Baseados em CRISPR-Cas9 genoma engenharia para gerar modelos Jurkat repórter para a infecção de HIV-1 com Sites selecionados Proviral integração

Resumo

Nós apresentamos um fluxo de trabalho de engenharia do genoma para a geração de novos modelos in vitro para a infecção de HIV-1 que recapitular integração proviral em locais seleccionados genômicas. Segmentação dos repórteres HIV-derivado é facilitada pela manipulação de genoma CRISPR-Cas9-mediada, site-specific. Protocolos detalhados para geração de clone de célula única, triagem e verificação de direcionamento correta são fornecidos.

Resumo

Vírus de imunodeficiência humana (HIV) integra o DNA proviral não aleatoriamente no genoma da célula de acolhimento em sites recorrentes e genômicas hotspots. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a geração de novos modelos in vitro para a infecção pelo HIV com sites de integração genômica escolhido usando tecnologia de engenharia baseados em CRISPR-Cas9 genoma. Com este método, uma sequência de repórter de escolha pode ser integrada em um locus genômico escolhido, alvo, refletindo sites integração clinicamente relevantes.

No protocolo, o design de um repórter de HIV-derivado e escolhendo de uma sequência de site e gRNA de destino são descritos. Um vetor de direcionamento com braços de homologia é construído e transfectado em células Jurkat T. A sequência de repórter é direcionada para o site selecionado genômico por recombinação homóloga, facilitada por uma quebra de dobro-costa Cas9-mediada no local de destino. Clones de célula única são gerados e examinados para segmentação de eventos por citometria de fluxo e PCR. Os clones selecionados são então expandidos, e direcionamento correto é verificado pela PCR, sequenciamento e mancha do Sul. Eventos fora do alvo potencial de engenharia CRISPR-Cas9-mediada do genoma são analisados.

Usando este protocolo, sistemas de cultura de células de novela essa infecção de HIV modelo em sites de integração clinicamente relevantes pode ser gerada. Embora a geração de clones de célula única e verificação de integração de sequência correto repórter são demorados, as linhas clonais resultantes são ferramentas poderosas para analisar funcionalmente a escolha do local de integração proviral.

Introdução

Integração do DNA proviral no genoma hospedeiro após infecção é um passo crítico no ciclo de vida do vírus de imunodeficiência humana (HIV). Após a integração, o HIV persiste, estabelecendo a latência em subconjuntos de células T CD4 + long-lived tais como as células T CD4 + de memória. Integração do HIV parece ser não-aleatória^1,2. Um número de hotspots genômicas com DNA proviral recorrentemente integrado foi detectado em vários estudos através do sequenciamento de sites de integração em indivíduos infectados agudamente e cronicamente^2,3,

Protocolo

1. estratégia de segmentação para genoma engenharia e direcionamento de desenho vetorial (tv)

Nota: O primeiro passo da engenharia do genoma envolve a seleção e geração das ferramentas necessárias para CRISPR Cas9-mediada por segmentação. Selecção de um locus de sítio de integração genômica, escolha do tipo de célula para o direcionamento e design de um repórter de HIV-derivado para integração devem preceder esta etapa. Este protocolo descreve como alvo de um repórter de mínimo de HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA em células Jurkat-alvo. Um gráfico de fluxo de fluxo de trabalho para CRISPR Cas9-baseado em segmentação, geração, triagem ....

Resultados

Neste experimento representativos, optámos por um repórter de HIV-1-derivado mínimo consistindo de um LTR, sequência tdTomato-codificação e sequência de polyA-sinal para dois loci no intron 5 do gene BACH2¹⁷-alvo. Os Locus para o direcionamento foram escolhidos de acordo com a proximidade de sites publicados integração recorrentes encontrados em diferentes estudos primários células T de pacientes infectados pelo HIV^2,

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar modelos de HIV-1-derivado Jurkat repórter com sites de integração proviral escolhido aplicando engenharia CRISPR-Cas9-baseado do genoma.

Vários pontos do protocolo requerem atenção cuidadosa durante a fase de planejamento. Primeiro, o locus ser alvo deve ser escolhido com cuidado, como alguns loci pode ser mais fácil para o alvo do que outros (por exemplo,, dependendo do estado da cromatina da região e o destino de sequências em si). Sequência.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9	Addgene	42230	vetor para expressão de SpCas9 e gRNA
pMK	GeneArt		vetor de expressão de mamíferos para clonagem
de cDNA3.1	Invitrogen	V79020	vetor de expressão de mamíferos para clonagem
BbsI	New England Biolabs	R0539S	enzima de restrição
NEBuilder Hifi DNA Kit de clonagem de montagem	New England Biolabs	E5520S	Kit de clonagem de montagem usado para geração de vetor alvo
Sistema de PCR de precisão TaqPlus	Agilent Technologies	600210	com atividade de revisão usada para amplificação de braços de homologia (etapa 1.2.2.2), verificação do local de integração e sequência repórter (etapa 3.3.3 e 3.3.5), geração de sonda genômica para Southern blot (etapa 3.4.1.5) e análise de eventos fora do alvo (etapa 3.5.4)
Placa de cultura de tecidos de 96 poços (fundo redondo)Placas de	TPP	92097	para revestimento de diluição
Phusion DNA polimerase de alta fidelidade	New England Biolabs	M0530 L	DNA polimerase usada para detecção de eventos de direcionamento (etapa 2.4.2) e geração de sonda específica do repórter para Southern blot (etapa 3.4.1.4)
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D9170	dimetilsulfóxido como PCR solução aditiva
cloreto de magnésio (MgCl2)	Solução de		MgCl2 como aditivo de PCR
Mistura de solução de desoxinucleotídeo (dNTP)	England Biolabs	N0447S	mistura dNTP com 10 mM de cada nt para reações de PCR
5PRIME HotMasterMix	5PRIME	2200400	mistura de PCR pronta para uso usada para triagem de PCR (etapa 3.2.11)
Mini kit de sangue de DNA QIAamp	isolamento e purificação de DNA	Qiagen	51106
Kit de purificação de PCR QIAquick	purificação de PCR	Qiagen	28106
RPMI 1640 sem glutamina	Lonza	BE12-167F	meio de cultura de células
Soro bovino fetal África do Sul Charge	PAN Biotech	P123002	suplemento
de meio de cultura de célulasL-glutamina	Biochrom	K 0282	suplemento de meio de cultura celular
Penicilina/Estreptomicina 10.000 U/mL/ 10.000 µ g/mL	Biochrom	A 2212	suplemento de meio de cultura de células
Gibco Opti-MEM Meio de soro reduzido	Thermo Fisher Scientific	31985062	cultura de células com concentração de soro reduzida otimizado para transfecção
TransIT-Jurkat	Mirus Bio		MIR2125 reagente de transfecção
forbol 12-miristato 13-acetato Sigma-Aldrich		P8139-1MG	cultura de células reagente
Ionomicina	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	reagente de cultura de células
Unidade de filtro acionada por seringa, membrana PES, 0,22 µ m	de filtro SLGP033RB	Millex	para filtração estéril
Incubadora Heracell 150i Incubadora	tecidos	51026280	Thermo Fisher Scientific
Amershan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN1520B	membrana de nylon carregada positivamente para blotting de DNA e RNA
Stratalinker 1800	Stratagene	400072	Reticulador UV
High Prime	Kit	de 11585592001	para marcação de DNA com dCTP radioativo usando oligonucleotídeos aleatórios como primers
illustra ProbeQuant G-50 Micro Colunas	GE Healthcare	28-9034-08	colunas de rotação de cromatografia para purificação de DNA marcado

DNA polimerase cultura de tecidos de New Kit de Kit de meio de Unidade de cultura de Roche