Morfométricos protocolo para a avaliação objetiva do comportamento de blastocisto durante a vitrificação e aquecimento passos

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo morfométricos lapso de tempo para acompanhar a intensidade do encolhimento de blastocisto e re-expansão durante as intervenções de previtrification e recuperação pós-aquecimento. A aplicação do protocolo, é possível em vitro laboratórios fertilização equipados com microscópios de lapso de tempo e recomenda-se no desenvolvimento de um método de vitrificação de blastocistos ideal.

Abstract

Este artigo descreve o método não-invasivo de blastocisto morfometria baseada em microfotografia lapso de tempo para o controlo rigoroso do volume de um blastocisto mudando durante as fases individuais antes e após a vitrificação. O método pode ser útil na busca para o sincronismo mais ideal de exposição de blastocisto a diferentes concentrações de crioprotectores observando o encolhimento de blastocisto e re-expansão em diferentes pré- e pós-vitrificação fases. Com esta metodologia, o protocolo de vitrificação de blastocistos pode ser otimizado. Para uma melhor demonstração da utilidade deste método morfométrico, dois protocolos de preparação diferente blastocisto para vitrificação são comparados; com o uso de um blastocoel artificial em colapso e sem esta intervenção antes de vitrificação. Ambas as variações de volume dos blastocistos são seguidas por lapso de tempo microfotografia e medidas por ferramentas de software de edição de fotos. As medidas são feitas em 20 segundos em fases de previtrification e a cada 5 minutos no período pós-aquecimento. As alterações das dimensões blastocisto por unidade de tempo são apresentadas graficamente em diagramas de linha. Os resultados mostram uma fase de previtrification longo de equilibração, no qual o blastocisto intacto encolhe-se primeiro e então lentamente recargas a blastocoel, entrando em vitrificação com um blastocoel cheio de líquido. O blastocisto artificialmente recolhido permanece na sua fase encolhido pela fase de equilibração inteira. Durante a fase de vitrificação, ele também não altera seu volume. Desde que o blastocisto morfometria mostra um volume constante dos blastocistos artificialmente recolhidos durante a etapa de previtrification, parece que esta etapa pode ser mais curta. O protocolo descrito fornece muitos parâmetros comparativos adicionais de comportamento de blastocisto durante e após a criopreservação em função da velocidade e intensidade das variações do volume, o número de contrações blastocoel parcial ou total blastocisto colapsos e o tempo para um total de blastocoel re-expansão ou o tempo de incubação.

Introduction

Criopreservação de embriões humanos de pré-implantação do in vitro fertilização programa (FIV) hoje em dia é uma prática de rotina na maioria dos laboratórios de fertilização in vitro. O embrião lento congelando o método começou a ser utilizado clinicamente em 1985, com a introdução de crioprotectores específicos e congeladores controlado por computador, que permitiram o resfriamento controlado de embriões até-7 ° C, quando a nucleação de gelo (semeadura) foi induzida na circundante cryoprotective médio¹. Por resfriamento contínuo, iria crescer cristais de gelo, causando a hiperosmolaridade da fração líquida restante e, consequentement....

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Nacional de ética médica em 19 de abril de 2016 (n º 0120-204/2016 – 2).

1. instalação do sistema de gravação de microscópio

1. Desliga a placa de aquecimento do microscópio.
2. Antes de qualquer tratamento, tirar um instantâneo de um blastocisto sob um microscópio invertido câmera equipada. Lembre-se de observar a ampliação na qual foi gravado o blastocisto.

2. seleção e Prepreparation de blastocistos para vitrificação

1. Selecione somente blastocistos dia 5 ou 6-dia totalmente expandidos para Criopreservação com pelo menos al....

Results

Em uma demonstração, mostramos o blastocisto morfodinâmica em apenas um previtrification e uma fase pós-aquecimento. Uma diferença de volume do blastocisto no final da fase de equilíbrio e no início da recuperação em meio de cultura mostrou a intensidade do encolhimento do embrião, que, de fato, a intensidade da preservação do embrião contra a cristalização do gelo.

Como isso pode ser notado da Figura 1

Discussion

O protocolo para a observação de blastocisto morfodinâmica durante e após a criopreservação também pode ser realizada usando ferramentas de software de outros fabricantes e instrumentos semelhantes. Sistemas de lapso de tempo ajustados para embriologia permitem o monitoramento contínuo do desenvolvimento embrionário. O objetivo deste trabalho foi apresentar a quantificação do comportamento de blastocisto durante a preparação dos blastocistos para vitrificação e após o seu aquecimento. Isto foi feito a medição objetiva de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio invertido Eclipse TE2000-U	Nikon, Japão	/
Saturn 5 Laser System	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Câmera digital DC1	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Câmera digital DC2	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/	software de gravação de microscópio
Incubadora com 6% de CO2, 5% de O2	Binder, Alemanha	/
Primo Microscópio de visão	Vitrolife, Suécia	16600
Primo Vision Software de captura	Vitrolife, Suécia	16608	software de gravação de lapso de tempo
Adobe Photoshop CS6 Software estendido	Adobe Systems Incorporated, EUA/		software de análise de vídeo
VirtualDub	Avery Lee	/	software de edição de vídeo
Microsoft Office Excell	Microsoft, EUA/		editor de planilhas
Prato de cultura PrimoVision	Vitrolife, Suécia	16604
Meio G2-plus	Vitrolife, Suécia	10132	meio de cultivo para embriões em estágio de blastocisto
Albuminas de soro humano	Vitrolife, Suécia	10064
Óleo de parafina	Vitrolife, Suécia	10029
Meio de solução de equilíbrio	Irvine Scientific, Irlanda	90131
Meio de solução de vitrificação	Irvine Scientific, Irlanda	90132
Meio de solução de descongelamento	Irvine Scientific, Irlanda	90134
Meio de solução de diluição	Irvine Scientific, Irlanda	90135
Meio de solução de lavagem	Irvine Scientific, Irlanda	90136
Canudos de vitrificação HSV	CryoBio System, França	025246, 025249, 025250, 025248
Recipiente de nitrogênio líquido	/
criogênico Biosafe 120 MD β	Cryotherm, Alemanha	229286
Tanque criogênico	Cryotherm, Alemanha
Fórceps	/	/
Scisors	/	/
Pippete para manipulação de blastocisto	Gynetics, Bélgica	ID275/10	diâmetro 275 µ m
Pipeta para desnudação de oócitos	Vitromed, Alemanha	V-DEN-135	diâmetro 135 µ m
Pipettor EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
Temporizador de intervalo digital Assistent	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, USA	/	software de análise estatística
Descascador de fios autoajustável	Knipex, Alemanha	1262180