Method Article

Um método de Micro-CT-baseado para caracterizar as lesões e localização de eletrodos nos cérebros de animais pequenos

DOI:

10.3791/58585

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November 8th, 2018

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1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Center for Brain Science, Harvard University, 3Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, 4Institute of Science and Technology Austria

In This Article

Summary

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Este artigo descreve um método simples para preparar pequenos cérebros de animais para a imagem latente de micro-CT, nas quais as lesões podem ser quantificadas e eletrodos localizados com elevada precisão no contexto do cérebro inteiro.

Abstract

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Verificação de localização de lesão e eletrodo são, tradicionalmente, feito através de exame histológico de fatias de cérebro coradas, um procedimento demorado que requer avaliação manual. Aqui, descrevemos um método simples, direto para quantificar as lesões e localização de eletrodos no cérebro que é menos trabalhoso e gera resultados mais detalhados. Todo cérebro é manchado com tetróxido de ósmio, em resina e fotografado com um scanner de micro-CT. Os exames resultam em 3D Digitas volumes dos cérebros com resoluções e espessuras de seção virtual dependentes do tamanho da amostra (12 – 15 e 5-6 µm por voxel para rato e zebra finch cérebros, respectivamente). Lesões superficiais e profundas podem ser caracterizadas e único tetrodes, matrizes tetrode, lesões eletrolíticos, e sondas de silicone também podem ser localizadas. Software livre e proprietário permite experimentadores examinar o volume da amostra de qualquer avião e segmento o volume manualmente ou automaticamente. Porque esse método gera volume todo cerebral, lesões e eletrodos podem ser quantificados para um grau muito maior do que nos métodos atuais, que vai ajudar a padronizar as comparações dentro e através de estudos.

Introduction

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Os neurocientistas têm confiado em lesões por um longo tempo para entender a relação entre função e localização no cérebro. Por exemplo, nosso entendimento de como sendo indispensável para a aprendizagem e memória hipocampo e do córtex pré-frontal como sendo a chave para controlar os impulsos eram ambos os produtos de lesões acidentais em seres humanos1,2. O uso de modelos animais, no entanto, permitiu que os neurocientistas aproveitar o poder das lesões, indo além da serendipidade, e a função de inúmeras áreas do cérebro tem sido elucidada através de estudos sistemáticos das relações estrutura-função através ....

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Protocol

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Todo cuidado e manipulação experimental de animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de utilização e cuidados Animal institucionais de Harvard. A perfusão descrito aqui é específico para ratos, mas o procedimento é aplicável a todos os animais com cérebros menores ou similarmente feito sob medidos.

1. perfusão

  1. Prepare 1 x tampão fosfato salino (PBS). Para um rato (idade: 0,5-1,5 anos de idade, peso: 250-600 g), 800 – 1.000 mL deve ser suficiente. Use 400 mL para perfundir o animal e um adicional de 400 mL para diluir o fixador.
  2. Prepare o fixador consistindo de 2% (p/v) paraformaldeído (PFA) e 2,5% (p/v) de glutarald....

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Results

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Tradicionalmente, cérebros são seccionados e manchados para quantificar as lesões e localizar os eléctrodos, mas esse método é propenso, trabalhoso e normalmente requer a estimativa dos resultados. Preparando o cérebro inteiro para a imagem latente de micro-CT, a probabilidade de danificar as amostras é muito reduzida, características de interesse podem ser analisadas no contexto do cérebro inteiro e o método presta-se para processamento paralelo de muitas amostras, consideravelmente acel.......

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Discussion

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A seguir, são passos críticos para o protocolo: em primeiro lugar, o uso de uma combinação de PFA e GA para perfundir o animal e posteriormente fixar o cérebro foi fundamental para alcançar penetração consistente ósmio total do tecido. Embora não podemos testar isso explicitamente, uma explicação plausível é que a fixação de PFA é reversível15, Considerando que a fixação de GA não é reversível16,17. Porque uma incubação de duas semanas em .......

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Os autores agradecer Greg Lin e Arthur McClelland seus conhecimentos com o micro-CT máquina, David Richmond Hunter Elliott na imagem e núcleo de análise de dados (IDAC) na Harvard Medical School para seu conselhos de processamento de imagem e William Liberti em Boston Universidade para graciosamente, fornecendo um cérebro zebra finch. Este trabalho foi realizado em parte no centro para sistemas de nanoescala (CNS), um membro do nacional nanotecnologia coordenada infra-estrutura de rede (NNCI), que é apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob prêmio NSF n º 1541959. CNS é uma parte da Universidade de Harvard. Este trabalho foi apoiado pelo Richard e Susan Smith Fami....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Paraformaldeído (PFA)Ciências de Microscopia Eletrônica (EMS)157102% (p / v /) em 1X PBS
Glutaraldeído (GA)EMS162202,5% (p / v) GA em 1x PBS
OsO4< / sub>EMS19190Trabalho em capela de exaustão
EtanolDecon LabsKoptec140, 190, 200 prova
AcetonaEMS10015Resina
Durcupan ACMSigma-Aldrich44610Componentes A, B, C e D, resina para incorporação
Moldes descartáveisTed Pella27114Água milliQ sugerida
(água ultrapura)Millipore SigmaQGARD00R1 (ou purificador relacionado)Parafilme sugerido
(filme de parafina)Millipore SigmaP7793Filme de parafina sugerido
Scanner de micro-CTNikon Metrology Ltd., Tring, Reino UnidoX-Tek HMS ST 225Usado pelos autores
Software para visualizar e analisar micro-CTs:
Volume GraphicsVG Studio MaxUsado pelos autores
FEI / Thermo ScientificAvizoUsado pelos autores
FEI / Thermo ScientificAmirasemelhante a Avizo
Mark Sutton & Russell GarwoodSpiersFree, http://spiers-software.org/
Pixmeo SarlOsirix Lite Free, https://www.osirix-viewer.com/
Open SourceFIJIFree, https://fiji.sc/
AdobePhotoshopBom para analisar uma fatia de cada vez
destilada em vidro

References

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  1. Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
  2. Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994)....

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