Summary
इस अनुच्छेद में, हम प्रदर्शन कैसे शोषक microbiopsy तकनीक का प्रदर्शन किया है और कैसे नमूना त्वचा और एक न्यूनतम इनवेसिव तरीके से खून की सरल और एक साथ नमूने के लिए आरएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
पारंपरिक त्वचा बायोप्सी नैदानिक अनुसंधान है कि cosmetically संवेदनशील क्षेत्रों या बाल चिकित्सा अनुप्रयोगों को अपनी असावधानी के कारण शामिल है सीमाओं । यहाँ, हम एक शोषक microneedle आधारित डिवाइस का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, microbiopsy अवशोषण, त्वचा और रक्त मिश्रण के न्यूनतम इनवेसिव नमूने के लिए. हमारा लक्ष्य नैदानिक अनुसंधान में तेजी से प्रगति की सुविधा, त्वचा रोग के लिए बायोमार्कर की स्थापना और नैदानिक अनुसंधान प्रतिभागियों के लिए जोखिम को कम करने में मदद करना है । पारंपरिक त्वचा बायोप्सी तकनीकों के विपरीत, शोषक microbiopsy सेकंड के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है और इसकी सरल डिजाइन के कारण गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है. इस रिपोर्ट में, हम एक स्वयंसेवक पर, लोड हो रहा है और आवेदन सहित शोषक microbiopsy के उपयोग का वर्णन. फिर, हम कैसे अवशोषित नमूना से आरएनए को अलग करने के लिए दिखा । अंत में, हम दोनों रक्त (CD3E और CD19) और त्वचा (KRT14 और tyr) के mrna अभिव्यक्ति स्तरों यों तो करने के लिए मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-qpcr) का उपयोग प्रदर्शित करता है । तरीकों का वर्णन है कि हम बंद शेल्फ किट और अभिकर्मकों का उपयोग । यह प्रोटोकॉल एक ही शोषक microbiopsy मैट्रिक्स के भीतर त्वचा और रक्त के एक साथ नमूने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण प्रदान करता है. हम मानव नीतिशास्त्र समितियों पाया है, चिकित्सकों और स्वयंसेवकों त्वचा संबंधी अनुसंधान के लिए इस दृष्टिकोण का समर्थन करने के लिए.
Introduction
त्वचा बायोप्सी त्वचा के नमूने और हिस्टोथोलॉजिकल मूल्यांकन के माध्यम से त्वचा रोगों के बाद के निदान के लिए त्वक् विज्ञान में सबसे आवश्यक तकनीकों में से एक है । बायोप्सी तकनीक परीक्षा1के लिए रोगी की त्वचा पर संदिग्ध घाव को दूर करने के लिए एक ब्लेड या पंच बायोप्सी का उपयोग कर एक चिकित्सा पेशेवर शामिल है । हालांकि तकनीक प्रभावी है, यह उच्च आक्रामक है और अंत बिंदु के रूप में नैदानिक अनुसंधान सीमा आमतौर पर आणविक जीव विज्ञान तकनीकों2,3शामिल है । त्वचा रोगों के आणविक विश्लेषण में अत्यधिक विशिष्ट जैविक जानकारी प्रदान करने की क्षमता होती है जो कि हिस्टोपोथोलॉजिकल विश्लेषण नहीं कर सकता है, इस प्रकार दवा खोज और रोग निदान4,5को सुविधाजनक बनाने में । इसके अलावा, सबसे आणविक तकनीकों में नमूना मांग अपेक्षाकृत छोटी है और पशुओं के उपयोग में कमी करने के लिए नेतृत्व और replicates की एक बड़ी संख्या की अनुमति हो सकती है । इसलिए, एक वैकल्पिक तकनीक के लिए एक स्पष्ट आवश्यकता है जो नैदानिक अनुसंधान में आणविक विश्लेषण को सक्षम बनाती है और प्रतिभागियों के लिए जोखिम को कम करती है ।
क्षेत्र में ऐसी जरूरत को संबोधित करने के लिए, हमारे समूह ने एक उपन्यास microneedle आधारित नैदानिक मंच, शोषक microbiopsy, कि एक सरल और न्यूनतम आक्रामक तरीके से6में रक्त के साथ मिश्रित त्वचा की एक छोटी राशि के संग्रह में सक्षम बनाता है विकसित की है । इस प्रकाशन का उद्देश्य नैदानिक अनुसंधान में आरएनए निष्कर्षण के माध्यम से आणविक विश्लेषण की सुविधा के लिए एक नमूना उपकरण के रूप में शोषक microbiopsy का वर्णन है.
पहले, हम microbiopsy के पहले संस्करण का वर्णन किया है, त्वचा microbiopsy, जो एक microneedle एक तीन परत स्टील प्लेट डिजाइन से बना के होते हैं त्वचा के ऊतकों के छोटे टुकड़े को निकालने के लिए7. इस उपकरण की नवीनता microneedle से कई संपर्क अंक से आता है कि कुशल ऊतक निष्कर्षण3परमिट । इसके विपरीत, एक परिपत्र त्वचा पंच बायोप्सी केवल एक संपर्क बिंदु प्रदान करता है और बस कुछ मामलों में किसी भी नमूने पर कब्जा करने के बिना त्वचा आंसू । त्वचा microbiopsy के आधार पर, हम हाल ही में शोषक microbiopsy जो दोनों रक्त और त्वचा नमूना क्षमताओं है विकसित की है । उपकरण को हाल ही में महामारी विज्ञान अध्ययन6में संसाधन-गरीब क्षेत्रों में उपयोग के लिए व्यवहार्य दिखाया गया है ।
अपनी सरल डिजाइन के कारण, शोषक microbiopsy कुछ ही सेकंड के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है और व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है. इसके अतिरिक्त, स्थानीय संवेदनाहारी की जरूरत नहीं है, और आवेदन साइट scarring कारण नहीं है । वर्तमान प्रोटोकॉल प्रासंगिक नमूना प्रशिक्षण आणविक विश्लेषण के लिए लक्षित त्वचा डेटा प्राप्त करने के लिए बिना शोधकर्ताओं या चिकित्सा पेशेवरों को सक्षम बनाता है । हम microsampling उपकरणों भविष्य में त्वचा अनुसंधान में दिनचर्या बनने की उम्मीद.
हालांकि microbiopsy अन्य त्वचा रोग अध्ययनों में बताया गया है कि आणविक नैदानिक तकनीकों शामिल6,8,9,10, इस तरह के रूप में मानव पैपिलोमा वायरस डीएनए का पता लगाने, इस प्रोटोकॉल पहले नमूना निष्कर्षण और शोषक microbiopsy के लिए प्रसंस्करण तकनीकों का विवरण प्रदर्शित करने के लिए है. इसके अलावा, यह पहली रिपोर्ट है जो माइक्रोबायोप्सी नमूनों में त्वचा और रक्त कोशिकाओं के सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा का वर्णन कर रही है ।
Protocol
अध्ययन को मेट्रो साउथ ह्यूमन रिसर्च एथिक्स कमेटी और यूनिवर्सिटी ऑफ क्वींसलैंड ह्यूमन रिसर्च एथिक्स कमिटी (hrec-13-qpah-५५१ और UQ2013001551) और साउथ ऑस्ट्रेलिया ह्यूमन एथिक्स कमिटी (२००६०७) की यूनिवर्सिटी ने मंजूरी दी थी ।
1. शोषक microbiopsy निर्माण
- लेजर ५० μm चिकित्सा ग्रेड स्टेनलेस स्टील शीट और शोषक परत (फिल्टर पेपर), क्रमशः (चित्रा 1) से microneedle भागों में कटौती ।
नोट: इस तरह के 3 डी प्रिंटिंग के रूप में तेजी से प्रोटोटाइप तकनीकों के साथ गढ़े हैं, गोताखर और मामले, डिवाइस के सहित अन्य भागों, । - सभी भागों सोख, शोषक परत के लिए छोड़कर, में ७०% इथेनॉल (etoh) के लिए 5 मिनट और हवा के लिए उन्हें 30 मिनट बाद में सूखी.
- तीन परत microneedle इकट्ठा, बीच में शोषक परत के साथ (चित्रा 1a).
- डुबकी के भट्ठा में इकट्ठे microneedle डालें ।
- वसंत पर रखो और मामले में प्लंजर डालने (चित्रा 1c) । microneedle कोडांतरण प्रक्रिया में कुछ भी छू सुई गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए से बचें ।
- का उपयोग करने से पहले γ-विकिरण नसबंदी के लिए एक पैकेज में इकट्ठे शोषक microbiopsy मुहर ।
2. शोषक microbiopsy के साथ नमूना
- डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें, और ७०% etoh के साथ इस तरह के forceps के रूप में हाथ और उपकरणों, स्प्रे ।
- एक शराब पोंछ के साथ आवेदन साइट sanitize ।
- इस प्रक्रिया में microneedle को छूने के बिना γ-विकिरण निष्फल पैकेज से microbiopsy निकालें ।
- प्लंजर खींच कर वसंत को संपीड़ित करने के लिए डिवाइस लोड करें जब तक कि वहाँ एक ' क्लिक ' ध्वनि और प्लंजर जगह में ताले है.
- नमूना क्षेत्र एक निश्चित स्थिति में है कि यह सुनिश्चित करने, नमूना होना करने के लिए त्वचा पर डिवाइस निशाना लगाओ ।
- सुनिश्चित करें कि डिवाइस त्वचा के लिए लगभग सीधा है, तो त्वचा पर डिवाइस के लिए ≥ 1 किलो बल लागू करें ।
नोट: त्वचा में बल नीचे लागू करने के लिए microneedle के पर्याप्त प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । - ट्रिगर दबाएँ और रक्त नमूने को अवशोषित करने के लिए 10 एस की एक न्यूनतम के लिए जगह में डिवाइस पकड़.
नोट: डिवाइस 10 s करने से पहले जारी किया गया है, तो कम नमूना कैप्चर है ।
3. आरएनए निष्कर्षण
नोट: rna निष्कर्षण प्रक्रिया निर्माताओं के प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया rna के इष्टतम अलगाव के लिए microbiopsied नमूना से. सभी अभिकर्मकों और rna निष्कर्षण में प्रयुक्त कॉलम किट में शामिल है जब तक अंयथा संकेत दिया ।
- प्लंजर बाहर खींचो और हाथ धीरे से मामले से शोषक microneedle । सुनिश्चित करें कि microneedle की नोक हटाने के दौरान कुछ के साथ संपर्क में नहीं आता है ।
- डुबकी से शोषक microneedle निकालें । बाँझ की एक जोड़ी के साथ microneedle पर दो छेद पर पकड़ और इसे बाहर खींच ।
- एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में बरकरार microneedle रखो (आरएनए अलगाव किट से नहीं; सामग्री तालिकादेखें) निष्कर्षण बफर के ५० μl के साथ प्रेफिल्लेड सरिंज, सुई पक्ष नीचे की ओर नीचे का सामना करना पड़ के साथ । नमूना नुकसान को कम करने के लिए, नमूना संसाधित करने से पहले 5 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर ट्यूब छोड़ दें ।
- भंवर संक्षेप (3-5 s) टिप से नमूना सामग्री के कुछ दूर करने के लिए.
- ४२ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक घुमाव पर ट्यूब में microneedle सेते हैं ।
नोट: बफर समाधान तुरंत शोषक परत में अवशोषित हो जाएगा । - (सुई से विपरीत पक्ष) microneedle के शीर्ष हिस्सा जगह 2 मिलीलीटर microfuge बाँझ forceps का उपयोग कर ट्यूब के शीर्ष किनारे के साथ ।
- ट्यूब के ढक्कन को बंद कर दें जैसे कि माइक्रोनेडले के ऊपर कैप और ट्यूब के बीच जगह रखी जाती है ।
- १६,००० एक्स जी पर ट्यूब या 30 एस के लिए अधिकतम गति पर स्पिन डिवाइस के शोषक परत से नमूना सामग्री को दूर करने के लिए ।
- microneedle ध्यान से बफर समाधान में वापस सूई बिना संदंश के साथ निकालें । ट्यूब रखें और microneedle त्यागें ।
- 2 मिनट के लिए ३,००० एक्स जी पर नमूनों को अपकेंद्रित्र करना. पिपेट एक नया microcentrifuge ट्यूब में ध्यान से निकाली गई आरएनए युक्त सतह पर तैरनेवाला.
- शुद्धि स्तंभ फ़िल्टर झिल्ली पर कंडीशनिंग बफर के २५० μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते ।
- १६,००० एक्स जी या 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर संग्रह ट्यूब में कॉलम अपकेंद्रिप ।
- ७०% etoh के ५० μl को चरण ३.९ से एकत्र नमूने में जोड़ें । धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं ।
- preसंस्कारित शुद्धि कॉलम में मिश्रण (~ १०० μl) स्थानांतरण ।
- १०० एक्स जी पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रिकी तुरंत, १६,००० एक्स जी 30 एस के लिए प्रवाह को दूर करने के माध्यम से एक centrifuge द्वारा पीछा किया ।
- धो बफर 1 के १०० μl जोड़ें (W1) शुद्धि कॉलम में और 1 मिनट के लिए अपकेंद्रिकरण में ८,००० एक्स जी.
- dnase समाधान के 5 μl जोड़कर एक नमूना के लिए एक अलग microcentrifuge ट्यूब में बफर rdd के ३५ μl करने के लिए dnase हल तैयार करें । धीरे उलटा करके मिक्स ।
नोट: dnase उपचार शुद्धि कॉलम पर किया जा करने के लिए है, बजाय पीसीआर थाली में बाद में, नमूने की मात्रा के कारण. - शुद्धि स्तंभ झिल्ली में सीधे dnase ऊष्मायन मिश्रण के ४० μl जोड़ें. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं ।
- शुद्धि कॉलम झिल्ली में W1 के ४० μl जोड़ें । 15 एस के लिए ८,००० एक्स जी पर सेंट्रेसेज ।
- पिपेट के १०० μl धोने बफर 2 (W2) के बाद शुद्धिकरण कॉलम में dnase उपचार और सेंट्रेसेज के लिए 1 मिनट में ८,००० एक्स जी.
- शुद्धि कॉलम में W2 का एक और १०० μl जोड़ें और 2 मिनट के लिए अपकेंद्रिप में १६,००० एक्स जी किसी भी अवशिष्ट धोने बफर के लिए शुद्धि कॉलम की जांच करें । फिर से १६,००० एक्स जी में 1 मिनट के लिए अपकेंद्रिता अगर किसी भी धोने बफर रहता है ।
- किट में प्रदान की गई एक नई ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए शुद्धि कॉलम स्थानांतरण ।
- पिपेट 11 μl के rnase-मुक्त पानी (आरएनए आइसोलेशन किट में प्रदान नहीं), के बजाय रेफरेंस बफर (EB), सीधे शुद्धि कॉलम की झिल्ली पर. झिल्ली में rnase मुक्त पानी का अधिकतम अवशोषण सुनिश्चित करने के लिए rnase मुक्त पानी का वितरण करते हुए झिल्ली की सतह पर पिपेट की नोक को धीरे से स्पर्श करें । 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं ।
- १,००० x g पर 1 मिनट के लिए कॉलम को अपकेंद्रितक कॉलम में rnase-मुक्त पानी वितरित करने के लिए, फिर 1 मिनट में १६,००० एक्स जी के लिए सेंट्रेसेज आरएनए के लिए ।
नोट: नमूना की छोटी मात्रा के कारण आरएनए परिमाणन अनुशंसित नहीं है. - स्टॉप प्वाइंट #1: cdna संश्लेषण तुरंत नहीं किया जाता है, तो-८० डिग्री सेल्सियस पर कुल आरएनए नमूना स्टोर ।
नोट: rna नमूना की कम एकाग्रता दिया आवश्यक नहीं तो ठंड से बचें.
4. cdna संश्लेषण
- बर्फ पर जमे हुए नमूने गल (चरण ३.२५ से) ।
- नीचे दी गई प्रक्रिया के अनुसार cdna संश्लेषण किट के साथ कुल आरएनए से cdna का संश्लेषण करें ।
- अभिक्रिया मिश्रण तैयार करें: कुल आरएनए का 11 μl, 5x transamp बफर के 4 μl, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के 1 μl, dnase/rnase मुक्त पानी के 4 μl । पाइपटिंग द्वारा धीरे से मिलाएं ।
- एक थर्मल cycler उपकरण पर रिवर्स प्रतिलेखन भागो: 10 मिनट के लिए 25 ° c, 15 मिनट के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस, एक अंतिम रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ निष्क्रियता के बाद ८५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कदम ।
- स्टॉप प्वाइंट #2: उपयोग करने तक-८० डिग्री सेल्सियस पर रिवर्स लिखित नमूना स्टोर ।
5. qpcr प्रतिक्रिया और डेटा विश्लेषण
नोट: qpcr प्रतिक्रियाओं के लिए प्राइमरों के लिए intron सीमाओं स्पैन ncbi प्राइमर ब्लास्ट (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) का उपयोग कर जीनोमिक डीएनए के प्रवर्धन से बचने के लिए डिजाइन किए गए थे । इस अध्ययन में प्रयुक्त संदर्भ जीन RPLP0 है (अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें).
- बर्फ पर जमे हुए नमूने गल (चरण ४.५ से) ।
- क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स किट के साथ qpcr को नीचे दी गई प्रक्रिया के अनुसार निष्पादित करें ।
- मास्टर मिश्रण की प्रतिक्रिया प्रति followings युक्त तैयार: 2x की 5 μl qpcr रिएक्शन मिक्स, ०.४ μl के 10 μm फॉरवर्ड प्राइमर, ०.४ μl के 10 μm रिवर्स प्राइमर, २.२ μl के dnase-मुक्त पानी. पाइपटिंग द्वारा धीरे से मिलाएं । नमूनों को triplicates में सेट करें ।
- पिपेट 8 μl के मास्टर मिश्रण के प्रत्येक अच्छी तरह से एक ३८४-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट पहले और फिर प्रत्येक नमूना से cdna के 2 μl (एक कुल 10 μl प्रति अच्छी तरह से) ।
नोट: कोई टेंपलेट नियंत्रण (ntc) और कोई उल्टे ट्रांस्क्रिप्टेज़ नियंत्रण (-RT) ऋणात्मक नियंत्रणों के रूप में शामिल हैं । - सील चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली, और संक्षेप में सेंतमोज ।
- एक वास्तविक समय थर्मल cycler पर प्रवर्धन प्रतिक्रिया भागो: 2 मिनट (polymerase सक्रियण) के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस, ९५ के लिए ° c के ४० चक्र के बाद के लिए 5 एस (विकृतन), ६० के लिए ° c 10 s (अनीलन) और ७२ ° c के लिए 10 s (विस्तार).
- ज्ञात सांद्रता के साथ टेम्पलेट्स से तैयार एक मानक वक्र से अंतर्वेशी द्वारा नमूनों की आरएनए एकाग्रता की गणना.
- सॉफ़्टवेयर में एक नया प्रयोग बनाएं ।
- प्लेटों के लिए सीरियल कमजोर पड़ने को स्थापित करने के लिए निर्धारित करें और मानकों को सेट क्लिक करे ।
- का चयन करें और मानकों और नमूनों के लिए कुओं की व्यवस्था । लागूकरेंक्लिक करें ।
- मानक वक्र का आकलन करने के लिए परिणाम टैब में विश्लेषण करें पर क्लिक करे. ढाल की पुष्टि करें, R2 मान, प्रवर्धन दक्षता और त्रुटि प्रयोगात्मक मापदंड को पूरा.
- अपने सीटी मूल्यों के आधार पर मानक वक्र पर नेत्रहीन अज्ञात नमूनों की मात्रा की जाँच करें.
नोट: मानक वक्र का निर्माण, तनुकरण कारक के विकल्प सहित, प्रकाशित प्रोटोकॉल11,12,13के अनुसार किया जाता है ।
- (सीटी एक refence जीन के लिए सामान्यीकृत है) का उपयोग करके एमआरएनए के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रदर्शन.
- लक्ष्य जीन के सीटी मान को संदर्भ जीन की सीटी वैल्यू से घटाना, δ सीटी मान प्राप्त करने के लिए ।
- तकनीकी replicates के δ ct मान औसत ।
- प्लॉट और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर के साथ जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण11,14 ( सामग्री तालिकादेखें) ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रकाशित प्रोटोकॉल13के अनुसार किया जाता है ।
Representative Results
हम पहले से सूचित किया है कि त्वचा microbiopsy के microneedle लगभग ५०० μm गहरी7त्वचा प्रवेश । त्वचा microbiopsy के microneedle डिजाइन अत्यधिक शोषक microbiopsy पर एक के समान है (चित्रा 2a). जबकि अवशोषण microbiopsy रक्त अवशोषण के लिए बीच में एक शोषक परत के शामिल, त्वचा microbiopsy त्वचा के ऊतकों के यांत्रिक कैप्चरिंग के लिए एक चैनल निहित. शोषक परत का उपयोग भी microneedle आयाम में एक मामूली अंतर के लिए नेतृत्व (शोषक: १.५० x ०.५० एक्स ०.२१ मिमी बनाम त्वचा: १.५० एक्स ०.५० एक्स ०.१५ मिमी).
चित्रा 2b आवेदन साइटों से पता चलता है 5 अवशोषण के बाद मिनट और त्वचा microbiopsies पुरुष स्वयंसेवक के बाईं हथेली का हाथ पर लागू किया गया. दो microneedle डिजाइन के बीच समानता के कारण, दोनों उपकरणों से आवेदन साइटों को मामूली एरिथेमी के साथ तुलनीय थे । दोनों आवेदन साइटों कोई निशान के पीछे छोड़ दिया साथ ४८ एच के बाद ध्यान देने योग्य नहीं थे । यह न्यूनतम इनवेसिव डिवाइस स्क्रीन कई आवेदन साइटों की मदद करने के लिए या एक नियमित आधार पर प्रदर्शन करने की क्षमता है कि परिकल्पना का समर्थन करता है.
चित्रा 2c एक पुरुष स्वयंसेवक के हथेली का हाथ करने के लिए लागू किया जा रहा के बाद शोषक microbiopsy की शोषक परत के एक प्रतिनिधि तस्वीर से पता चलता है. के रूप में चित्रा में दिखाया गया है, त्वचा के कुछ छोटे टुकड़े microneedle की नोक के पास कब्जा कर लिया, और कुछ खून फिल्टर कागज में अवशोषित कर लिया गया था । यह इंगित करता है कि डिवाइस त्वचा प्रवेश और दोनों त्वचा और रक्त एक साथ एक ही शोषक microbiopsy मैट्रिक्स के भीतर पर कब्जा कर लिया । चित्रा 2d एक के बाद नमूना त्वचा microbiopsy, microbiopsy की पिछली पीढ़ी की तुलना के लिए, से पता चलता है । त्वचा microbiopsy के चैनल त्वचा का एक छोटा सा टुकड़ा पर कब्जा कर लिया, लेकिन microneedle पर रक्त की मात्रा शोषक microbiopsy के लिए छोटे रिश्तेदार था. ४८ एच के भीतर दोनों आवेदन साइटें नजर नहीं आ रही थीं. प्रयोग में, शोषक microbiopsy एक 10-एस होल्डिंग समय के बाद आवेदन के साथ लागू किया गया था, जबकि त्वचा microbiopsy तुरंत डिजाइन में अंतर के कारण लागू करने के बाद जारी किया गया था.
के रूप में चित्रा 3aमें दिखाया गया है, शोषक microbiopsy के दो समूहों इस प्रयोग में शामिल थे आवेदन प्रोटोकॉल के आधार पर: ' तत्काल रिलीज ' और ' 10 एस होल्डिंग ' । ' तत्काल रिलीज ' समूह के लिए, डिवाइस अनुप्रयोग साइट से तुरंत आवेदन के बाद हटाया जा रहा डिवाइस के साथ, एक ही मूल त्वचा microbiopsy प्रोटोकॉल का उपयोग कर लागू किया गया था. ' 10 एस होल्डिंग ' समूह के लिए, डिवाइस के लिए आवेदन के बाद जगह में आयोजित किया गया था 10 एस नमूना संग्रह में सुधार करने के लिए. शोषक microbiopsy के दो समूहों के लिए आवेदन दृष्टिकोण नमूना राशि को प्रभावित कर सकता है कि कैसे प्रदर्शित करने के लिए स्थापित किए गए थे. 10-एस होल्डिंग समय को प्रदर्शित करने के लिए एक चिकित्सकीय उचित समय के रूप में चुना गया था कि आवेदन समय वसूली योग्य नमूने की मात्रा को प्रभावित करता है ।
आरएनए की राशि से बरामद दो शोषक microbiopsy समूहों के लिए ०.३३ ± ०.३९ एनजी थे ' तत्काल रिलीज ' और १.४३ ± ०.८८ ' के लिए 10-एस होल्डिंग ' (चित्रा 3a, n = 20), अतिरिक्त होल्डिंग समय के साथ एक 4 गुना वृद्धि का सुझाव । यह इंगित करता है कि 10-s होल्डिंग समय के साथ शोषक डिवाइस लागू करने के परिणामस्वरूप अधिक आरएनए निकाली गई । अंतर शोषक परत में वृद्धि हुई रक्त नमूने की उपस्थिति के कारण हो सकता है (चित्रा 3c). दरअसल, ' तत्काल रिलीज ' समूह (चित्रा 3b) ' 10-एस होल्डिंग ' समूह (चित्रा 3 सी) की तुलना में शोषक परत के साथ एक समान मात्रा में रक्त एकत्र करने में विफल रहा । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि सबसे तुरंत जारी माइक्रोबायोप्सी एक्स के करीब थे-अक्ष, सुझाव है कि वे नकारात्मक घटनाओं थे या आरएनए की एक बहुत कम राशि प्रदर्शित । इसलिए, परिणाम परिकल्पना है कि होल्डिंग समय डिवाइस के प्रदर्शन पर एक प्रभाव के रूप में यह रक्त शोषक परत द्वारा अवशोषित होने के लिए समय लग सकता है सत्यापित किया ।
चूंकि डिवाइस को रक्त और त्वचा के नमूनाकरण के लिए डिजाइन किया गया था, क्यूपीसीआर की तुलना के लिए दोनों उपकरणों के लिए त्वचा और रक्त बायोमार्कर की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्रयोग की जाती थी । हम tyrosinase का इस्तेमाल किया, tyr, melanocytes के लिए एक बायोमार्कर के रूप में और व्यवहार्य एपिडर्मिस में केराटिनोसाइट्स के लिए एक बायोमार्कर के रूप में KRT14 . त्वचा microbiopsy नमूने तुलना के लिए प्रयोग में शामिल थे । के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, हालांकि त्वचा और शोषक microbiopsies अलग डिजाइन में अंतर के कारण लागू किया गया, दोनों त्वचा के लिए अभिव्यक्ति का स्तर बायोमार्कर tyr और KRT14 दोनों उपकरणों के लिए तुलनीय थे के रूप में द्वारा संकेत दिया डेटा. श्वेत रक्त कोशिका बायोमार्कर (CD3E, टी कोशिकाओं और CD19, बी कोशिकाओं) त्वचा microbiopsy नमूनों की तुलना में शोषक microbiopsy नमूनों में अधिक प्रचलित होने के लिए पाए गए. इस परिणाम से पता चलता है कि शोषक microbiopsy रक्त संग्रह में बेहतर प्रदर्शन किया, लेकिन अभी भी त्वचा microbiopsy (एन = 5) की तुलना में त्वचा पर कब्जा करने के लिए क्षमता बनाए रखा.
चित्रा 1. शोषक माइक्रोबायोप्सी का निर्माण । (क) तीन परत microneedle । (ख) उपकरण के सभी भागों । (ग) इकट्ठे शोषक microbiopsy. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 2. शोषक microbiopsy पुरुष स्वयंसेवक के बाईं हथेली का हाथ पर एक निशान छोड़ने के बिना एक साथ त्वचा और रक्त के नमूनों पर कब्जा करने में सक्षम था. (क) शोषक और त्वचा microbiopsies के microneedles के बीच एक तुलना. (ख) आवेदन के बाद अवशोषण और त्वचा microbiopsies 5 मिनट से छोड़ दिया अनुप्रयोग साइटों. (सी, डी) आवेदन के बाद अवशोषण और त्वचा microbiopsies के microneedles. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 3. 10-s के लिए आवेदन किया जब शोषक microbiopsy अधिक रक्त और आरएनए नमूना पर कब्जा कर लिया. (क) 10-एस के बाद आवेदन होल्डिंग समय डिवाइस तुरंत (n = 20) को रिहा करने से rna की एक उच्च राशि के परिणामस्वरूप । त्रुटि पट्टियां S.D. माध्य से (* * * *p< 0.0001) का प्रतिनिधित्व करते हैं । (बी, सी) ' तत्काल रिलीज ' और ' 10-एस होल्डिंग ' दृष्टिकोण के साथ आवेदन के बाद शोषक microbiopsies के प्रतिनिधि तस्वीरें. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 4. त्वचा और शोषक microbiopsies (एन = 5) के बीच mrna अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना । जीन व्यंजक को संदर्भ जीन RPLP0के साथ सामान्यीकृत किया गया था. त्रुटि पट्टियां S.D. माध्य से (*p< 0.05) का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
Discussion
इन परिणामों का प्रदर्शन है कि शोषक microbiopsy सरल और न्यूनतम इनवेसिव आणविक लक्षण वर्णन के लिए त्वचा और रक्त मिश्रण के नमूने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे प्रोटोकॉल के अनुसार डिवाइस आवेदन अन्य आवेदन प्रोटोकॉल (चित्रा 3) के साथ बरामद आरएनए राशि में अंतर से दिखाया गया के रूप में विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । नमूना निकाले जाने के बाद, rna निष्कर्षण के लिए अनुवर्ती नमूना संसाधन चरण अत्यधिक स्थापित प्रोटोकॉल15,16के समान है । आरएनए निष्कर्षण में प्रारंभिक कदम है कि शोषक microbiopsy के लिए संशोधित कर रहे हैं के अलावा, एक और महत्वपूर्ण परिवर्तन rnase मुक्त पानी का उपयोग करने के लिए बहाव अनुप्रयोगों के लिए परिणामों में सुधार है. इसके अलावा, यह उल्लेख है कि इस अध्ययन में प्रयुक्त संदर्भ जीन RPLP0है लायक है । RPLP0, जिसका समारोह में अच्छी तरह से विभिंन सेल और ऊतक प्रकार के लिए जाना जाता है17, गैर मेलेनोमा त्वचा कैंसर और पूर्ववर्ती घावों18में उपयोग के लिए एक उपयुक्त संदर्भ जीन के रूप में सूचित किया गया है ।
डिवाइस की मुख्य सीमाओं में से एक डिवाइस है, जो समय लेने वाली है और संभावित रूप से rna जैसे संवेदनशील नमूनों के लिए नमूना नुकसान की संभावना बढ़ जाती है से microbiopsy के हटाने है । फिर भी, इस मुद्दे को पूर्व ठंडा करने से दूर किया जा सकता है सभी बाँझ प्रसंस्करण उपकरण, जैसे 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों, सूखी बर्फ पर.
शोषक microbiopsy का उपयोग सरल है और गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है. पारंपरिक बायोप्सी आवश्यक नहीं है के रूप में microbiopsy जैसे आरटी-qpcr के रूप में स्थापित आणविक निदान तकनीकों के साथ आणविक लक्षणन परमिट. आगे यों तो और शोषक microbiopsy के नमूने की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, पिछले साहित्य है कि मानव त्वचा ऊतक से शामिल आरएनए निष्कर्षण की जांच की थी । एक ठेठ ३.० या ४.० मिमी त्वचा पंच बायोप्सी से, तीन अध्ययनों से निकाली गई आरएनए मात्रा से लेकर ५० तक की त्वचा ऊतक के प्रति मिलीग्राम २०० एनजी की सूचना दी है19,20,21. आरएनए के १.४३ एनजी के साथ तुलना करना है कि औसत पर शोषक microbiopsy से बरामद किया गया था (चित्रा 3), नमूना त्वचा ऊतकों का वजन 0.29-115 μg एक ही आरएनए-से-ऊतक अनुपात के आधार पर त्वचा पंच बायोप्सी अध्ययन से सीमा की उंमीद है ।
यह प्रोटोकॉल संभावित नुकसान के बिना नहीं है, हालांकि कुछ समस्याओं को आसानी से दूर किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, आरएनए निष्कर्षण डेटा ने 10-एस होल्डिंग समय (चित्रा 3) के साथ भी काफी भिन्नता का सुझाव दिया । समस्या को हल करने के लिए, एक संभावित समाधान अनुप्रयोग प्रोटोकॉल ऑप्टिमाइज़िंग शामिल है । इस तरह की त्वचा के लिए लागू बल और समय धारण के रूप में मानकों का परीक्षण किया जाना चाहिए और नमूना निष्कर्षण में भिन्नता को कम करने के लिए अनुकूलित. अन्य संभावित मुद्दा नमूना अखंडता और वसूली को प्रभावित हो सकता है, जो डिवाइस से microbiopsy के हटाने है. हालांकि आरएनए निष्कर्षण के लिए microbiopsy हटाने एक प्रभावी दृष्टिकोण है, पूरी प्रक्रिया थकाऊ है, और नमूना प्रक्रिया में संदूषण के संपर्क में हो सकता है । इसलिए, नमूना प्रक्रिया प्रोटोकॉल का संशोधन अत्यधिक नमूना अखंडता को सुनिश्चित करने और नमूना हानि को रोकने के लिए वांछित है ।
एक बार उपरोक्त दो मुद्दों को संबोधित कर रहे हैं, यह डिवाइस नैदानिक अनुसंधान के लिए एक मानक उपकरण बन जाएगा कि उम्मीद है. यह ध्यान रखें कि डिवाइस दोनों त्वचा और रक्त नमूना एक साथ कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए. अंत में, इस प्रोटोकॉल संयुक्त त्वचा और रक्त नमूनाकरण और सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा के लिए बाद में नमूना प्रसंस्करण के लिए एक आसान और न्यूनतम इनवेसिव उपकरण के रूप में शोषक microbiopsy प्रदर्शन के विवरण का वर्णन.
Disclosures
हित का कोई टकराव घोषित नहीं किया.
Acknowledgments
हम एनएचआरसी फैलोशिप APP1109749 और APP1111216, क्वींसलैंड के विश्वविद्यालय के सौ साल के छात्रवृत्ति और अंतरराष्ट्रीय स्नातकोत्तर अनुसंधान छात्रवृत्ति को स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
| Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
| Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
| RNA extraction | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
| Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
| cDNA synthesis | |||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
| qPCR reaction and data analysis | |||
| SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
| GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
| PCR primers | |||
| RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
| RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
| TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
| TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
| KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
| KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
| CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
| CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
| CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
| CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |
References
- Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
- Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
- Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
- Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
- Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
- GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
- Kubista, M., et al.
- Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
- GraphPad Statistics Guide. , (1995).
- Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
- Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
- Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
- Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
- Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
- Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
- Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
