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Artigo de método

Repressão de crescimento de células do mieloma múltiplo na Vivo por nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-entregue MALAT1 antisentido Oligos

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DOI:

10.3791/58598

⸱

13 de dezembro de 2018

 ,  , 
1Department of Cancer Biology, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve a síntese de um nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-conjugado MALAT1 gapmer antisentido DNA do oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), que demonstra a entrega confiável do SWCNT e o potente efeito terapêutico de anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Métodos utilizados para síntese, modificação, conjugação, e injeção de SWCNT-anti-MALAT1 são descritos.

Resumo

O nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT) é um novo tipo de nanopartículas, que tem sido usado para entregar vários tipos de drogas em células, como proteínas, oligonucleotides e drogas sintéticas da pequeno-molécula. O SWCNT tem dimensões personalizáveis, uma grande área superficial e com flexibilidade pode vincular com drogas através de diferentes modificações na sua superfície; Portanto, é um sistema ideal para o transporte de drogas em células. Há muito tempo não codificante RNAs (lncRNAs) são um conjunto de RNA não-codificante mais de 200 nt, que não pode ser convertido em proteína, mas desempenham um papel importante nos processos biológicos e fisiopatológicos. Transcrição de adenocarcinoma do pulmão metástase-associado 1 (MALAT1) é uma lncRNA altamente conservada. Foi demonstrado que níveis mais elevados de MALAT1 estão relacionados com o mau prognóstico de vários tipos de câncer, incluindo mieloma múltiplo (MM). Temos revelou que MALAT1 regula a morte de reparação e célula de DNA em MM; assim, o MALAT1 pode ser considerado como um alvo terapêutico para MM. No entanto, a entrega eficiente do oligo antisentido para inibir/nocaute MALAT1 in vivo ainda é um problema. Neste estudo, podemos modificar o SWCNT com PEG-2000 e conjugado um oligo anti-MALAT1 para isso, testar a entrega deste composto em vitro, injetá-lo por via intravenosa em um modelo de mouse MM disseminado e observar uma significativa inibição da progressão de MM, o que indica Esse SWCNT é um vaivém de entrega ideal para gapmer anti-MALAT1 DNA.

Introdução

O SWCNT é um romance nanomaterial que pode fornecer vários tipos de drogas, tais como pequenas moléculas, proteínas e ácidos nucleicos, estàvel e eficientemente com ideal tolerabilidade e toxicidade mínima em vitro1 e2de in vivo. Um SWCNT funcionalizado tem grande solubilidade em água e biocompatibilidade, pode ser usado como um serviço de transporte para moléculas menores e pode transportá-los para penetrar a membrana celular3,4,5.

lncRNAs são um aglomerado de RNA (> 200 nt) que são transcritas do genoma de mRNA, mas não pode ser traduzido em proteínas. Aumentando a evidência mostrou que lncRNAs participar na regulação da expressão de gene6 e estão envolvidas na iniciação e progressão da maioria dos tipos de câncer, incluindo MM7,8,9. MALAT1 é uma transcrição não-codificante nuclear enriquecido 2 (NEAT2) e um altamente conservadas lncRNA10. MALAT1 é inicialmente reconhecido em metastásico pulmão não-pequenas células de câncer (NSCLC)11, mas tem sido overexpressed em inúmeros tumores5,12,13; é um do mais altamente expressa lncRNAs e está correlacionada com um prognóstico pobre em MM8,14. O nível de expressão de MALAT1 é significativamente maior nos pacientes MM extra-medulares curso fatal em relação aos diagnosticados apenas como MM15.

Em um estudo anterior, confirmamos que anti-MALAT1 oligos robustamente originar danos ao DNA e apoptose em MM16 usando oligonucleotides antisentido de DNA de gapmer MALAT1 de segmentação (anti-MALAT1) em células MM. O DNA de gapmer é composto de DNA antisentido e ligado por 2'-OMe-RNAs, que poderiam solicitar MALAT1 de clivagem por RNase H atividade uma vez acoplada17. A eficiência de entrega in vivo de oligos antisentidos ainda limita seu uso clínico.

Para testar a entrega o efeito de SWCNT para anti-MALAT1 gapmer oligos, o anti-MALAT1 gapmer DNA é conjugado a DSPE-PEG2000-amina acrescida SWCNT. O SWCNT-anti-MALAT1 então é injetado por via intravenosa em um modelo de rato disseminadas MM; observa-se uma inibição marcante depois de quatro tratamentos.

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Protocolo

Todos os experimentos envolvendo animais foram pré-aprovados pela Cleveland Clinic IACUC (Comité de uso e cuidado institucional do Animal).

1. síntese de SWCNTs funcionalizados

  1. Mistura de SWCNTs de 1 mg, 5 mg de DSPE-PEG2000-amina e 5 mL de água esterilizada nuclease-livre, em um frasco de cintilação (20 mL). Sacode bem para dissolver todos os reagentes completamente.
  2. Proceda à sonicação do frasco em um sonicador de banho de água a um nível de potência de 40 W por 1h à temperatura ambiente (RT, 20 min x 3, mudam a cada 20 min de água para evitar o superaquecimento). Em seguida, centrifugá-lo a 24.000 x g durante 6 h e recolher o sobrenadante. Esta solução SWCNT funcional pode ser armazenada a 4 ° C durante 2 meses.
  3. Adicione 1 mL de solução SWCNT da etapa 1.2 para um dispositivo de filtragem centrífuga de MWCO kDa 100, seguido de 4 mL de água esterilizada nuclease-livre. Centrifugação por 10min a 4.000 x g em RT para remover extra DSPE-PEG2000-amina. Repetir a adição de 4 mL de água e a centrifugação 5 x. Mais de 0,5 mL de solução SWCNT sobra será deixado no filtro após cada centrifugação.
  4. Medir a concentração da solução SWCNT sobra no filtro usando um espectrômetro UV/VIS em 808 nm após a lavagem final. A concentração final é normalmente cerca de 50 mg/L (calculado de acordo com o método desenvolvido por Kam et al.18).
    Nota: Certifique-se que DSPE-PEG-acrescida SWCNTs são solúveis em água após etapa 1.4 e são estáveis em soluções biológicas diferentes sem agregação visível após algumas semanas.

2. conjugação de Anti-MALAT1 Gapmer DNA ladeado por 2'-O RNAs modificados para SWCNT Funcionalizado

  1. Adicione 0,5 mg de Sulfo-LC-SPDP em 450 µ l de DSPE-PEG2000-amina acrescida SWCNT. Adicionar 50 µ l de PBS de x 10 e então incubar durante 2 h em RT
  2. Para remover extra Sulfo-LC-SPDP, adicione a reação da etapa 2.1 para um dispositivo de filtragem centrífuga de MWCO kDa 100, seguida por 4 mL de água livre de nuclease. Centrifugar durante 10 min a 4.000 x g em RT. Repeat a adição de 4 mL de água e a centrifugação x 5.
  3. Adicionar 200 nM thiol-modificado Cy3-anti-MALAT1 gapmer DNA em 1,5 mL de solução comercial de TDT e incubar durante 90 min no RT. Purify o produto com uma coluna de NAP-5, seguindo o protocolo do fabricante. Eluir o anti-MALAT1-Cy3 com 500 µ l de esterilizado nuclease-free 1 x PBS.
    Nota: O SWCNT funcionalizado pode ser armazenado com TDT adicionado, que pode cleave dissulfeto formado durante o armazenamento do anti-MALAT1 de thiolated gapmer DNA. A DTT adicionado pode ser removido por aNAP-5 coluna antes de conjugação com SWCNT.
  4. Recolher a solução de DSPE-PEG2000-amina SWCNT sulfo-LC-SPDP-Tratado deixada no filtro e dilui-lo com 500 µ l de solução de Cy3-anti-MALAT1. Em seguida, incube a 4 ° C por 24 h. O conjugado SWCNT-anti-MALAT1 pode ser armazenadas a 4 ° C por 3 semanas. Seguindo o mesmo procedimento, o SWCNT conjugado com oligo antisentido scramble pode ser sintetizado e utilizado como SWCNT-controle.

3. cauda veia injeção de SWCNT-Anti-MALAT1

  1. Gere um modelo de rato disseminadas MM.
    1. Para alcançar os melhores resultados da comparação, aleatoriamente organize 14 NOD. CB17-Prkdcscid/J ratos (8 semanas de idade), em julgamento ou controle grupos (sete em cada grupo) com a mesma relação macho/fêmea.
    2. Limpar o banco de operação e esterilize-a com álcool a 70%.
    3. Use uma lâmpada de aquecimento para aquecer o mouse para ajudar a cauda veia para aparecer. Contenha o mouse corretamente com uma retenção de injeção de cauda.
    4. Injete células de 5 x 106 mCherry-MM.1S-Luc em 50 µ l de PBS na veia da cauda sem anestesia. Pressione o local da injeção com um algodão embebido em álcool para Mark s. 30 o mouse injetado e devolvê-lo para uma gaiola limpa.
  2. O tratamento tem início no dia 7 após a injeção de células MM.1S.
    1. Injete 50 µ l de PBS contendo SWCNT-anti-MALAT1 para a veia da cauda do rato. Uso PBS contendo SWCNT-controle como um controle.
    2. Pressione o local da injeção com um algodão embebido em álcool por 30 s.
    3. Observar o sangramento local na cauda e o comportamento geral do rato por 1 min e depois devolvê-lo para uma gaiola limpa. Observe tudo injetados ratos novamente antes de retornar a gaiola ao rack, para certificar-se de que as injeções são toleradas bem.
  3. Repeti a injeção a cada 7 dias até o término do experimento.
    1. Encerrar o experimento quando degrada a saúde geral do mouse: quando não comer ou beber, a aparência de patas pálidas, qualquer hemorragia subcutânea, uma falta de ar, diminuição da atividade, uma paralisia dos membros inferiores, e/ou uma massa palpável na abdômen é observado.

4. avaliação da progressão da doença

  1. Avalie o estado geral dos ratos todos os dias após a injeção de células de mCherry-MM.1S-Luc. Preste atenção particular se os ratos desenvolvem paralisa dos membros inferiores.
  2. Avalie o crescimento do tumor usando um sistema de imagens in vivo 1 x por semana, antes da injeção de SWCNT-anti-MALAT1.
    1. Prepare-se 15 mg/mL D-luciferina fresco com PBS 1x.
    2. Anestesia os ratos com um vaporizador de isoflurano (3 – 5% para a indução e 1-3% para a manutenção, dependendo do estado dos ratos).
    3. Injetar 150 mg/kg em cada rato D-luciferina intraperitonealmente, 5 min antes de imagem; Então, imagem os ratos em posição com um espectro de sistema de imagem.
    4. Recolha imagens sequenciais dos ratos cada 2 min, até atingir a saturação da luminescência. Ajuste o intervalo de tempo de acordo com o absorção de D-luciferina/sinal.
  3. Use o CO2 para sacrificar os ratos, uma vez atingido o término do experimento.
  4. Já que este é um modelo disseminado MM, processe os ratos como segue.
    1. Pese o mouse antes de dissecação.
    2. Colete sangue periférico do coração por um hemograma completo (CBC) ensaio realizado por uma máquina de contador de células do sangue. As contagens de células brancas e células vermelhas do sangue, bem como a proporção de linfócitos, é os principais índices.
    3. Isolar o baço e pesá-lo. Calcular a relação do peso de corpo/baço; Considere > 0,5% como alargamento do baço.
    4. Recolha os tecidos da medula óssea, baço, linfonodos, rim e o tecido com metástase visível.
    5. Recolha a espinha se o mouse desenvolvido uma paralisia dos membros inferiores.
    6. Extrai o ARN e proteínas de amostras de medula óssea.
    7. Corrigi todos os tecidos remanescentes em formol.
    8. Para descalcificação, mergulhe as amostras de osso em 0,25 M de solução de EDTA (pH 8.0) durante 5 dias após 24h de fixação.
    9. Mergulhe todas as amostras em álcool 75% para o armazenamento a longo prazo.
  5. Compare a intensidade do sinal de luciferase nos mesmos pontos tempo em dois grupos. De ambos os grupos, gravar as datas do sacrifício de cada rato e calcular as curvas de sobrevivência dos dois grupos com o software.
    Nota: Todos os procedimentos são resumidos na Figura 1.

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Resultados

Para demonstrar o efeito de inibição de anti-MALAT1 gapmer DNA em MM, que derrubou a expressão de MALAT1 e usado em células H929 e MM.1S. Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram coletadas para a análise da eficiência do knock-down e o status de apoptose em células transfectadas com anti-MALAT1 gapmer ou controle de DNA. qRT-PCR os resultados mostraram que anti-MALAT1 gapmer DNA derrubou a expressão de MALAT1 nas células H929 e MM.1S com eficiência(F...

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Discussão

A evidência mostrou que lncRNAs participar na regulação de numerosos processos fisiológicos e fisiopatológicos em cânceres, incluindo MM7,8,9; Eles têm o potencial para ser direcionado para o tratamento de câncer, que pode ser realizado por oligonucleotides antisentido20,21,22. O E.U. Food and Drug Administration (FDA) aprovou várias dr...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer o Lerner Research Institute proteômica, genômica e núcleos de imagens para sua assistência e apoio. Financiamento: Este trabalho é apoiado financeiramente pelo NIH/ICN grant R00 CA172292 (J.J.Z.) e fundos de start-up (para J.J.Z.) e clínica e translacional ciência colaborativa (CTSC) do caso Western Reserve University núcleo utilização piloto Grant (para J.J.Z.). Este trabalho utilizou o microscópio confocal Leica SP8 que foi comprado com financiamento da concessão de institutos nacionais de saúde SIG 1S10OD019972-01.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
SWCNTsMillipore-Sigma704113
DSPE-PEG2000-AmineAvanti Polar Lipids880128
sonicator de banhoVWR97043-992
Filtro centrífugo de 4 mLEspectrômetro Millipore-SigmaZ740208-8EA
/VISThermo Fisher ScientificaccuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometercoeficiente de extinção de 0,0465 L/mg/cm a 808 nm
Sulfo-LC-SPDPProteoChemc1118
solução de TDTMillipore-Sigma43815
coluna NAP-5GE Healthcare17-0853-01
sistema de imagem in vivoPerkinElmer
NOD. Camundongos CB17-Prkdcscid/JCharles River lab250
Citômetro de fluxoBecton Dickinso
LipofectaminaInvitrogen11668019Lipofectamine2000
Soro fetal bovino (FBS)Invitrogen10437-028
RMPI-1640 meioInvitrogen11875-093
MALAT1-QF:sintetizado por IDT Companhia5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3'
MALAT1-QR:sintetizado pela IDT Company5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3'
GAPDH-QF:sintetizado pela IDT Company5'- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3'
GAPDH-QR:sintetizado pela IDT Company5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3'
PCR quantitativo usando SYBR Green PCR master mixThermo Fisher ScientificA25780
RevertAid kit de síntese de cDNA de primeiro suporteThermo Fisher ScientificK1621
anti-MALAT1sintetizado pela IDT Company5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T
*G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3'
Kit de Ensaio de Viabilidade CelularPromega CorporationG7570CellTiter-GloLuminescent Kit de Ensaio de Viabilidade Celular
accuSkan GO UV/Vis Microplaca EspectrofotômetroThermo Fisher Scientific Filtro
centrífugoMillipore-SigmaUFC910008
software SPSSIBMversão 24.0
D-LuciferinaMillipore-SigmaL9504
UV

Referências

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