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Artigo de método

Um modelo de derrame Pleural em ratos por instilação intratraqueal de poliacrilato/Nanosilica

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DOI:

10.3791/58560

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12 de abril de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Ultrasound Medicine, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, 2Department of Occupational Medicine & Clinical Toxicology, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, 3Department of Emergency, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para construir um modelo de derrame pleural em ratos por instilação intratraqueal de poliacrilato/nanosilica.

Resumo

Derrame pleural é um achado clínico predominante de muitas doenças pulmonares. Ter um modelo útil animal derrame pleural é muito importante para estudar estas doenças pulmonares. Modelos anteriores do derrame pleural prestado mais atenção a fatores biológicos, ao invés de nanopartículas no ambiente. Aqui, apresentamos um modelo para fazer derrame pleural em ratos por instilação intratraqueal de poliacrilato/nanosilica e um método de isolamento de nanopartículas em derrame pleural. Por instilação endotraqueal de poliacrilato/nanosilica com concentrações de 3,125, 6,25 e 12,5 mg/kg∙mL, o derrame pleural em ratos apresentada no dia 3, atingiu um pico de dias 7-10 6,25 e 12,5 mg/kg∙mL grupos, então lentamente diminuiu e desapareceu no dia 14. Quando a concentração de poliacrilato/nanosilica aumentada, o derrame pleural é produzido o mais e mais rápido. Este fluido pleural foi detectado pelo exame de ultra-som ou peito CT varredura e confirmado pela dissecação dos ratos. Nanopartículas de sílica foram observadas em derrame pleural dos ratos por microscópio eletrônico de transmissão. Estes resultados mostraram que a exposição ao poliacrilato/nanosilica leva à indução de derrame pleural, que era consistente com nosso relatório anterior em seres humanos. Além disso, este modelo é benéfico para o um estudo mais aprofundado de nanotoxicology e as doenças de derrame pleural.

Introdução

Derrame pleural é uma manifestação clínica muito comum de doenças pulmonares com uma variedade de causas. Ter um modelo útil animal derrame pleural é muito importante para estudar estas doenças pulmonares, as funções de seu tratamento, os mecanismos de derrame pleural e as duas camadas de membrana pleural. No entanto, alguns relataram que modelos de efusão pleural principalmente focar o derrame pleural maligno ou fatores biológicos, ao invés das nanopartículas no meio ambiente1,2. Aqui, apresentamos um novo modelo de derrame pleural que é simples, seguro e eficaz.

Com o desenvolvimento das nanotecnologias e o uso extensivo de nanoprodutos, há uma preocupação sobre os riscos potenciais de nanomateriais para o ambiente e a saúde humana3,4. Nanomateriais introduzir factores de risco e potencialmente causar danos romance dentro do local de trabalho ou por meio de contaminação ambiental. Estudos in vitro e in vivo mostram que os nanomateriais podem resultar em danos em vários órgãos para os pulmões, o coração, o fígado, o rim e o sistema nervoso, bem como a reprodução e sistema imunológicos5,6. Além disso, alguns estudos relataram que a toxicidade específica dos nanomateriais foi devido a suas propriedades físico-químicas únicas3,4,7.

Informamos que um grupo de trabalhadores com exposição ocupacional aos nanomateriais clinicamente apresentada com efusão pleural e pericárdica, fibrose pulmonar e granuloma8,9. Nanopartículas de sílica foram isoladas em derrame pleural9 estes pacientes. Para reproduzir e verifique se o derrame pleural induzido pelas nanopartículas inaladas em humanos, foi realizado o experimento instilando o poliacrilato/nanosilica (PA/NPSi) através do trato respiratório em ratos, que imitava a respiração humana em um real ambiente e encontrei esse intratraqueal instilação de PA/NPSi poderia resultar em derrame pleural em ratos. Aqui, apresentamos como fazer derrame pleural em ratos por instilação intratraqueal de PA/NPSi e como isolar nanopartículas em derrame pleural. Este modelo pode ser útil para o estudo de mais de nanotoxicology e doenças de derrame pleural.

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Protocolo

O estudo seguiu as diretrizes da Universidade de medicina de Capital (Beijing, PR China) para o cuidado e o uso de animais experimentais. Todos os procedimentos foram aprovados pela Animal ético Comité de Capital Medical University na China.

1. experimentais preparações

Nota: Se aclimatar os feminino específico isentos de organismos patogénicos ratos Wistar (peso: 200 ± 10 g) aos ambientes experimentais para uma semana antes da administração (condições ambientais: luz / escuro: 12h / 12h, temperatura de 22 ± 2 ° C, umidade de 50 ± 10%).

  1. Use um fresco 10ml de suspensões de PA/NPSi (nanosilica Ø:20 ± 5 nm por polimerização in situ emulsão) diluído em solução salina normal em concentrações de 3.125, 6.25 e 12,5 mg/mL, respectivamente,10. Antes da administração, proceda à sonicação as suspensões para 20-30 min e vortex durante 10 minutos para evitar a agregação de nanopartículas.
  2. Divida igualmente um total de 20 ratos em quatro grupos: um grupo para cada concentração de PA/NPSi (0, 3.125, 6.25 e 12,5 mg/mL).
  3. Para anestesia, coloque os ratos em um recipiente fechado com 1,5 mL de éter (99,5%) ou quaisquer outros protocolos IACUC aprovado. Depois de 60-90 s de anestesia, verificar a falta de resposta ao reflexo de pedal. Certifique-se de que os ratos estão respirando.
  4. Colocar o rato anestesiado no quadro e consertar seus dentes da frente com uma linha esterilizada de nylon na placa também.
  5. Abra sua boca e expor sua fissura da glote, com a ajuda de uma pinça cirúrgica e lente frontal.
  6. Incutir os ratos com 0,5 mL de suspensão de PA/NPSi para pulmão de cada rato para um total de 1 mL, usando um tubo fino com uma agulha esterilizada para o brônquio bilateral.
  7. Coloque os ratos em uma placa de plástico em uma posição supina e deixar que os ratos recuperar lentamente em 5-10 min.

2. derrame pleural exame ultra-som

  1. Usar um sistema de ultra-som com um transdutor linear (frequência: 8 MHz) para examinar os ratos em dias 1, 3, 7 e 1410.
  2. Verificar a falta de reflexos pedais e dar anestesia (hidrato de cloral 10%, 0,35 mL/100 g, i.p.) para os ratos.
  3. Remova o cabelo do abdômen, peito e superior dos ratos usando um barbeador elétrico. Em seguida, coloque o rato sobre uma placa de montagem na posição supina.
  4. Cubra a pele com o gel revestido e em seguida, coloque o transdutor no espaço intercostal e subcostal área para detectar o fluido pleural.
    Nota: A fim de detectar a efusão com precisão, a esquerda e as posições de laterais direita foram selecionadas para realizar um exame de ultra-som.
  5. Coloque o rato em uma placa de plástico em uma posição supina após exame ultra-sonográfico e deixar que os ratos recuperar lentamente em 10 min.

3. peito CT varredura para derrame pleural

  1. Na pós-administração dias 7 e 14, anestesia os ratos com hidrato de cloral 10% (IP). Quando o rato não reage a pedalar reflexos considere suficiente profundidade da anestesia.
    Nota: A pós-administração dia 7 é o momento mais adequado para observar o derrame pleural por tomografia.
  2. Coloque o rato sobre uma folha de plástico em posição e depois digitalizar no peito para investigar derrame pleural usando um 64 canais CT. Use as seguintes configurações: configuração de detector de 64 x 0,625 mm, 120 kV (pico) e 350 mAs.

4. coleção de derrame pleural e isolamento de nanopartículas em derrame pleural

  1. Depois peito CT varredura de ratos e sob anestesia de hidrato de cloral, verificar o reflexo pedal dos ratos, raspar o cabelo do abdômen, peito e então desinfectar a pele por iodo.
  2. Trazer os ratos para a área cirúrgica.
  3. Sob anestesia, rapidamente corte 1 a 1,5 cm da pele e músculos abdominais para xifoide ao longo da linha mediana com o diafragma intacta.
  4. Cuidadosamente Abra o baú e inspecionar as cavidades pleurais bilaterais, com a ajuda de uma pinça, especialmente os ângulos frênico costais bilaterais. Colete 1 a 2 mL de derrame pleural luz-amarelo com uma seringa estéril de 2 mL.
  5. Uma vez feito, sacrifica os ratos com protocolo IACUC aprovado.
  6. Centrifugue o derrame pleural em um tubo de 2 mL por 15 min a 300 x g a fim de isolar as nanopartículas.
  7. Use uma gota de camada superior, que é o líquido brilhante e observar sob uma microscope(TEM,) de elétron de transmissão em uma tensão de aceleração de 60-80 kV.

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Resultados

Não usando um ultra-som torácico, encontramos nenhum derrame pleural no dia 1 em todos os grupos. No entanto, no dia 3, o derrame pleural apareceu nos grupos 6,25 e 12,5 mg/kg∙mL. O derrame foi principalmente no ângulo frênico costal direito, enquanto o derrame pericárdico apenas apresentado em 12,5 mg/kg∙mL grupo. Além disso, no dia 7, tanto o derrame pleural (Video 1) e derrame pericárdico (vídeo 2) foram detectados em 6,25 mg/kg∙mL grupo (

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Discussão

Sonografia é a ferramenta mais conveniente para a determinação de doenças pulmonares, devido a sua excelente sensibilidade para o líquido livre na cavidade pleural11. Isso é porque a ecografia pode detectar imediatamente o contraste de impedância acústica de ar e fluidos no pulmão12. Além disso, a ecografia é mais flexível no modelo de um pequeno animal que CT. No entanto, o ar no pulmão refletiu a onda sonora e impedidos de observar as mudanças intrapulmonares após a insti...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

O presente estudo e produção para este artigo foram financiados pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant 81773373, 81172614 e Grant 81441089). Agradecemos o Dr. Jin Yan e Dr. Pan Yujie, do departamento de emergência, Hospital de Chaoyang Beijing e Dr. Qu Peng do departamento de ultrasom medicina, Hospital de Chaoyang Beijing para ajudar com a produção de vídeo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de ultrassom Doppler colorido Acuson S2000Siemens Medical Solutions, Mountain View, CA&
nbsp; Poliacrilato/nanosílicaUniversidade de Fudan, Xangai, Chinafeita por encomenda com nanosílica(20± 5) nm
10% hidrato de cloralBeijing Chemical Works302-17-0
Velocidade da luz 16 tomografia computadorizada espiralGE Healthcare, EUA
Centro Animal Wistar livre de patógenos específicosde Lianhelihua (Pequim, China)Ratos Wistar

Referências

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