O locus coeruleus é um pequeno aglomerado de neurônios envolvidos em uma variedade de processos fisiológicos. Aqui, descrevemos um protocolo para preparar seções de cérebro de rato para estudos de proteínas e metais neste núcleo.
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Artigo de método
Localização do Locus Coeruleus no cérebro do rato
Neste artigo
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Resumo
Resumo
O locus coeruleus (LC) é um importante polo de noradrenalina produzindo neurônios que modulam a um número de funções fisiológicas. Anormalidades estruturais ou funcionais do LC impacto de várias regiões do cérebro, incluindo o córtex, hipocampo e cerebelo e podem contribuir para a depressão, transtorno bipolar, ansiedade, bem como doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Estes distúrbios são frequentemente associados com misbalance de metal, mas o papel dos metais na LC é apenas parcialmente compreendido. Estudos morfológicos e funcionais da LC são necessários para melhor compreender as patologias humanas e contribuição de metais. Os ratos são um modelo experimental utilizado, mas o mouse LC é pequeno (~0.3 mm de diâmetro) e difícil de identificar para um não-especialista. Aqui, descrevemos um protocolo baseado em imuno-histoquímica passo a passo para localizar o LC no cérebro do rato. Dopamina-β-hidroxilase (DAP) e, alternativamente, Tirosina Hidroxilase (TH), duas enzimas altamente expressadas na LC, são utilizados como marcadores imuno-histoquímicos em fatias de cérebro. Seções adjacentes às seções contendo LC podem ser usadas para uma análise mais adicional, incluindo histologia para estudos morfológicos, testes metabólicos, bem como imagens de metal por microscopia de fluorescência de raios-x (XFM).
Introdução
O locus coeruleus (LC) é uma região importante do tronco cerebral e um importante local de produção de norepinefrina (NE)1. A LC envia projeções em todo o cérebro2 para o córtex, do hipocampo e do cerebelo3 e regula os principais processos fisiológicos, incluindo o ritmo circadiano4,5, atenção e memória6, estresse emoção9,10, processos cognitivos8e7. Disfunção de LC tem sido implicada em distúrbios neurológicos....
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Protocolo
Estudos dos animais foi aprovado pela Johns Hopkins University Cuidado Animal e uso (ACUC) protocolo número M017M385.
1. o cérebro de corte
- Para imobilizar, anestesia os ratos através da aplicação de 3% de isoflurano.
- Embeber uma bola de algodão com gotas de isoflurano e colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora de 15 mL. Coloque o nariz do animal no tubo e permitir que inalar o isoflurano. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta ao dedo do pé-pitada.
- Coloque o animal em suas costas e imobilizá-lo fixando suas extremidades para baixo com um pino de T, tendo acesso ao seu abdôme....
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Resultados
Alterações na homeostase de metal (tais como, Cu, Fe, Zn e Mn) são frequentemente observadas em distúrbios neurológicos, incluindo alterações na LC34,35. Assim, determinar níveis de metal no cérebro é necessário para a compreensão dos mecanismos da doença. As seções do cérebro geradas usando o protocolo descrito podem ser usadas para quantificar os níveis de Cu e outros metais em LC e compará-los com os níveis em regiões fora da L.......
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Discussão
Orientar corretamente o espécime é um passo crucial no presente protocolo. Porque nós estamos usando características anatômicas da superfície dorsal do cérebro para localizar LC (fronteira entre o cerebelo e colículo inferior), é importante que as seções ser alinhados corretamente. Isto requer cuidado em definir corretamente o cérebro na matriz de fatiador de cérebro de rato. Recomendamos cortar ~ 500 μm mais tecido anterior e posterior à LC para evitar perder o núcleo. O erro mais comum é cortar seções muito poucos que .......
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Agradecimentos
Agradecemos a Abigael Muchenditsi para a manutenção da colônia do mouse. Uso da fonte de fótons avançada no Argonne National Laboratory foi apoiado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, escritório de base energia Ciências, sob o número do contrato: DE-AC02-06CH11357. Agradecemos a Olga Antipova e Dr. Stefan Vogt para assistência na fonte de fótons avançada e suporte ao usuário. Este trabalho foi financiado pelo 2R01GM101502 de concessão Instituto Nacional de saúde para SL.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Matriz de fatiador de cérebro de camundongo adulto | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anticorpo secundário anti-coelho, Alexa Fluor 488 (fonte - burro) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Lâminas de vidro carregadas | Genesee | 29-107 | |
| Microscópio confocal | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Lâminas de corte de criostato | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Tesoura Mini, 9,5 cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamina β-hidroxilase (DBH) anticorpo - produção interna (fonte - coelho) | B. Eipper | - | |
| Anticorpo de dopamina β-hidroxilase (DBH) - comercialmente disponível (fonte - coelho) | Sinalização celular | 8586 | |
| Tubos Falcon, 50ml | EUA Scientific | 339652 | |
| Forano (isofluorano) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset montagem mídia | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscópio | Pascal | LSM 5 | |
| Placas multipoços, 24 poços | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Composto de temperatura de corte ideal (OCT) | VWR/ tecnologia | de tecido 102094-106 | |
| Paraformaldeído (PFA)/ formalina 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way moldes de incorporação descartáveis | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Escova | |||
| Fosfato tampolado com solução salina (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| lâminas de barbear | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Espátulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pinos | Office Depot | 344615 | |
| O cérebro do rato em coordenadas estereotáxicas, Paxinos e Franklin, 3ª edição | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (para preparar PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| anticorpo tirosina hidroxilase (TH) (fonte - coelho) | EMD Millipore | AB152 | |
| Filme fino de ultraleno para preparação | de amostra XRF SPEX | 3525 | |
| Microscópio fluorescente de campo amplo | Zeiss | Axio Zoom.V16 |
Referências
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. An author affiliation was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory
