Reconhecimento de objetos novos e localização de objeto comportamental testes em ratos em um orçamento

Summary

Aqui nós fornecemos um protocolo que inclui instruções abrangentes para o estabelecimento econômico da localização de murino objeto e objeto romance reconhecimento testes comportamentais, incluindo o custo, projeto e construção de equipamentos necessários, bem como execução de testes comportamentais, coleta de dados e análise.

Abstract

Testes comportamentais ethologically relevante são um componente crítico de qualquer estudo que utiliza modelos de rato para estudar os efeitos cognitivos de várias alterações fisiológicas ou patológicas. A tarefa de localização de objeto (OLT) e a tarefa de reconhecimento de objeto romance (NORT) são duas tarefas comportamentais eficazes comumente usadas para revelar a função e saúde relativa das regiões específicas do cérebro envolvidas na memória. Enquanto ambos destes testes exploram a preferência inerente dos ratos para a novidade revelar a memória para anteriormente encontraram objetos, o OLT principalmente avalia a aprendizagem espacial, que depende muito da atividade do hipocampo. O NORT, em contraste, avalia a aprendizagem não-espaciais da identidade de objeto, que se baseia em várias regiões do cérebro. Ambas as tarefas exigem uma arena aberta--testes de campo, objetos com equivalente valor intrínseco para os ratos, pistas ambientais adequadas e equipamentos de gravação de vídeo e o software. Sistemas comercialmente disponíveis, enquanto conveniente, podem ser caros. Este manuscrito detalha um método simples e econômico para a construção das arenas e configurar o equipamento necessário para realizar o OLT e NORT. Além disso, o manuscrito descreve um protocolo de teste eficiente que incorpora tanto OLT e NORT e fornece métodos típicos para aquisição de dados e análise, bem como resultados representativos. Conclusão bem sucedida destes testes pode fornecer insights valiosos sobre a função de memória de vários sistemas de modelo de rato e avaliar as regiões neurais subjacentes que oferecem suporte a essas funções.

Introduction

Testes cognitivos eficazes isolar e avaliar a função neural de regiões específicas do cérebro, examinando o comportamento em um ambiente controlado¹. Em humanos, tarefas específicas foram projetadas para avaliar o desempenho das regiões alvo do cérebro, tais como o cartão de Wisconsin triagem tarefa para função pré-frontal ou os associados emparelhados aprendizagem teste da (Cambridge neuropsicológica teste automatizado da bateria CANTAB) para função hippocampal^2,3. Estes testes são projetados para estudar as funções das regiões específicas do cérebro em humanos avaliando comportamentos que resultam da atividade neural dessas regiões. O objetivo final da pesquisa biomédica mais é a melhoria da saúde humana; no entanto, muitos estudos da função cerebral em saúde ou doença não podem ser eticamente executados com participantes humanos. Para estudos que não podem usar os participantes humanos, pequenos roedores como os ratos são, muitas vezes, o modelo de escolha. Usar modelos de mouse permite o controle direto sobre manipulações experimentais, incluindo alteração da expressão genética, indução de lesão ou até mesmo modulação da atividade de circuito através de técnicas de optogenetic. Teste comportamental de ratos, semelhantes à experimentação humana, tem por objetivo avaliar o efeito das variáveis experimentais na função cerebral, medindo-se comportamentos que dependem de regiões específicas.

O hipocampo é uma estrutura essencial para a formação da memória em seres humanos e roedores⁴. Mais especificamente, o hipocampo desempenha um papel crítico na memória declarativa, envolvendo representações relacionais, mas a memória não processual, que conta com os motor centros do cérebro⁴. Função de memória hipocampo tem sido um foco de estudo em muitos campos da neurociência, porque é requintadamente sensível à perturbação. Perturbações negativas variando de estresse prolongado e envelhecimento para convulsões e acidente vascular cerebral estão associadas com danos hippocampal⁵. Em contraste, as intervenções positivas, tais como a interação social, enriquecimento ambiental físico ou exercício, melhoram a função hippocampal^6,7,8. Estudos de roedores com testes adequados de memória hipocampo podem revelar insight sobre os mediadores celulares e moleculares da memória, bem como os efeitos das diferentes intervenções ambientais em função do hipocampo.

Em roedores, vários testes foram desenvolvidos para estudar o hipocampo-dependente da aprendizagem e memória de^10,9,11. Eles em geral podem ser subdivididos em tarefas que exigem um estímulo com Valência emocional para provocar uma mudança de comportamento e tarefas que desenhar sobre a preferência de roedor para investigar novos estímulos¹¹. Por exemplo, medo contextual condicionado, pares de um estímulo desagradável (choque de pé) com um contexto ambiental e, posteriormente, testes de memória para o contexto medindo induzida por medo congelante comportamento^9,11. O labirinto de água de Morris e sua contraparte seco, o labirinto de Barnes, usam reforço negativo externo para promover a aprendizagem espacial^4,11. Em cada caso, roedores procuram escapar de uma situação em contrário, ser imerso em água fria ou expostos em uma plataforma bem iluminada, respectivamente. O labirinto de braço radial, em contraste, se baseia em reforço positivo como animais usam natural comportamento de forrageamento, juntamente com a memória espacial para recuperar alimentos pequenas recompensas^4,11. Essas tarefas são amplamente utilizadas e produziram conhecimento fundamental sobre memória hipocampo. No entanto, negativos e positivos de reforços externos ou medo de indução estímulos como choque adicionem um componente emocional para estes comportamental testes que em alguns casos pode ser indesejável. Por exemplo, o hipocampo dorsal e ventral é associados com funções distintas, memória espacial contra Regulamento emocional, respectivamente,¹². Testes que dependem de uma resposta emocional a estímulos podem não refletir com precisão memória espacial prejudicada se Regulamento emocional hipocampo ventral funções também são afetadas.

O OLT é um teste simples e eficaz que fornece uma medida de memória espacial do hipocampo-dependente¹³. A tarefa depende de preferência intrínseca de um animal de novidade sem reforço externo adicional e pode, portanto, normalmente evitar complicações associadas a respostas emocionais diferencial¹³. O presente protocolo para OLT é apresentado para os ratos, mas também é eficaz em ratos se as dimensões dos equipamentos são dimensionadas adequadamente. O protocolo consiste em aclimatar um mouse para uma arena aberta--testes de campo e em seguida, permitindo-lhe investigar 2 objetos em relação espaciais pistas ambientais. O mouse, em seguida, é removido da arena, e durante um atraso (intervalo inter julgamento ou ITI), um dos objetos é movido. Após o ITI, o mouse é reintroduzido para a arena e permissão para explorar livremente. Em geral, os ratos preferem a novidade, e se eles se lembram a localização dos objetos de sua exposição inicial, eles vão passar mais tempo investigando o objeto movido. Animais com lesões hippocampal tem comprometido o espacial aprendizagem contextual e consequentemente não demonstram nenhuma preferência por objetos na novela localização^14,15.

O OLT pode ser usado independentemente ou em combinação com um ensaio adicional de memória que desenha na atividade neural de várias regiões do cérebro, a tarefa de reconhecimento de objeto romance (NORT). O NORT é idêntico do OLT até a fase de teste, quando um dos objetos é substituído por um novo objeto em vez de ser movido para um novo local. Como é o caso com o OLT, ratos com boa memória dos objetos espontaneamente preferem investigar o objeto do romance. Em contraste com a memória de localização do objeto, que se baseia fortemente em substratos hippocampal, memória de reconhecimento de objeto parece confiar em uma variedade de regiões do cérebro e o envolvimento do hipocampo é instável. Muitos estudos relatório que lesões hippocampal ou inactivação não afetam romance objeto preferência^10,13,16,17, enquanto outros acham o oposto de^18,19. No entanto, ainda é uma tarefa comumente usada para avaliar a função de memória geral em roedores.

O protocolo apresentado aqui delineia as etapas envolvidas no Iniciar e executar o OLT e NORT, ambos que usam uma arena aberta--testes de campo. Equipamento de teste comportamental comercialmente disponível pode ser custo proibitivo, particularmente para laboratórios menores. Este protocolo inclui a concepção e os passos simples para construir arenas in-house, a um custo mínimo e sem ferramentas especializadas. Além disso, este protocolo detalha a área de testes comportamental ideal, incluindo a colocação de arenas, pistas contextuais e sistema de gravação de vídeo que prepara o palco para a implementação dos protocolos OLT e NORT. São apresentados resultados representativos para estudos de sucesso, bem como falhos, enfatizando a importância da otimização de todos os materiais e procedimentos para cada estudo.

Descrição	Opção	Quantidade
Parte r: folha acrílica - branco opaco (0,635 cm x 40 cm x 40,64 cm)	Roteado bordas	2
Parte b: folha acrílica - branco opaco (0,635 cm x 40 cm x 41.91 cm)	Roteado bordas	2
Parte c: folha acrílica - branco opaco (0,635 cm x 41,91 cm x 41.91 cm)	Roteado bordas	1
Acryllic cimento (1 pt).	AT	1
Aplicador de hipo calibre 16	AT	1
Praça de combinação	AT	1
Webcam HD	AT	1
Software de captura de vídeo	AT	1
Cabo de extensão 2.0 USB	AT	1
Cabo condutor	AT	1

Tabela 1: Lista detalhada de materiais e equipamentos necessários para os testes comportamentais.

Protocol

O seguinte protocolo foi aprovado pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) em Universidade de estado de Ohio (OSU).

1. construção das Arenas

1. Encomendar os materiais descritos na tabela 1: cinco folhas de acrílico, cimento acrílico e um 16 G hipo aplicador.
2. Use equipamento de segurança adequado, de acordo com as instruções do fabricante, que pode incluir, olhos, pele e outros tipos de proteção.
3. Remova o revestimento protetor de papel as folhas acrílicas.
4. Seco cabe todos os materiais para confirmar que os tamanhos são corretas (figura 1A).
5. Montar e carregar a seringa com cimento acrílico.
6. Alinhe a extremidade longa de uma parede externa (parte B), com uma borda superior da base (parte C) e certifique-se de que eles são perpendiculares uns aos outros usando um quadrado de combinação ou maquinista.
7. Usando a seringa, aplique um grânulo pequeno e constante de cimento diretamente para o canto das duas peças sendo juntada.
8. Segure as duas partes (partes B e C) no lugar até que eles são inicialmente definidos (aproximadamente 5 min).
   Nota: Normalmente, eles serão 80% temperado em 24h, mas montagem pode continuar depois de 5 min.
9. Repita as etapas de 1.5-1.7 com outra parede externa (parte B) para a mesma base.
10. Anexe duas paredes internas (parte A), um de cada vez, para a base, utilizando passos 1.5-1.7.
11. Além disso, use a seringa para aplicar um pequeno e constante grânulo de cimento diretamente ao canto agora sendo formado por parede externa (parte B) e o interior da parede (parte A).
12. Mantenha essas peças no lugar durante 5 min.
13. Após 24-48 h, proceda para configurar o ambiente de teste comportamental.

2. Configurando o ambiente de testes comportamentais e equipamentos

1. Coloque pistas ambientais (conforme descrito na seção discussão) em frente um do outro e enfrentando as arenas na área de teste (figura 1B).
2. Organize as quatro arenas testes de forma 2-por-2 ou no chão ou mesa sólida a distâncias adequadas das pistas e a câmera para maximizar a entrada visual aos ratos (figura 1B).
3. Verifique se a linha de visão usando uma vara de medidor sustentada de cada piso da arena por cima do muro em direção as pistas para confirmar que estas distâncias entre as arenas e as pistas são apropriadas.
4. Determine o comprimento do caminho ótico ideal que permite a documentação de todos os quatro arenas, ajustando a altura da câmera ou a altura da tabela. (Figura 1B).
5. Conecte a câmera a um cabo de extensão USB.
6. Usando as pistas de cabo, passe o cabo através do teto e software de captura de uma parede para um computador executando o vídeo em baixo.
7. Ocultar o computador atrás de uma cortina que irá separar os ratos na área de teste do pesquisador (Figura 1).
8. Montar 4 cada uma de pelo menos 3 objetos diferentes que são aproximadamente de 2 a 5 cm de comprimento e largura e até 10 cm de altura para uso em testes (Figura 1).

Figura 1: preparação de teste comportamental. (A) abrir campo-teste de montagem de arena com parte A correspondente para a parede interna, parte B, como a parede exterior e parte C como base. A arena terminada terá duas paredes exteriores (parte B) que executam a borda inteira da base e duas paredes internas (parte A) que se encaixam entre as paredes exteriores nas bordas adjacentes da base (parte C). Todas as paredes vão descansar em cima da base. (B) arranjo representativo de arenas em uma mesa alta de 0,62 m, pistas ambientais 60 x 90 cm, luzes e uma câmera para uma área de testes que permite a captura de todos os quatro arenas simultaneamente. (C) A cortina esconde o experimentador e um sistema de ratos durante os ensaios. As sobrecarga luzes acesas para fins de tirar esta fotografia, mas durante o teste, apenas as lâmpadas de assoalho são em. Além disso, dentre as pistas ambientais foi removido para esta fotografia da área de teste, mas durante o teste, há uma sugestão de quarta na frente das arenas, enfrentando a deixa tudo preta atrás da mesa. (D) um objeto representativo (e régua de escala) que é apropriado para OLT ou NORT testes com ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. Valide esses objetos.
   1. Obter um mínimo de 8 selvagem-tipo ratos na representação estirpe, sexo e grupo etário dos ratos experimentais que serão utilizados (por exemplo, 6 a 9 semanas de idade femininos e masculinos C57Bl/6 os ratos).
   2. Lidar com todos os mouses diariamente por 1 min, ao longo de 3 a 5 dias antes do teste.
   3. Dividir os ratos em grupos de 4 e, se não já isoladamente estão alojados, movê-las para indivíduo segurando limpar gaiolas.
   4. Trazê-los para a sala de testes e permitem que eles se aclimate pelo menos 30 min.
      Nota: Presença de experimentador na sala durante esses 30 min reduz stress nos ratos durante a tarefa, particularmente se o experimentador é masculino²⁰.
   5. Após aclimatação é feita e o experimentador está pronto para começar, começa a gravar o vídeo.
   6. Coloque cada rato virado para as paredes de um canto da arena (chamado canto de liberação) (Figura 2A).
   7. Permitir que os ratos explorar as arenas livremente por 10 min.
   8. Pare de gravar o vídeo.
   9. Ratos de retorno para suas gaiolas limpas de exploração para uma duração de 20 min.
   10. Limpa todas as arenas com facilidade animal recomendado limpeza métodos, tais como limpar com álcool 70% para minimizar as sugestões olfactory antes da próxima utilização.
   11. Usando a fita dupla-face, apor 2 objetos diferentes perto 2 cantos de não-liberação, tal que os objetos são compensados na arena e 6 x 6 cm² de cada parede daquele canto (Figura 2B).
   12. Começa a gravar o vídeo.
   13. Coloque cada rato virado para as paredes no canto de libertação.
   14. Permitir que os ratos investigar a arena e objetos livremente por 10 min.
   15. Pare de gravar o vídeo.
   16. Lugar de ratos de volta em suas gaiolas de exploração limpo para uma duração de 20 min.
   17. Limpa todas as arenas e objetos com facilidade animal recomendaram limpeza métodos como limpar com álcool 70% para minimizar as sugestões olfactory.
   18. Repeti ensaios de treinamento com 2 novos objetos afixados nos mesmos locais, até que todos os objetos (pelo menos três objetos diferentes se conduzindo o OLT e NORT) foram testados com cada rato.
   19. Exclua objetos que permitem que ratos para sentar em cima do objeto.
   20. Analise o tempo de investigação de cada rato com cada objeto de acordo com a etapa 4.
   21. Exclua objetos que têm um valor intrínseco negativo ou positivo.

3. realizar o teste comportamental

1. Uma semana antes do teste: familiarização para realização dos ensaios de comportamentais de indivíduos
   1. Lidar com adultos 6 a 9 semanas de idade femininos e masculinos C57Bl/6 ratos diariamente por 1 min, ao longo de 3 a 5 dias antes do teste.
2. Dia 1: sessões de habituação
   1. Dividir os ratos em grupos de 4 e, se não já isoladamente estão alojados, movê-las para indivíduo segurando limpar gaiolas.
   2. Trá-los para a sala de testes e permitem que eles se adaptar à sala de testes pelo menos 30 min.
      Nota: presença do experimentador na sala durante esses 30 min irá reduzir o stress nos ratos durante a tarefa, particularmente se o experimentador é masculino²⁰.
3. Após aclimatação é feita e o experimentador está pronto para começar, começa a gravar o vídeo.
4. Coloque cada rato na arena (um rato por arena) virado para as paredes do canto de libertação (Figura 2A).
5. Permitir que os ratos explorar as arenas livremente por 6 min.
6. Pare de gravar o vídeo.
7. Ratos de retorno para suas gaiolas de exploração limpo durante o intervalo inter experimental (ITI).
8. Limpa todas as arenas com facilidade animal recomendado limpeza métodos como limpar com álcool 70% para minimizar as sugestões olfactory.
9. Repita as etapas 3.3 – 3.9 duas vezes mais para um total de 3 sessões de habituação para cada rato.
10. Retorne todos os mouses de suas gaiolas para casa.
11. Limpe todas as arenas com facilidade animal recomendada métodos tais como limpando com etanol a 70% de limpeza para minimizar as sugestões olfactory antes de usar no dia seguinte.
12. Dia 2: julgamento formação, OLT, NORT
    Nota: O NORT é um teste opcional.
    1. Após 24h, trazer o mesmo grupo de ratos em para a sala de testes e permitem que eles se adaptar à sala de testes pelo menos 30 min como feito antes das sessões de habituação no dia anterior.
    2. Realizar um ensaio de formação usando 2 objetos colocados na arena (Figura 2B).
       1. Usando a fita dupla-face, apor objetos 6x6 cm² longe de 2 cantos de não-liberação tal que eles são compensados na arena.
       2. Começa a gravar o vídeo.
       3. Coloque cada rato virado para as paredes do canto de lançamento como feito durante as sessões de habituação.
       4. Permitir que os ratos investigar a arena e objetos livremente por 10 min.
       5. Pare de gravar o vídeo.
       6. Ratos do lugar de volta em suas gaiolas de exploração limpo para um ITI de 20 min.
       7. Limpa todas as arenas e objetos com facilidade animal recomendaram limpeza métodos como limpar com álcool 70% para minimizar as sugestões olfactory.
    3. Execute o OLT.
       1. Mover um dos objetos usados na formação experimental de um novo canto de não-liberação e apor o objeto de 6 cm de cada parede daquele canto com fita dupla-face (Figura 2).
          Nota: O outro objeto deve permanecer onde estava durante o treinamento experimental.
       2. Começa a gravar o vídeo.
       3. Coloque cada rato virado para as paredes no canto de libertação.
       4. Permitir que os ratos investigar os objetos por 10 min.
       5. Pare de gravar o vídeo.
       6. Ratos do lugar de volta em suas gaiolas de exploração limpo para um ITI de 20 min.
       7. Limpa todas as arenas e objetos com facilidade animal recomendaram limpeza métodos como limpar com álcool 70% para minimizar as sugestões olfactory.
    4. Execute o NORT.
       1. Substituir o objeto que não foi movido durante o OLT com um objeto romance e apor o objeto romance 6 cm da duas parede do canto com fita dupla-face (Figura 2D).
       2. Começa a gravar o vídeo.
       3. Coloque cada rato virado para as paredes no canto de libertação.
       4. Permitir que os ratos investigar os objetos por 10 min.
       5. Pare de gravar o vídeo.
       6. Coloque os ratos em jaulas em casa.
       7. Limpa todas as arenas e objetos com facilidade animal recomendaram limpeza métodos como limpar com álcool 70% para minimizar as sugestões olfactory antes do próximo uso.

Figura 2: configuração de Arena para ensaios. (A) campo aberto arena sem objetos de teste para sessão de habituação. A seta preta indica um canto de libertação. Este canto deve ser no mesmo local relativo em cada arena e consistente para cada rato sendo testado e para cada julgamento. (B) para o julgamento de treinamento, dois objetos diferentes estão garantidos para o campo aberto a 6 x 6 cm longe de suas respectivas paredes. (C) para a OLT, um objeto é movido para um novo local, também 6 x 6 cm das paredes e não o canto de libertação. (D) para o NORT, o objeto que estivesse parado no OLT é substituído com um novo objeto enquanto o objeto movido a partir do OLT é agora o objeto familiar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. análise de dados de teste comportamental

Nota: Análise de vídeo idealmente deve ser preenchido pelo menos dois experimentadores independentes, cegos.

1. Abra o arquivo de vídeo.
2. Aplica um círculo transparente que fornece uma borda de 2 cm ao redor de cada objeto sobre a tela para ajudar a determinar a investigação ativa. Use uma imagem de arquivo de vídeo com uma régua colocada em uma arena para calibrar essa grade.
3. Observar o comportamento do mouse e registar as vezes que o rato está investigando ativamente o objeto, que consiste de seu nariz apontada para o objeto a uma distância máxima de 2 cm do objeto.
   1. Registro do carimbo de tempo o rato começa a investigar um objeto e o carimbo de hora, quando ele parar de investigar esse objeto.
   2. Repita isto para os dois objetos na arena para a duração do julgamento.
   3. Calcule o tempo cumulativo que o mouse investigou cada objeto, subtraindo-se o horário de início, desde o tempo de parada para cada instância de investigação do objeto e adicionando todos esses valores.
4. Calcule a % de tempo total de investigação ou o índice de discriminação com as seguintes fórmulas:
   1. Calcular a % de tempo total investigação =
      
      Nota: Um valor superior a 50% indica maior investigação da novela local ou objeto.
   2. Calcular o índice de discriminação =
      
      Nota: Um valor positivo indica mais tempo investigando o novo objeto. Um índice de discriminação de zero indica igual tempo gasto com os dois objetos.
5. Representa graficamente os resultados e análises estatísticas completas usando um teste t ou ANOVA conforme apropriado para o número de grupos está sendo comparado.

Results

A Figura 3 fornece exemplos de resultados típicos de positivos e negativos obtidos com masculinos e femininos adultos camundongos C57Bl/6 usando este protocolo⁶. Interpretação de dados OLT e NORT sempre aplica-se aos dados agregados de um grupo (ver discussão abaixo). Tempo de investigação para um único rato não pode ser interpretado como memória ou falta de memória. No entanto, o desempenho de um grupo de ratos (i. e., várias amostras) pode ser comparado a outros grupos ou aos níveis de hipótese fixa usando testes estatísticos. Durante um julgamento de formação típico, grupos de ratos não revelaram uma significativa preferência em média para qualquer um dos objetos como ambos são igualmente novos e não têm qualquer valor intrinsecamente positiva ou negativa para os ratos (Figura 3A e 3B). Se os dados agregados de um grupo de ratos mostraram preferência significativa para um objeto sobre o outro durante o treinamento, esses objetos não devem ser usados porque essa preferência/aversão inerente vai confundir os resultados nos julgamentos subsequentes. Além disso, o tempo total de investigação de todos os ratos deve atender a um padrão mínimo (tradicionalmente definido em 20 segundos²¹) e devem ser comparados para garantir que não existe diferença de base em investigação que pode afetar os testes subsequentes de memória.

Durante o OLT, memória para localização do objeto é refletida pelos ratos, gastando, em média, significativamente mais de 50% do tempo total de investigação com o objeto movido (Figura 3A). Se os tempos de investigação total dos ratos individuais variam muito, resultados melhor são retratados como um índice de discriminação para os objetos (Figura 3B). O aumento significativo no índice de discriminação média na Figura 3B indica que os ratos gastou mais tempo com o objeto depois que ele tinha se mudado. Se medido pelo aumento do tempo percentual ou índice de discriminação, o aumento da investigação do objeto depois moveu-se sugere que os ratos se lembra onde o objeto foi localizado durante o treinamento.

O último julgamento do presente protocolo avalia memória de reconhecimento de objeto. Um exemplo representativo com um grupo de ratos demonstra uma maior percentagem média de tempo de investigação (Figura 3), bem como o índice de discriminação positiva (Figura 3D) em comparação com os valores de controle fixo de 50% e 0, respectivamente. Como com os dados OLT, se houver variabilidade significativa no tempo de investigação total entre ratos individuais, o índice de discriminação é provavelmente o melhor método para visualizar esses dados. Figura 3E mostra um exemplo de uma comparação de 2-grupo no NORT e algumas das estatísticas complicações que podem surgir com a estes testes (ver discussão). Enquanto um t-teste uma amostra para o grupo B mostra investigação significativamente acima de 50%, o mesmo teste para grupo A não. Esta constatação não significa que A e B são diferentes uns dos outros. Para determinar as diferenças de grupo, um teste separado duas amostras não paramétrico de Mann-Whitney comparando grupos B para o A deve ser executado. Um teste de Mann-Whitney não-paramétricos de duas amostras de dados neste grupo representativo não mostra nenhuma diferença significativa (p = 0,66) entre os dois grupos em porcentagem de tempo de investigação objeto romance.

Tanto o OLT e NORT são altamente sensíveis ao valor intrínseco dos objetos e testes extensivos de equivalência de objeto são necessário para garantir que não há nenhuma polarização intrínseca que pode confundir os resultados. Figura 3F e 3G mostram um exemplo de seleção de objeto inadequado. Em um teste piloto com um tamanho de amostra de 4, ratos mostraram uma tendência para gastar menos de 50% do tempo de investigação com objeto A quando emparelhado contra objeto B (Figura 3F). Quando esses objetos foram então usados em um NORT com o objeto A como objeto de romance e um tamanho de amostra maior de 16, ratos passaram significativamente inferior a 50% do tempo de investigação com o objeto A (Figura 3). Esta aversão ao objeto romance é facilmente reconhecível como uma falha técnica no experimento e exemplifica por testes-piloto de objetos para preferência/aversão inerente são essencial.

Figura 3: dados de teste comportamentais com tipo selvagem adulto C57Bl/6 ratos. (A) comparação de tempo porcentagem total investigação do objeto movido durante o julgamento contra o OLT mostra aumento significativo na investigação, depois que o objeto movido de treinamento. p < 0.0001, teste t pareado. (B) resultados representativos para a investigação do objeto movido durante o treinamento e ensaios de OLT exibidos como um índice de discriminação da mesma forma mostram um aumento significativo na investigação do objeto depois que ele é movido. p < 0.0001, teste t pareado. (C) tempo de investigação total percentual do objeto romance no NORT mostra preferência significativa para investigar o objeto do romance. * * p = 0.0024, uma amostra-teste t vs. 50%. (D) resultados representativos para investigação de romance objeto no NORT exibido como um índice de discriminação da mesma forma mostrar preferência para investigar o objeto do romance. * * p = 0.0024, uma amostra-teste t vs 0. (E) resultados representativos de uma análise NORT envolvendo dois grupos de ratos. Grupo B difere significativamente de 50% pelo teste-t de uma amostra (* * p = 0.0024), mas não o grupo A (p = 0.5837). Em uma análise separada, para comparar os grupos, um teste de Mann-Whitney de duas amostras é usado por causa dos tamanhos de grupo desigual e não encontra-se no inquérito, nenhuma diferença significativa (p = 0,66, ns). (F) tempo por cento com um objeto durante os ensaios de validação em um tamanho de amostra pequeno mostra uma tendência para a aversão ao objeto. p = 0.2159, teste-t de uma amostra. (G) com um tamanho maior de amostra e o objeto a partir de (F) usado como um objeto de romance em um NORT, uma significativa aversão ao objeto é encontrada, mesmo que seja o objeto de romance. * p = 0.0270, teste-t de uma amostra. Este é um exemplo de uma falha técnica na seleção do objeto. Os dados são apresentados como média ± SEM. dados de painéis C-E adaptam-se de uma anterior publicação⁶. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo fornece um método econômico para realizar a localização de objeto e objeto romance reconhecimento comportamental testes em ratos. Estes testes permitem a avaliação da função do hipocampo, bem como a função de outras regiões corticais, tais como o córtex pré-frontal, envolvido no reconhecimento de objeto¹⁰. A OLT e NORT têm a vantagem de evitar estímulos com Valência emocional forte que são necessários para o labirinto de água Morris, medo contextual condicionado, labirinto de Barnes ou labirinto de braço radial. Eles também evitam a necessidade de privação de alimentos necessários para o labirinto de braço radial. Além disso, este protocolo descreve um procedimento simples de teste de dois dias que não requer equipamentos extensos ou complicados para execução ou análise. Uma desvantagem dessas tarefas é que eles não permitem medidas de aprendizagem ou aquisição. Uma diferença na investigação de novidade pode ser devido a aprendizagem mais pobre sobre objetos durante o treinamento, memória para o que foi aprendido mais pobres ou ambos. Tempo total gasto investigando objetos é uma medida importante para descartar quaisquer diferenças inerentes na unidade de exploração, mas não é uma medida de aprendizagem. Se as medidas de aprendizagem são importantes para uma pergunta experimental, um labirinto de água, o labirinto de Barnes, ou labirinto radial braço provavelmente seria preferível.

Construção personalizada de arenas comportamentais tem potencial para salvar centenas de dólares e trazer o objeto dentro do alcance financeiro de uma grande variedade de laboratórios de teste. Este protocolo elimina muitos obstáculos e simplifica o processo de fabricação, a construção da arena in-house mais acessíveis aos cientistas sem formação especializada em acrílicos. É importante notar que compra folhas de acrílico coloridas que vão contrastar com os ratos, tais como o acrílico branco para ratos pretos e preto para ratos brancos, facilitará a aquisição de dados e análise, especialmente quando se utiliza comercialmente disponível software de análise. Ordenação de cut-to-size folhas com "roteados bordas" elimina a necessidade de uma tabela vi (tabela 1), e o uso de cimento acrílico remove a necessidade de perfurar e rebaixe os furos piloto. Enroscando em acrílico corte, perfuração e fixadores frequentemente faz com que ele quebra, chip e rachadura devido à sua natureza frágil. Porque o cimento é um solvente, que vai fluir para a área, juntou-se, dissolvendo e amaciamento qualquer acrílico encontra. Assim, ela deve não ser aplicada a cada parte separadamente como se fosse uma colagem tradicional. Ao contrário de cola, o cimento não vai preencher espaços negativos ou aderir às superfícies. Este é o principal motivo para o fim de "bordas roteadas" pois isso garantirá uma borda lisa e plana, criando um vínculo muito melhor. Quando o cimento seca, ele irá se fundiram as duas folhas de acrílico em uma única parte em um processo chamado "solvente de solda". Muito parecido com metal de solda, o produto acabado é uma única peça, mas a área soldada será sempre o local mais fraco. Como tal, uma vez que as arenas estão em uso, deve ter cuidado para evitar o impacto direto ou estresse extremo em desses momentos.

Este protocolo também mostra como configurar 4 arenas para teste simultâneo de até 4 ratos (Figura 1 e Figura 2). As paredes opacas das arenas de impedem que ratos vendo um ao outro durante o teste, mas ainda há uma possibilidade que tendo outros ratos na sala causa odor ou distrações de ruído que podem afectar o teste. Ensaios de habituação, como detalhada aqui pode ajudam a atenuar esta preocupação, como os ratos são expostos para as condições do quarto de vários animais antes do teste comportamental. No entanto, se as distrações de outros ratos ou experimentador ruído associado com a manipulação de outros ratos é uma forte preocupação, uma arena com um mouse pode ser usado, também, embora ele aumentará o tempo necessário para completar a OLT e NORT com vários mouses. Mais de 4 arenas teoricamente poderiam ser usados também, mas a maioria das câmeras não têm um largo campo de visão para mostrar que muitas arenas com boa resolução.

As dimensões e as distâncias fornecidas aqui são orientações gerais para o teste comportamental do mouse em um quarto típico de teste que é 16 x 16 x 16 m³ , em dimensões (figura 1B e 1C). Inicia-se a sinais ambientais adequadas, arenas e equipamento de gravação de vídeo devem ser otimizada para cada ambiente. As sugestões podem consistir de grandes formas ou padrões (geralmente em preto e branco) que permitem que ratos para orientar-se espacialmente durante o OLT. Em vez de colocar pistas em diferentes locais em frente um do outro, as sugestões também podem ser montadas nas paredes da área de teste. Este protocolo recomenda dividindo o quarto com uma cortina para esconder o pesquisador e o computador durante o teste comportamental de teste. Durante toda a habituação, intervalos inter trial e ativos ensaios, pesquisadores devem fechar a cortina para separar-se da área de teste. Se isto não é prático, o computador pode permanecer tendo em conta os ratos, mas o pesquisador deve mover-se fora de vista durante a tarefa. Se o pesquisador estiver presente, os ratos podem tentar contar com ela ou a ele como uma sugestão espacial.

Todos os testes comportamentais devem ser concluídas em um ambiente controlado de temperatura e umidade com iluminação fraca, mas mesmo no mínimo estranhas som ou forte odor ambiental tacos, tais como perfumes na experimentadores e cerca de 310 lux. Entre cada dia de julgamento e teste, todas as arenas e objetos devem ser limpos com facilidade animal recomendada métodos de esterilização como limpando com etanol 70% ou água sanitária sem perfume toalhetes para minimizar as sugestões olfactory. Se desinfectantes químicos são usados, um enxágue final com etanol a 70% é recomendado porque muitos desinfectantes químicos podem ser irritantes para os pés dos animais.  Tal como acontece com qualquer tarefa comportamental, tratamento de ratos para vários dias antes do teste é necessário para familiarizá-los com os indivíduos que estará realizando o OLT e NORT e reduzir o stress durante o teste de^20,22. Como os ratos podem experimentar estresse agudo devido a indivíduos desconhecidos nas proximidades da área de testes, também é recomendável que todos os testes comportamentais devem ser concluído, o mesmo indivíduo (s). Os parâmetros de ensaio e condições detalhadas no presente protocolo foram otimizadas para 6 a 9 semanas de idade adulta C57Bl/6 os ratos e seriam muito útil em revelar deficiências de memória devido a lesão neste grupo etário ou deficiências de memória devido idade própria em ratos mais velhos. Se o objetivo é testar para melhorias de memória em ratos jovens, um mais longo ITI variando de 1 hora a 1 dia seria mais adequado para evitar efeitos de teto no desempenho na versão mais fácil de ITI 20 min. Com efeito, ITIs podem variar de 5 min. (para retirada imediata) a várias horas ou dias (para memórias remotas), consoante as necessidades específicas do experimento e as tensões e as idades dos ratos. Importante, independentemente da duração, ITIs todas devem ser consistentes entre as sessões em um experimento. Como diferentes variedades e idades de camundongos apresentam diferenças no comportamento e na aprendizagem, o tempo para cada julgamento e intervalo, testando o arranjo da área, e objetos usados podem ser modificados de acordo com a estirpe de ratos, sua idade e a lesão específica / doença/intervenção modelo sendo testados^9,21,23,25.

Enquanto a hipocampo dependência das funções de memória espacial testado no OLT são bem estabelecida, o NORT pode ou não pode depender do hipocampo. Interpretação dos dados a partir do NORT deve levar esta ressalva conta. As variáveis determinantes, para se o hipocampo está envolvido, em memória de reconhecimento de objeto não são acordadas ainda, mas poderiam incluir comprimento ITI ou saliency de pistas espaciais¹⁸. Notavelmente, o protocolo apresentado usa espacial OLT antes do NORT, que pode influenciar os ratos para a utilização de processos hippocampal no NORT. Assim, é importante notar que a ordem pode ser invertida, ou cada tarefa pode ser executada de forma independente, dependendo dos experimentadores os dúvidas e necessidades.

Seleção de objetos é um aspecto crítico de ambas as OLT e NORT^22,24. Objetos ideais são pesados o suficiente para não ser facilmente deslocada por um rato e feitos de material, como o vidro ou metal, que um rato não pode danificar por mastigar ou coçar. De madeira, espuma, ou objetos de plástico macios não são apropriados como eles são facilmente deformados e são difíceis de manter livre de odor. Além disso, os objetos usados nos julgamentos de todos devem ser relativamente semelhantes em tamanho, textura, odor e material. Figura 1 dá um exemplo de um objeto apropriado que pode ser usado. Esta estatueta de plástico laranja de uma gaja é preenchida com areia para dar-lhe peso suficiente e selada para evitar escapamento de limpeza reagentes ou outros agentes causadores de odor. Por causa da forma da parte superior, os ratos são incapazes de subir em cima de ou sentar nesse objeto. Para a OLT ou NORT, este objeto é melhor emparelhado com outro objeto de tamanho semelhante, peso, material, cor e complexidade, como um boneco de plástico semelhante de um coelho. Para garantir que a investigação objeto verdadeiramente reflete a preferência por novidade, todos os objetos devem ser validados para equivalente valor intrínseco com um mínimo de 8 ratos na mesma linhagem, sexo e idade do grupo experimental como descreveram na seção 2.9 do protocolo. Além disso, os objetos devem ser randomizados em termos de qual objeto é o objeto de romance ou movido entre ratos no mesmo estudo para continuar a garantir que as características intrínsecas dos objetos não influencia a preferência. Colocação de objeto pode afetar também muito o sucesso ou fracasso da OLT e NORT. Objetos devem ser contrabalançadas nas arenas e não ser muito perto das paredes. Um canto cheio de um objeto é um lugar atraente para os ratos para se esconder e isto irá confundir medidas de investigação.

Um requisito importante para coleta de dados é a definição "investigação", que é quando um rato se envolve um objeto com o nariz apontado para o objeto não mais de 2 cm de distância. Um mouse, movendo-se por cima do objeto ou olhando para além do objeto não se qualifica como investigação ativa. Além disso, desde a OLT e NORT dependem um rato lembrando a localização espacial ou características reais do objeto, deve haver suficiente estudo destes durante os julgamentos de treinamento. Assim, o pesquisador deve definir um tempo mínimo de investigação e excluir quaisquer assuntos que não atendem a esse nível de linha de base de investigação, tradicionalmente fixada em 20 segundos²¹.

Quantificação do tempo de investigação do objeto pode ser realizada de várias formas, com ou sem o software de análise de caro. Se marcar manual é usado, como descrito aqui, a mais completa coleção de dados pode ser conseguida gravar os selos de tempo no vídeo quando o mouse está a investigar o objeto. Os tempos de start e stop de investigação do objeto durante os três ensaios individuais de gravação cria um registro permanente de carimbos tempo imparcial e facilita o cálculo manual preciso de dados em vez de métodos alternativos como o uso de um cronômetro para aditivamente Registre o tempo total que um rato investiga cada objeto.

Pacotes de software comerciais também estão disponíveis para a investigação do objeto de pontuação. Software disponível comercialmente pode fornecer uma riqueza de dados, além da mão marcando dados aqui descritos, incluindo a distância total percorrida, tempo gasto em certas áreas da arena e a velocidade de movimento^16,23. Software, depois de devidamente calibrado e confirmado para detectar confiantemente a investigação do objeto, pode também produzir dados muito mais rápidos que o manual de pontuação. Este rendimento de dados mais rápido, a longo prazo, produzir economias líquidas, em comparação com os humanos-horas necessárias para marcar manual. No entanto, a maioria dos pacotes de software para análise comportamental têm altos custos adiantados que podem ser proibitivos para muitos laboratórios e marcando manual muitas vezes pode ser realizado por pesquisadores do estudante, fazendo com que os custos por hora de marcar um gol comportamental mínima. Software comercial também frequentemente vem com restrições sobre quantos usuários podem acessar o software ao mesmo tempo, limitando a poupança de tempo e o throughput de dados. Embora haja muitas vantagens para esses pacotes de software, eles não são necessários para coletar as informações essenciais de tempo investigando objetos da OLT e NORT. A capacidade de adquirir manualmente esses dados torna tarefas objeto romance financeiramente mais acessível a uma ampla variedade de pesquisadores.

Uma característica adicional do presente protocolo é que a primeira sessão de habituação é essencialmente uma experimentação em campo aberto, que pode produzir dados sobre a atividade e os níveis de ansiedade. Níveis de atividade podem ser quantificados usando a distância total percorrida ou média velocidade, se o software de rastreamento está disponível. Da mesma forma, com software de monitoramento, medidas de ansiedade podem ser derivadas de tempo gasto no centro da arena ou distância percorrida no centro. Estes dados também podem ser adquiridos manualmente por sobrepondo o vídeo da arena com uma grade e quantificação dos cruzamentos. Este dados de campo aberto podem ajudar a descartar déficits motor brutos ou ansiedade excessiva que pode interferir com a investigação do objeto mais tarde.

Os testes estatísticos utilizados neste protocolo são representativos dos métodos tradicionais de análise. Quando comparando 2 grupos de ratos, um teste t de duas amostras, bicaudal é recomendado para testar a significância da diferença em porcentagem tempo investigando o objeto movido ou romance entre grupos. Se os tamanhos de amostra são irregulares, têm excepcionalmente alta variabilidade, ou mostrar variabilidade desigual entre os grupos, que um teste não-paramétrico é recomendado em vez disso, como muitos dos pressupostos subjacentes do t-teste violação nestas condições. Comparando-se 3 ou mais grupos de ratos, ANOVAs são recomendados para testar se o grupo tem um efeito significativo na porcentagem tempo investigando o objeto movido ou romance. Corrigido erro post-hoc testes, como teste de Tukey ou correção de Bonferroni comparações emparelhadas, pode então ser aplicado para testar a diferença de tempo de investigação por cento entre cada par de grupos. Com o OLT, uma maneira adicional para analisar os dados é testar para uma mudança significativa na porcentagem tempo investigando o objeto movido de formação para ensaios de OLT. Com apenas um grupo de ratos, este teste assumiria a forma de um emparelhados, bicaudal t-teste, teste para mudanças significativas no tempo por cento com o objeto movido de treinamento para OLT em cada rato (tendo em mente que estas são emparelhados análises e não independente medições, desde que cada rato rende dois pontos de dados). Com dois grupos de ratos, um medidas repetidas ANOVA de duas vias seria usado, com a medida repetida sendo o julgamento (treinamento contra OLT) e atribuição de grupo, sendo o segundo fator. Post-hoc de testes para as diferenças entre os grupos de tratamento devem comparar os grupos uns aos outros dentro de ensaios.

Como alternativa, se a evidência de memória no NORT ou OLT é tudo o que está sendo testado, um t-teste uma amostra por cento tempo investigando um objeto contra o valor fixo de 50% pode ser usado. Um porcentagem significativamente maior do que 50% de tempo sugere a memória para o objeto. Um tempo percentual significativamente inferior a 50% sugere aversão (por algum motivo), e escolhas de objeto devem ser reavaliadas. No entanto, o teste-t de uma amostra não pode revelar se dois ou mais grupos diferem entre si. Por exemplo, em um experimento com dois grupos de ratos, se o grupo A gastou 60% do tempo com o novo objeto para p = 0.049 por uma amostra de teste t de comparação para 50% e o grupo B, apenas passou de 59% do tempo com o novo objeto para p = 0,051 , O grupo A é significativamente diferente de 50% (e não é grupo B). No entanto, é errôneo concluir que estes dois grupos são significativamente diferentes uns dos outros. Um teste t de duas amostras comparando A e a B podem facilmente revelar que estes dois grupos são estatisticamente indistinguíveis. Se o objetivo final é para comparar o desempenho de memória de dois ou mais grupos, esses grupos devem ser comparados estatisticamente uns aos outros, não só em comparação com um padrão externo. Uma diretriz similar aplica-se para uma comparação de tempo gasto com um objeto movido entre formação e OLT. Neste caso, encontrar uma diferença significativa no tempo por cento com um objeto movido entre formação e OLT em um grupo e não em outro que não mostra que estes grupos são estatisticamente diferentes. Grupos devem ser post-hoc comparado uns contra os outros dentro de cada julgamento, não só através de ensaios dentro do grupo.

É importante ter em mente que o tempo de investigação de qualquer rato individual não pode ser usado como evidência a favor ou contra a memória. Em vez disso, memória para localização do objeto ou identidade nestas tarefas pode apenas concluir com base em dados agregados que estatisticamente são comparados com os níveis de hipótese fixa (50% por tempo, 0 para a relação entre discriminação) ou dados agregados do outro grupo. O tamanho da amostra necessária dependerá fortemente do tamanho do efeito de uma manipulação específica e a variabilidade no comportamento, os quais por sua vez dependerá os ratos sendo usados. Idade, sexo e manipulações causam impacto variabilidade. Nos dados de exemplo apresentados na Figura 3A e 3B, n = 14 temas foram usados, rendendo um tamanho de efeito de 0,68 e poder de 0,65 para um teste t pareado com α = 0,05. Se uma potência de 0.8 foram desejada para esta comparação, um tamanho de amostra de 18 seria necessário.

Esta discussão está enquadrada em torno de p-valores e cortes de significado porque estas são as medidas e análises mais tipicamente relataram para dados OLT e NORT e, portanto, são prováveis que familiar para experimentadores e revisores. Essa dependência do p-valores tem sido fortemente criticada como estatisticamente inválido²⁶. No entanto, apesar de métodos de análise alternativos existem e são endossados em algumas revistas²⁷, nenhum foram amplamente adotados pelos campos biomédicos e comportamentais como padrão²⁶.

Em resumo, este protocolo efetivamente testes de memória em camundongos com custos mínimos. Recomendações de modificações apropriadas no protocolo são incluídas para assegurar a implementação bem sucedida com qualquer modelo de pequeno roedor. Aplicação do presente protocolo específico ferimentos ou modelos de intervenção terapêutica pode revelar valiosa relevância funcional que complementa os mecanismos celulares e moleculares em estudo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sinal Branco - 9% Acrílico Colorido Translúcido e Opaco (Chemcast)	TAP Plastics	NA	1/4" x 15.75" x 15.75" com Bordas Roteadas
Sinal Branco - 9% Acrílico Colorido Translúcido e Opaco (Chemcast)	TAP Plastics	NA	1/4" x 15.75" x 16.5" com Bordas Roteadas
Sinal Branco - 9% Acrílico Fundido Translúcido e Opaco (Chemcast)	TAP Plastics	NA	1/4" x 16.5" x 16.5" com Bordas Roteadas
TAP Cimento Acrílico (1 pt.)	TAP Plastics	NA
16 G Aplicador	de Hipo TAP Plastics	NA
Software de Captura de Vídeo de Estreia Pro Edition	NCH Software	NA
Stanely SAE/Metric Comb Square	Grainger	6R171
Logitech Pro Stream Webcam C922x	CDW	4429927
Cabo de Extensão Ativa USB 2.0 Belkin 16'	CDW
Panduit Pan-Way LD Surface Raceway (8')	CDW	300902
Pistas Espaciais/Ambientais	Variável	NA
Objetos para teste	Variável	NA
70%	Etanol Variável	NA
Fita dupla face	Variável	NA