é calculado adicionando-se 5 minutos para o valor de tempo anterior. Cinco minutos é o intervalo de tempo utilizado entre duas gravações de lapso de tempo consecutivas.

16. criação de um diagrama de linha

1. Importe o arquivo de dados de planilha em software de análise estatística para a criação de uma trama de tempo das mudanças de área transversal do blastocisto no tempo durante a fase de equilibrio da vitrificação ou re-expansão pós-aquecimento.

Results

Em uma demonstração, mostramos o blastocisto morfodinâmica em apenas um previtrification e uma fase pós-aquecimento. Uma diferença de volume do blastocisto no final da fase de equilíbrio e no início da recuperação em meio de cultura mostrou a intensidade do encolhimento do embrião, que, de fato, a intensidade da preservação do embrião contra a cristalização do gelo.

Como isso pode ser notado da Figura 1

Discussion

O protocolo para a observação de blastocisto morfodinâmica durante e após a criopreservação também pode ser realizada usando ferramentas de software de outros fabricantes e instrumentos semelhantes. Sistemas de lapso de tempo ajustados para embriologia permitem o monitoramento contínuo do desenvolvimento embrionário. O objetivo deste trabalho foi apresentar a quantificação do comportamento de blastocisto durante a preparação dos blastocistos para vitrificação e após o seu aquecimento. Isto foi feito a medição objetiva de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio invertido Eclipse TE2000-U	Nikon, Japão	/
Saturn 5 Laser System	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Câmera digital DC1	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Câmera digital DC2	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/	software de gravação de microscópio
Incubadora com 6% de CO2, 5% de O2	Binder, Alemanha	/
Primo Microscópio de visão	Vitrolife, Suécia	16600
Primo Vision Software de captura	Vitrolife, Suécia	16608	software de gravação de lapso de tempo
Adobe Photoshop CS6 Software estendido	Adobe Systems Incorporated, EUA/		software de análise de vídeo
VirtualDub	Avery Lee	/	software de edição de vídeo
Microsoft Office Excell	Microsoft, EUA/		editor de planilhas
Prato de cultura PrimoVision	Vitrolife, Suécia	16604
Meio G2-plus	Vitrolife, Suécia	10132	meio de cultivo para embriões em estágio de blastocisto
Albuminas de soro humano	Vitrolife, Suécia	10064
Óleo de parafina	Vitrolife, Suécia	10029
Meio de solução de equilíbrio	Irvine Scientific, Irlanda	90131
Meio de solução de vitrificação	Irvine Scientific, Irlanda	90132
Meio de solução de descongelamento	Irvine Scientific, Irlanda	90134
Meio de solução de diluição	Irvine Scientific, Irlanda	90135
Meio de solução de lavagem	Irvine Scientific, Irlanda	90136
Canudos de vitrificação HSV	CryoBio System, França	025246, 025249, 025250, 025248
Recipiente de nitrogênio líquido	/
criogênico Biosafe 120 MD β	Cryotherm, Alemanha	229286
Tanque criogênico	Cryotherm, Alemanha
Fórceps	/	/
Scisors	/	/
Pippete para manipulação de blastocisto	Gynetics, Bélgica	ID275/10	diâmetro 275 µ m
Pipeta para desnudação de oócitos	Vitromed, Alemanha	V-DEN-135	diâmetro 135 µ m
Pipettor EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
Temporizador de intervalo digital Assistent	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, USA	/	software de análise estatística
Descascador de fios autoajustável	Knipex, Alemanha	1262180