Artigo de método

Triagem de genótipos de algodão para resistência ao nematódeo reniforme

DOI:

10.3791/58577

⸱

2 de maio de 2019

 , 
1Crop Genetics Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Neste artigo

Resumo

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Aqui, um protocolo é apresentado para a seleção não-destrutiva rápida de genótipos do algodão para a resistência do nematóide do reniformes. O protocolo envolve o exame visual das raízes de mudas de algodoeiro infectadas com nematoides para determinar a resposta da infecção. O disparo vegetativo de cada planta é então propagado para recuperar plantas para a produção de sementes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um rápido não-destrutivo reniformes nematódeo (Rotylenchulus reniformis) triagem protocolo é necessário para o desenvolvimento de algodão resistente (Gossypium hirsutum) variedades para melhorar a gestão de nematódeos. A maioria dos protocolos envolve a extração de nematoides Vermiformes ou ovos do sistema radicular do algodão ou do solo de potting para determinar a densidade populacional ou a taxa de reprodução. Essas abordagens são geralmente demoradas com um pequeno número de genótipos avaliados. Uma aproximação alternativa é descrita aqui em que o sistema da raiz é examinado visualmente para a infecção do nematoide. O protocolo envolve a inoculação de plântulas de algodão 7 dias após o plantio com nematoides Vermiformes e a determinação do número de fêmeas presas ao sistema radicular 28 dias após a inoculação. Os dados são expressos como o número de fêmeas por grama de peso de raiz fresca para ajustar para a variação no crescimento radicular. O protocolo fornece um método excelente para avaliar a resistência do hospedeiro-planta associada com a habilidade do nematoide de estabelecer um local da infecção; Entretanto, a resistência que dificulta a reprodução do nematoide não é avaliada. Assim como outros protocolos de triagem, a variação é comumente observada na infecção por nematoides entre genótipos individuais dentro e entre experimentos. Os dados são apresentados para ilustrar o intervalo de variação observado com o protocolo. Para ajustar essa variação, os genótipos de controle são incluídos em experimentos. No entanto, o protocolo fornece um método simples e rápido para avaliar a resistência da planta hospedeira. O protocolo foi usado com sucesso para identificar acessos resistentes do G. coleta de germoplasma arboreum e avalia populações Segregantes de mais de 300 indivíduos para determinar a genética da resistência. Também foi desenvolvido um método de propagação vegetativa para recuperação de plantas para melhoramento de resistência. Após a remoção do sistema radicular para a avaliação do nematoide, o disparo vegetativo é replantado para permitir o desenvolvimento de um novo sistema radicular. Mais de 95% dos brotos tipicamente desenvolvem um novo sistema radicular com plantas atingindo maturidade.

Introdução

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Rotylenchulus reniformis (Linford e Oliveira), comumente referida como o nematoide reniforme, é uma das principais espécies de nematódeos parasitárias presentes nos solos do sudeste dos Estados Unidos1,2,3. O nematoide é um semi-endoparasita obrigatório e sedentário, exigindo que uma planta hospedeira Complete seu ciclo de vida2,4. Os nematoides fêmeas pré-adultos Vermiformes penetram no sistema radicular do hospedeiro para estabelecer um local de alimentação no estele2,3. À medida que o nematódeo alimenta e amadurece, a porção posterior remanescente fora da raiz hospedeira irá inchar sobre a produção de ovos, formando uma forma característica do rim (Figura 1). Rotylenchulus reniformis é capaz de alimentar o sistema radicular de mais de 300 espécies de plantas, incluindo o algodão4. O algodão de Upland (Gossypium hirsutum L.) é amplamente cultivado no sudeste dos Estados Unidos, mas a falta de R. as variedades resistentes de reniformis impedem a gerência2,3do nematóide. Estratégias de manejo como o tratamento de nematicida e a rotação com espécies de culturas não hospedeiras têm sido utilizadas para reduzir o solo R. densidades populacionais de reniformis 5,6, mas as perdas de rendimento de algodão de semente podem geralmente variar de 1 a 5%2. Sintomas de R. a infecção por reniformis pode incluir atordoamento de plantas, crescimento de raízes suprimidos, deficiências nutricionais, aborto de frutos e maturidade tardia2. No entanto, os sintomas podem não ser evidentes devido à uniformidade dos sintomas em todo o campo; Portanto, abordagens para avaliar R. a infecção de reniformis é necessária para identificar e desenvolver variedades resistentes do algodão do Upland. Avaliação de R. a resistência de reniformis no algodão é considerada difícil7, porque o sistema de raiz contaminado pode parecer normal mesmo que a planta possa mostrar sintomas da infecção8.

Um protocolo eficaz da seleção do nematoide é exigido para a identificação de R. reniformis adesões resistentes da coleção do germoplasma do algodão, e para a determinação da genética da resistência para estes acessos. Tal protocolo auxiliará na transferência de genes de resistência para o algodão de terras altas. Vários métodos de bioensaio têm sido utilizados para avaliar R. infecção por reniformis em algodoeiro8,9,10,11,12,13,14,15. Em geral, duas abordagens principais têm sido utilizadas para a identificação de R. genótipos de algodão resistentes ao reniformis . A abordagem mais freqüentemente utilizada envolve a extração de ovos e/ou nematoides Vermiformes de plantas infectadas ou do solo8,11,12,14,15. A metodologia geral para essa abordagem envolve o plantio de sementes para os genótipos de algodão individuais em vasos separados, permitindo que as mudas se desenvolvam por 7 a 14 dias, inoculando as mudas adicionando uma mistura de estádios Vermiformes de R. reniformis ao solo, e permitindo que os nematóides infectem o sistema de raiz para 30 a 60 dias. Em seguida, os nematoides Vermiformes e/ou os ovos são extraídos do sistema radicular infectado de cada planta ou do solo potting. O número de nematoides extraídos ou ovos é então determinado para estimar a densidade populacional e a taxa de reprodução, que são comparadas com os genótipos de controle, a fim de identificar genótipos resistentes.

Uma abordagem alternativa, como aqui descrita, envolve o exame microscopicamente do sistema radicular do algodoeiro que foi infectado com nematoides para determinar o número de nematoides femininos parasitando as raízes,10,16. Semelhante a outras abordagens, os genótipos de algodoeiro são plantados em vasos separados e inoculadas com nematoides Vermiformes aproximadamente 7 dias após o plantio. No prazo de 30 dias após a inoculação, o sistema radicular é retirado das plantas individuais e o solo é enxaguado das raízes. Em seguida, os nematoides anexados ao sistema radicular são manchados com corante alimentar vermelho17, e as raízes são examinadas microscopicamente para determinar o número de sítios de infecção com genótipos de algodão resistentes (identificados com base no número de nematoides por grama de raiz) em comparação com um controle suscetível16. Essa segunda abordagem tem a vantagem de aumentar a taxa de transferência, reduzindo o número de dias necessários para a avaliação e aumentando o número de genótipos individuais avaliados em um único experimento. As metodologias de triagem que avaliam a densidade populacional ou a taxa de reprodução são muitas vezes mais demoradas do que aquelas baseadas em observações visuais dos sinais de infecção7. Entretanto, uma limitação dessa abordagem é que a resistência da planta hospedeira que dificulta a reprodução do nematoide determinada pela produção de ovos não é avaliada13.

Protocolos de triagem para R. a resistência de reniformis destrói frequentemente o sistema da raiz durante a avaliação7 e envolve o tiro vegetativo que está sendo Descartado. Para superar essa limitação, foi desenvolvido um método de propagação vegetativa para permitir a recuperação de plantas para a produção de sementes18. Após a remoção do sistema radicular para a avaliação do nematoide, o disparo vegetativo é plantado em solo de potting para permitir que o sistema radicular se recupere. Este método tem amplas aplicações para a maioria R. protocolos de triagem de reniformis . Um método simples e rápido de propagação vegetativa é de importância crítica para a reprodução de R. as variedades resistentes do algodão do Upland de reniformis , onde a recuperação da progêia é exigida para avançar genótipos resistentes à geração seguinte.

Um protocolo é apresentado para a seleção em grande escala de genótipos do algodão para a resistência do nematóide do reniformes. O objetivo é desenvolver um método simples e rápido de triagem não destrutiva para avaliar populações de reprodutores de algodão para resistência a nematódeos, a fim de auxiliar na criação de variedades resistentes de algodão de terras altas. Utilizando este protocolo, os dados são tipicamente obtidos dentro de 35 dias, com mais de 300 genótipos avaliados em um único experimento. Os dados são apresentados para genótipos resistentes e suscetíveis para ilustrar a variação comumente observada com esses métodos.

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Protocolo

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1. manutenção de uma fonte de R. reniformis Inóculo

  1. Encha os potenciômetros da argila do terracota do Terra (15 cm no diâmetro, 13,5 cm na altura) com uma mistura pasteurizada vapor do Loam arenoso de 1 parte e da areia de 2 porções. Plante um tomate suscetível (Solanum Lycopersicon) variedade em cada potenciômetro e coloc os potenciômetros em uma estufa.
    Nota: outras variedades de plantas suscetíveis, como o algodão, podem ser usadas em vez de tomate.
  2. Inocular as plantas de tomate com nematoides Vermiformes reniformes (ver passo 3,3). Manter as plantas na estufa a uma temperatura de aproximadamente 28 ° c.

2. plantio de genótipos de algodão para R. reniformis Avaliação da resistência

  1. Prepare o solo combinando a areia fina de 2 porções com o Loam arenoso de 1 parte coletado do campo.
  2. O vapor pasteurizar a mistura do solo para assegurar-se de que o solo esteja livre dos nematóides e dos micróbios patogénicos solo-carregados da planta.
  3. Adicione a mistura do solo a potes de plástico cônicos (4 cm de diâmetro, 21 cm de altura). Antes de encher os potes, coloque uma bola de algodão na parte inferior do pote para evitar a perda de solo. Encha parcialmente os potenciômetros com o solo aproximadamente 2 cm da parte superior.
  4. Prepare uma estaca plástica para cada pote para designar o genótipo a ser plantado.
  5. Sementes de plantas de genótipos de algodoeiro selecionadas para avaliação.
    1. Plantar uma única semente em cada pote para a avaliação de populações Segregantes, em que cada semente representa um genótipo único.
    2. Para as variedades de algodão ou acessos de germoplasma, plantar 2 a 3 sementes em um único pote para garantir a germinação de pelo menos uma planta com as outras mudas removidas dos vasos antes da inoculação do nematódeo.
      Nota: Alternativamente, as sementes podem ser germinadas por 24 a 72 h antes do plantio para minimizar o número de vasos com sementes não viáveis.
  6. Sementes de plantas de genótipos de controle resistentes e suscetíveis selecionados.
    Nota: os genótipos de controle são replicados de 5 a 10 vezes para avaliar as variações naturais inerentes à metodologia de triagem.
  7. Encha os potenciômetros com solo adicional para cobrir a semente em cada potenciômetro.
  8. Coloque os potes na câmara de crescimento. Manter uma temperatura constante de 28 ° c, uma temperatura do ar ambiente, para a câmara de crescimento. Fornecer iluminação artificial com uma mistura de lâmpadas fluorescentes e incandescentes com um fotoperíodo de 16 h.
  9. Coloc emissores de água em cada potenciômetro, e molhe os potenciômetros duas vezes por o dia usando um sistema molhando automático. Ajuste o sistema molhando para fornecer a água adicional enquanto a planta cresce.

3. inoculação de nematódeos de plantas de algodão e preparação de amostras de raízes

  1. Extrato de nematoides Vermiformes reniformes mantidos em plantas de tomate sensíveis (ver etapa 1) usando elutriation19 e flotação centrífuga20 metodologias no dia anterior à inoculação. Conservar os nematoides extraídos a 4 ° c.
    Nota: a extração21 do funil de Baermann é um método alternativo para a extração do nematoide.
  2. Determine o número de nematoides extraídos contando o número de nematoides em uma subamostra de 100 μl e prepare uma suspensão de 1.000 nematóides/ml em água da torneira para inoculações.
  3. Inocular as mudas de algodoeiro 7 d após o plantio com a suspensão de nematódeos. Crie uma pequena depressão no solo ao lado da planta, e Pipete 1 mL da suspensão do nematódeo reniforme para a depressão.
  4. Retire as plantas dos vasos 28 d após a inoculação para avaliação do nematoide.
    Nota: nesta fase, as plantas têm aproximadamente 15 cm de altura com 4 a 6 folhas totalmente expandidas.
    1. Remova a maioria das folhas inteiramente expandidas das plantas usando a tesoura antes de remover as plantas dos potenciômetros.
    2. Para remover plantas dos potenciômetros, esprema o potenciômetro e deslize o solo para fora na mão.
    3. Remova delicadamente o solo das raizes agitando o sistema da raiz na água da torneira em um recipiente de 10 litros. Enxague brevemente o sistema radicular em um recipiente de água da torneira limpa.
    4. Retire o sistema radicular da planta aproximadamente 1 cm abaixo da linha do solo usando tesouras.
  5. Coloque o sistema radicular em um recipiente de amostra descartável, não estéril e plástico de 120 mL, juntamente com a estaca plástica do pote usado para identificação.
    Nota: várias amostras são processadas antes de prosseguir para a etapa 3,7. Prossiga para a etapa 4 para a propagação vegetativa da parte aérea da planta.
  6. Prepare uma solução de 12,5% (v/v) de corante alimentar vermelho17 em água da torneira para manchar os nematóides anexados ao sistema radicular.
  7. Adicione aproximadamente 30 mL da solução de coloração de alimento vermelho à amostra de raiz no recipiente de amostra para cobrir completamente o sistema radicular.
  8. Coloque o recipiente do espécime em um forno de microondas e aqueça a amostra da raiz até que a solução de coloração comece a ferver. Retire a amostra do forno de microondas e deixe a amostra arrefecer à temperatura ambiente.
  9. Decantar a solução corante corante vermelho da amostra de raiz e adicionar aproximadamente 100 mL de água da torneira para o recipiente de amostra para remover o excesso de mancha. Coloque a tampa no recipiente de amostra e guarde a amostra num frigorífico a 4 ° c. Prossiga para a etapa 5 para avaliação da infecção radicular.
    Nota: o protocolo pode ser pausado aqui antes de prosseguir para a etapa 5.

4. propagação vegetativa para recuperação de plantas para produção de sementes

  1. Coloc uma esfera do algodão na parte inferior de um potenciômetro plástico cônico (veja a etapa 2,3) e encha parcialmente o potenciômetro com os meios do potting do musgo de turfa. Em seguida, coloque o tiro vegetativo no pote e adicione firmemente o potting Media para encher o pote. Coloque uma nova estaca plástica rotulada em cada pote para designar o genótipo de algodão.
  2. Coloque a bandeja de potes em um recipiente de plástico (73,6 cm de comprimento x 45,7 cm de largura x 15,2 cm de altura) com água e, brevemente, molhe as plantas para umedecer os meios de potting. Coloque os potes em uma câmara de crescimento com uma temperatura constante de 28 ° c usando um fotoperíodo de 16 h. Adicione a água adicional ao recipiente plástico como necessário para manter a umidade do solo.
  3. Transplantar as plantas aos potenciômetros maiores para a produção da semente após aproximadamente 30 d. encha parcialmente um potenciômetro plástico de 6 litros com meios do potting (veja a etapa 4,1), remova a planta do potenciômetro pequeno, coloc a planta no potenciômetro de 6 litros, e adicione firmemente meios do potting para encher o potenciômetro.
  4. Coloc as plantas em um Glasshouse e adicione a água para umedecer os meios do potting. Manter a temperatura na estufa a aproximadamente 28 ° c (a iluminação artificial não é necessária).
    1. As plantas de água à mão como necessário para aproximadamente 30 d.
    2. Quando aproximadamente 75% das plantas exigem molhar diário, plantas de água diárias usando um sistema molhando automático. Ajuste o sistema molhando automático à água mais freqüentemente como necessário para o crescimento de planta.
    3. Adicione aproximadamente 10 g de um fertilizante de liberação lenta a cada pote antes do início da iniciação floral.
  5. Colher plantas na maturidade e processar as amostras da semente do algodão para obter sementes para uma avaliação mais adicional.
    1. Para colher sementes de algodão, retire o algodão dos cápsulas abertos na planta com a mão e coloque-o em um saco de papel rotulado. As sementes são unidas às fibras do algodão, que são removidas nas seguintes etapas.
    2. Remova as fibras de fiapos das amostras de semente usando um gin de laboratório de 10 serras.
    3. Remover fibras de fuzz das amostras de sementes usando ácido sulfúrico concentrado. Neutralize amostras da semente em uma solução de 15% (v/v) do carbonato de sódio, enxague as amostras com água da torneira, e seque as amostras em um secador de ar forçado.
    4. Coloque as amostras de semente em envelopes rotulados para armazenamento.

5. avaliação de R. reniformis Infecção da raiz

  1. Remova a amostra de raiz do recipiente de amostra e conte o número de nematoides femininos anexados ao sistema radicular usando um estereomicroscópio (ampliação de 20X).
    Nota: apenas os nematoides reniformes femininos são capazes de infectar raízes de plantas.
  2. Coloque o sistema radicular em toalhas de papel por aproximadamente 10 min para remover o excesso de umidade. Pesar o sistema radicular para determinar o peso da raiz fresca.
  3. Entrar a contagem de nematódeos e dados de peso de raiz fresca em um programa de planilha de computador e calcular o número de fêmeas por grama de raiz.

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Resultados

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A infecção por Rotylenchulus reniformis do sistema radicular para duas variedades é apresentada na Figura 1. Relativamente menos nematóides reniformes fêmeas são capazes de estabelecer um local de alimentação para o genótipo de algodão resistente em comparação com o genótipo suscetível. A variação no crescimento radicular é comum entre os acessos, como ilustrado na Figura 2. Essa variação medida pelo peso da raiz fresca ...

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Discussão

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É necessário um protocolo de triagem eficaz para 1) a identificação de R. genótipos de algodão resistentes à reniformis , a fim de avaliar a genética da resistência e 2) a criação de variedades resistentes. A maioria dos protocolos avalia R. densidades populacionais de reniformis ou taxas de reprodução por extração de nematoides Vermiformes ou ovos do sistema radicular do algodão ou do solo potting8,11,

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi financiada pelo departamento de agricultura dos Estados Unidos, serviço de pesquisa agrícola. Menção de nomes comerciais e produtos comerciais neste artigo são exclusivamente para fins de fornecer informações específicas e não implicam recomendações ou endossos pelo departamento de agricultura dos EUA. USDA é um provedor de oportunidades iguais e empregador. Os autores não têm conflito de interesse em declarar. A assistência técnica foi fornecida pela Kristi Jordan.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ray Leach EmpreiteiroStuewe and Sons Inc.SC10U
Stuewe and Sons Inc.RL98
Lixevárias
bolas de algodãovárias
etiquetas de plantas Pylon 4 polegadas (4 in L x 5/8 in W)Pylon PlaticsL-4-WQualquer marca ou fornecedor é aceitável.
Recipientes de amostra de 4 oz.Fisher Scientific16-320-731Qualquer marca ou fornecedor é aceitável.
Corante alimentar vermelhoMcCormick & Co., Inc.
1 mL de pontas de pipetavários
recipientes de 10 Lváriosbaldes baratos funcionam bem.
Vasos de 6 LSuprimentos para berçário Inc.Poly-Tainer-Can No2AQualquer marca ou fornecedor é aceitável. Diferentes tamanhos de vasos podem ser usados
Meios de envasamentoSun Gro HorticultureMetro-Mix 360Qualquer marca ou fornecedor é aceitável.
FertilizanteEverris NA Inc.Osmocote PlusQualquer marca ou fornecedor é aceitável.
Recipiente de plástico (73,6 cm C x 45,7 cm L x 15,2 cm P)Rubbermaid3O29 Qualquer marca ou fornecedor é aceitável.
Bandeja de cone-tainer

Referências

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