Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Summary

Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.

Abstract

Imobilização de genes em superfícies Litograficamente estruturadas permite o estudo do gene compartimentada processos de expressão em um sistema do biorreator microfluidic aberto. Em contraste com outras abordagens para sistemas celulares artificiais, tal uma configuração permite um fornecimento contínuo com reagentes de expressão de gene e drenagem simultânea de produtos residuais. Isto facilita a implementação de processos de expressão do gene sem célula durante longos períodos de tempo, o que é importante para a realização de sistemas de feedback reguladoras do gene dinâmico. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a fabricação de biochips genéticas usando uma simples de usar litográfica técnica baseada em reações de deslocamento do DNA strand, que usa exclusivamente componentes disponíveis comercialmente. Também oferecemos um protocolo sobre a integração dos genes compartimentadas com um polydimethylsiloxane (PDMS)-microfluidic sistema baseado. Além disso, mostramos que o sistema é compatível com microscopia de fluorescência (TIRF) reflexão interna total, que pode ser usada para a observação direta de interações moleculares entre o DNA e as moléculas contidas na mistura, a expressão.

Introduction

Célula-liberdade de expressão de gene reações são de grande interesse para várias aplicações de biotecnologia, bioquímica e biologia sintética. Célula-livre expressão de proteínas foi fundamental para a preparação de amostras de proteína pura, que serviram de base para inúmeros estudos em biologia estrutural. Por exemplo, sistemas de célula livre foram usados com sucesso para a expressão da proteína complexos¹ ou membrana proteínas², que são difíceis de produzir usando a expressão baseada em célula. Notavelmente, célula livre expressão gênica reações também foram utilizadas para elucidar a estrutura do código genético, c....

Protocol

Nota: Um calendário para as etapas nas seções diferentes consta a informação suplementar (seção 1).

1. fabricação do chip

Nota: como substratos, wafers de silício de uso (diâmetro de 100 mm, espessura de 0,525 mm) com 50 nm espessa camada de dióxido de silício ou lâminas de vidro (24 mm x 24, n. º 1.5; 22 mm x 50 mm, n º 4). Dependendo da aplicação, outros tamanhos e espessuras podem ser mais apropriadas.

1. Limpeza a substratos através de uma RCA limpe procedimento (água, solução de amoníaco NH₃(aq) 30% e peróxido de hidrogênio H₂O₂ 30%, na proporção de 5:1:1)
   ....

Results

Litografia de duas etapas: a Figura 5 mostra o resultado de um processo de duas etapas litográfica sobre uma lâmina de vidro com sobreposição de padrões de cordões DIS fluorescente etiquetadas.

Expressão de uma proteína fluorescente de uma escova de gene: Figura 6 demonstra a expressão da proteína fluorescente YPet de DNA imobilizado. Em vários pontos no tempo, que aval.......

Discussion

Litografia de Bephore é uma técnica robusta e versátil para a imobilização padronizada de DNA ou RNA. Ainda, o procedimento inclui várias etapas, que - se alterado - podem ser uma fonte para falha ou reduzir o desempenho do sistema.

Um passo crucial na fabricação de chips de Bephore é a PEGylation do substrato, que fornece a biocompatibilidade da superfície. Aqui, a etapa de limpeza com um procedimento RCA é importante, desde que ele também ativa a superfície para a silanização subsequente. Du.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wafer de silício com 50 nm de dióxido de silício (substrato Bephore) Espessura do	Wafer		(µ m): 525 ± 25, Diâmetro (mm): 100
Wafer de silício (para molde mestre PDMS)	Espessura do wafer		(µ m): 525 ± 25, Diâmetro (mm): 76,2 (3")
Lâminas de vidro nº 4	Menzel		22 mm x 50 mm
Lâminas de vidro nº 1.5	Assistent		24 mm x 24 mm
Biotina-PEG-Silano	Laysan Bio		MW 5.000
Tolueno anidro	Sigma Aldrich (Merck)	244511
Streptavidin	Thermo-Fisher Scientific	S888
DNA	Integrated DNA Technologies ( IDT)
Phusion PCR Master Mix de Alta Fidelidade com Tampão HF	New England Biolabs	M0531S	Kit de PCR
Wizard SV Gel e Sistema de Limpeza de PCR	Kit de limpeza de PCR de coluna giratória	Promega	A9281
PURExpress	New England Biolabs	E6800S	Sistema de expressão livre
de células PDMS	Dow Corning	Slygard 184
FluoSpheres	Thermo-Fisher	Scientific F8771
(ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)	Tecnologia de	S 1810-10
EpoCore 20
MR-Dev 600			Desenvolvedor de fotorresistência
da GmbH Ti-Prime	MicroChemicals		Promotor de adesão
Cola de silicone de dois componentes	Picodent	Twinsil
Folha amarela de proteção UV	Lithoprotect (via MicroChemicals)	Y520E212
Equipment
Máscaras para fotolitografia	Zitzmann GmbH		64.000 dpi, 180x240 mm
Microscópio vertical	Olympus	BX51	Fotolitografia e imagem de fluorescência
60x objetiva de imersão em água	Olympus	LumPlanFl	Usado com Olympus BX51, NA 0.9
Objetiva de imersão em água 20x	Olympus	LumPlanFl	Usado com Olympus BX51, NA 0.5
Camera	Photometrics	Coolsnap HQ	Usado com Olympus BX51
Fonte leve	EXFO	X-Cite 120Q	Usado com microscópio invertido Olympus BX51
	Nikon	Ti2-E	Fluorescência imagem da expressão gênica
objetiva 4x	Nikon	CFI P-Apo 4x Lambda	Usado com a câmera Nikon Ti2-E
	Andor	Neo5.5	Usado com a fonte de luz Nikon Ti2-E
	Lumencor	SOLA SM II	Usado com a incubadora de gaiola Nikon Ti2-E
	Linha em negrito	Okolab	Usado com o controlador de pressão Nikon Ti2-E
	Elveflow	OB1 MK3
Nanofotômetro	Implen		Medição da concentração de DNA
Limpador de plasma	Diener	Femto	200 W, operado a 0,8 mbar com a amostra em uma gaiola de Faraday