Um protocolo detalhado para a aplicação a clique química assistida RNA-interactome captura (CARIC) estratégia para identificar proteínas obrigatório para ambos os de codificação e não-codificante RNAs é apresentado.
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Artigo de método
Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma abrangente identificação das proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) é a chave para entender a rede reguladora posttranscriptional nas células. Uma estratégia amplamente utilizada para a captura de RBP explora a poliadenilação [poli] de RNAs de alvo, que ocorre principalmente em eucarióticos mRNAs maduros, deixando a maioria das proteínas de ligação de non-poly(A) RNAs não identificado. Aqui descrevemos os procedimentos detalhados de um método recentemente relatado denominado clique química assistida RNA-interactome captura (CARIC), que permite a captura de todo o transcriptoma do RBPs tanto poli e non-poly(A) combinando a rotulagem metabólica do RNAs, na vivo UV do cross-linking e opaco de marcação.
Introdução
O genoma humano é transcrito em vários tipos de codificação e não-codificante RNAs (ncRNAs), incluindo os mRNAs, rRNAs, os tRNAs, pequenos RNAs nucleares (snRNPs), pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs) e tempo não-codificantes RNAs (lncRNAs)1. A maioria destes RNAs possuem roupas de RBPs e funciona como ribonucleoprotein partículas (RNPs)2. Portanto, uma identificação abrangente do RBPs é um pré-requisito para a compreensão da rede regulamentar entre RNAs e RBPs, que está implicada em várias doenças humanas3,4,5.
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Protocolo
Cuidado: Quando aplicável, os reagentes utilizados devem ser comprados na forma de RNase-livre, ou dissolvidos em RNase-livre, solventes (na maioria dos casos, em pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-água tratada). Ao manusear amostras do RNA e reagentes RNase-livre, sempre use luvas e máscaras e alterá-los com frequência para evitar contaminação de RNase.
1. preparação de lisado de metabolicamente rotulado e reticuladas células UV
-
Incorporação metabólica da UE e 4SU
- Células HeLa de cultura em modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U/mL penicilina e est....
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Resultados
São apresentados os resultados representativos das etapas de controle de qualidade. Os resultados incluem figuras da análise de fluorescência em-gel descrito na etapa 2.3.2 (Figura 1), a análise ocidental do borrão descrito na etapa 4.1.3 (Figura 2A) e a análise é de coloração prata descrito na etapa 4.2.2 (Figura 2B). As etapas de controle de qualidade são essenciais para a otimização de protocolos .......
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Discussão
A manutenção da integridade de RNA justa é uma das chaves para experiências bem sucedidas de CARIC. Com ligantes apropriadas de Cu(I) e operação cuidadosa, degradação de RNA pode ser significativamente reduzida, embora tenha sido observada degradação parcial. As taxas de substituição da UE e 4SU em amostras experimentais são 1,18% e 0,46%, respectivamente (dados não mostrados). Para RNAs intactas com um comprimento de 2.000 nt, ~ 90% de RNAs conter pelo menos um da UE e um 4SU. Para parcialmente degradadas RNAs com um co.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pelo nacional ciências naturais Fundação de China bolsas 91753206, 21425204 e 21521003 e pelo nacional chave de pesquisa e desenvolvimento do projeto 2016YFA0501500.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Meio de Águia Modificado de Dulbecco) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Soro Fetal Bovino) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penicilina & Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| UE (uridina 5-etinil) | Wuhu Huaren Co. | CAS: 69075-42-9 | |
| 4SU (4-tiouridina) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10 × PBS (solução salina tamponada com fosfato) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Reticulador UV | UVP | CL-1000 | Equipado com lâmpada UV de 365 nm |
| DEPC (pirocarbonato de dietila) | Sigma Aldrich | D5758 | Para tratar a água. Altamente tóxico! |
| Tris· HCl, pH 7,5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| Coquetel de inibidores de protease sem EDTA | Thermo Fisher Scientific | 88265 | Um comprimido para tampão de lise de 50 mL. |
| LDS (dodecil sulfato de lítio) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| Tubo de ultrafiltração de 15 mL (corte de 10 kDa) | Millipore | UFC901024 | |
| 0,5 mL (corte de 10 kDa) | Millipore | ||
| estreptavidina | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimetilsulfóxido) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| a química do clique da Azide-biotina | utiliza ferramentas | AZ104 | |
| sulfato de cobre (II) Sigma | Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amina] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| ascorbato de sódio | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Clique ferramentas a química | AZ118 | |
| Tampão de amostra LDS (4 vezes;) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (dodecil sulfato de sódio) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Éter oleílico de polioxietileno (20)] | J& K | 315442 | |
| Trietanolamina | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Uréia | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroilsarcosina sal de sódio) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotina | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Desoxicolato de sódio | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Versão: 1.5.5.1 |
Referências
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T.
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Reimpressões e permissões
