Usando sistemas robóticos para processar e incorporar Colônica murino amostras para análise histológica

Summary

Falta de padronização para processamento do tecido murino reduz a qualidade da análise histopatológica murino em comparação com espécimes humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o exame histopatológico dos tecidos do cólon inflamados e uninflamed murino para mostrar a viabilidade de sistemas robóticos rotineiramente utilizados para processamento e incorporação de amostras humanas.

Abstract

A compreensão de doenças humanas foi grandemente ampliada graças ao estudo de modelos animais. Não obstante, avaliação histopatológica de modelos experimentais precisa ser tão rigoroso que o aplicado para amostras humanas. Com efeito, conclusões confiáveis e precisos criticamente é influenciado pela qualidade da preparação de secção de tecido. Aqui, descrevemos um protocolo para análise histopatológica de tecidos murino que implementa várias etapas automatizadas durante o procedimento, desde a preparação inicial para a incorporação de parafina das amostras murino. A redução de variáveis metodológicas através de padronização de protocolo rigoroso de procedimentos automatizados contribui para maior confiabilidade global de murino análise patológica. Especificamente, este protocolo descreve a utilização de processamento automatizado e incorporando sistemas robóticos, rotineiramente utilizado no processamento do tecido e parafina incorporação de amostras humanas, para processar amostras murino de inflamação intestinal. Podemos concluir que a confiabilidade do exame histopatológico de tecidos murino é significativamente maior em cima da introdução de técnicas padronizadas e automatizadas.

Introduction

Nas últimas décadas, vários modelos experimentais foram desenvolvidos para dissecar os mecanismos patogénicos, levando a doenças humanas^1,2. Para avaliar a gravidade de uma doença, os pesquisadores devem avaliar o efeito de um tratamento e estudar as variações de arquiteturais citológicas e histológicas ou a quantidade de inflamação³. Para executar esses modelos experimentais, detalhadas análises histopatológicas são necessários, muitas vezes comparando amostras de murino e humano^4,5.

Além disso, amostras humanas são comumente processadas e marcou pelas instalações do núcleo de histopatologia e padronizado de experientes patologistas humanos através de critérios histopatológicos e métodos. Por outro lado, murino tecidos são geralmente fixa, incorporados e analisados por pesquisadores com experiência limitada de protocolos histopatológicos. A qualidade e a confiabilidade do exame histopatológico começa com a preparação de cortes de tecido de alta qualidade. Criticamente, vários fatores contribuem para aumentar ou diminuir a qualidade da análise final, incluindo fixação, macroscópica de seccionamento, processamento, parafina incorporação e incorporação de amostras^6,7.

Todas estas passagens envolvendo a manipulação da amostra estão sujeitos a erros manuais, incluindo incorporação manual das amostras e, em menor medida, micrótomo manual de corte e coloração. Neste momento, todo o processo de preparação do tecido murino para avaliação histológica baseia-se nos protocolos manuais e protocolos que variam de laboratório para laboratório. O objetivo deste estudo é implementar protocolos padronizados de automatizado para reduzir erros e variabilidade no exame histopatológico murino.

A nosso conhecimento, nós descrevemos aqui primeiros protocolos para tecido totalmente automatizado de processamento e incorporação para a avaliação histológica dos tecidos murino; Estes são rotineiramente utilizados em unidades de patologia para as análises de amostras humanas. Como um exemplo prático da viabilidade do método, um modelo murino de inflamação intestinal foi analisado, ou seja,, o modelo de colite crônica causada pela administração repetida de sulfato de dextrano de sódio (DSS) na água bebendo^{8 ,9}. Esta configuração experimental de perto se assemelha a humana inflamatória intestinal (IBD) de doenças¹⁰ desde que os animais tratados com DSS exibem sinais de inflamação intestinal, por exemplo, perda de peso, fezes soltas ou diarreia e encurtamento do cólon, bem como fibrose ^8,9,11. Como observado para pacientes humanos IBD, tratamento de DSS gera um curso de doenças complexas. Neste contexto, elaboradas avaliações histológicas são necessários para compreender a profunda alteração da arquitetura do tecido. Assim, a implementação dos protocolos descritos para o aumento da qualidade de preparação de amostra pode beneficiar pesquisadores baseando-se na interpretação do histológico e imuno-histoquímica analisa para configurações experimentais murino. Murino modelos experimentais de doenças humanas que envolvem alterações da arquitetura do tecido, a presença de infiltrado de tecido celular ou inflamação em diferentes tecidos e órgãos (intestino, cérebro, fígado, pele) pode usar o aumento da qualidade da preparação da amostra para exame histopatológico.

Protocol

Procedimentos de animais foram aprovados pelo Ministério da saúde (auth. 127/15, 27/13) italiano e seguiram as orientações de cuidados com animais do Instituto Europeu de Oncologia IACUC (Comité de uso e cuidados institucionais do Animal)

1. crônica colite indução pela administração repetitiva de DSS

1. Idade separada e sexo combinam ratos em 2 grupos (tratamento DSS vs controle de H₂O, pelo menos 5 littermates ratos por grupo experimental).
2. Administrar 2,5% DSS (40 kDa) na água potável por 7 dias para o grupo de tratamento e água ao grupo controle.
   Nota: Esse modelo induz um transmural crônica inflamação intestinal⁹.
3. Após 7 dias, parar o tratamento de DSS e dar água para os dois grupos durante 14 dias. Repita este processo 3 vezes.
   Nota: A administração repetitiva de DSS induz alterações da mucosa do cólon, muito parecidos com humano IBD, de fibrose ou seja,⁹.
4. Sacrificar os ratos de acordo com os procedimentos autorizados pelo IACUC institucional, ou seja,, por inalação de CO₂ .
5. Abra o abdômen de rato e peritônio com um bisturi.
   Nota: Esterilidade é recomendada mas não estritamente necessária.
6. Separe o cólon do intestino com pinças e pinças. Impostos especiais de consumo do cólon com uma pinça e fórceps.
   Nota: Medida do comprimento do cólon (figura 1A) é um método para determinar se a colite ocorreu em camundongos tratados com DSS.
7. Lavar o cólon em uma placa de Petri com 10 mL de frio 1x salino de tampão fosfato (PBS) e pressione suavemente para remover o material fecal.

2. fixação de tecidos murino

1. Mergulhe cada espécime de cólon murino em 10 mL de 10% neutro tamponado formalina (NBF) no RT (temperatura ambiente).
   Nota: Esterilidade é recomendada mas não estritamente necessária.
2. Fixar o tecido para 18-24 h a RT

3. dois pontos de corte e preparação do tecido

1. Remover tecidos fixos do recipiente NBF com pequenas pinças e colocá-los em um prato de Petri. Colocar os dois pontos em uma placa de trabalho corte com pequenas pinças.
2. Corte dois-pontos em fragmentos (0,2 cm de comprimentos de 0,3 cm) com um bisturi estéril. Este comprimento do fragmento é ideal para não exceder a espessura da fita.
3. Pegar o segmento de um cólon com pequenas pinças (Figura 2A). Inserir o segmento de um cólon em um do plástico salientes dicas da parafina orientada a incorporação de gaveta com pequenas pinças (Figura 2B).
4. Repita a operação (3.2-3.3) com um segmentos 3 dois pontos adicionais por gaveta. Evitar introduzir os segmentos adjacentes pontas salientes, para minimizar a sobreposição dos tecidos
5. Feche a gaveta empurrando cuidadosamente as quatro bordas (Figura 2). Evite apertar o tecido para evitar danos aos tecidos.
6. Inserir a grade em um frame plástico de apoio. Rotule o frame de apoio para identificar a amostra. Repita para cada amostra biológica.

4. tecido processamento

1. Ligue o processador automático pressionando o botão liga / desliga (Figura 3A, 3B).
2. Aquecer por 1 h para garantir a parafina derreter. Espere até que o instrumento confirma que a parafina é completamente derretida, observando a presença do ícone dedicado (Figura 3).
3. Cada gaveta orientada (contendo as amostras de tecido) manualmente inserir a cesta do metal fornecida pelo processador automatizado (Figura 3D). Coloque as fitas verticalmente alinhando-os perto de um para o outro para otimizar a ocupação de cesta.
4. Feche a cesta do metal (Figura 3E).
5. Abra a tampa da retorta (Figura 3F). Retorta é o lugar onde a cesta é inserida na máquina. Colocar o cesto no compartimento dedicado do processador (Figura 3). Feche a tampa da retorta (Figura 3 H).
6. Use a tela de toque no computador instrumento para definir o protocolo de trabalho (Figura 3I). Escolha a sequência de soluções, tempo e temperatura para ser implementado de acordo com o regime previsto na tabela 1.
7. Atribua o protocolo a ser executado na retorta que contém a cesta, clicando no ícone do computador dedicado (Figura 3J). Inicie o protocolo clicando no Botão iniciar (Figura 3 L).
8. Espere até que o instrumento confirma o fim do protocolo, observando-se a presença do ícone dedicado e ao ouvir o tom de alarme proveniente da máquina.
9. Abra a tampa da retorta. Retire o cesto do processador (Figura 3 M).

5. tecido incorporação

1. Ligue o automatizado embedder pressionando o botão liga / desliga (Figura 4A).
2. Aquecer por 1 h para garantir a parafina derreter. Espere até que o instrumento confirma que a parafina é completamente derretida, observando a temperatura do banho de parafina indicado pelo termômetro interno do instrumento.
3. Transferi manualmente todas as fitas transformadas da cesta processador rack embedder. Cada rack pode conter até 32 fitas. (Figura 4B, 4C).
4. Abra a tampa principal embedder (Figura 4, 4D, 4E).
5. Use a tela de toque no computador instrumento para sinalizar para o robótico sistema que está sendo um rack inserido (Figura 4F).
6. Abra a tampa de caixa de entrada (Figura 4). Insira a cremalheira da caixa de entrada. Cada embedder pode conter até 4 cremalheiras simultaneamente (Figura 4 H, 4I). Feche a tampa de caixa de entrada (Figura 4J).
7. Use a tela de toque no computador instrumento para iniciar o processo de incorporação, de acordo com a tabela 2 (Figura 4 K).
   Nota: Cada rack de 32 cassettes leva 45 min para ser incorporado.
8. Espere até que o instrumento confirma o fim do protocolo, observando-se a presença do ícone dedicado (Figura 4 L).
9. Retire o cesto de saída (Figura 4 M). Feche a tampa principal embedder.
10. Remova os blocos incorporados (contendo os eixos de orientação) do rack. Transferi os blocos incorporados em uma caixa de papelão de armazenamento.

6. micrômetro seccionamento

1. Ligue a placa de resfriamento do micrótomo. Definir a temperatura entre -8 e -10 ° C.
2. Prepara o banho termostático água do micrótomo, contendo 2 L de água destilada. Regule a temperatura do banho de água entre 42-45 ° C.
3. Lugar da parafina incorporado blocos na placa de resfriamento. Espere pelo menos 5 min para permitir que os blocos esfriar.
4. Leve a um quarteirão da placa de resfriamento e coloque-o no suporte do bloco do micrótomo.
5. Defina o micrótomo corte espessura a 10 µm. Trim o bloco por um corte 6 vezes em 10 µm de espessura.
6. Altere a configuração da espessura do micrótomo de 10 µm a 3 µm. corte um 3 µm seção para hematoxilina e eosina (H & E) coloração.
7. Recolha a seção 3 µm com uma escova pequena. Colocar a seção 3 µm em banho-Maria, colocando-lo cuidadosamente na superfície da água para reduzir as rugas de tecidos. Recolha a seção de tecido do banho de água controlado termostaticamente sobre uma lâmina de vidro único.
   1. Se necessário, corte seções adicionais.
8. Rotule a lâmina de vidro, por escrito, a identificação da amostra.
9. Coloque os slides em um forno de 37 ° C pelo menos 10 min.
10. Colocar as lâminas de vidro em racks para análise imediata ou em caixas de armazenamento.

7. hematoxilina e eosina (H & E) coloração

1. Ligue o corante automatizado pressionando o botão de energia. Permita a inicialização do braço robótico, observando-se a mudança da barra de carregamento sobre o monitor de instrumento.
2. Inserir as lâminas de vidro dentro do rack de corante, inserindo verticalmente até 30 slides.
3. Rotule o rack com a tag plástico de identificação (RFID) adequado radiofrequência. Colocação de etiquetas de RFID é um sistema de identificação do protocolo de coloração correto carregado para o computador de corante.
4. Insira a cremalheira do corante. Permitir que o computador automaticamente carregar e iniciar o protocolo de coloração de acordo com o reconhecimento da tag RFID.
   Nota: O protocolo para coloração H & E é descrito no tabela 3.

8. coloração imuno-histoquímica

1. Execute a imuno-histoquímica e Mallory tricromo de coloração como descrito anteriormente,⁷.

Results

Colite crônica experimental, induzida pela administração repetida de DSS na água potável é um modelo murino de inflamação intestinal, muito parecidos com humanos IBD^8,9. A Figura 1 descreve os efeitos do tratamento de DSS, incluindo cólon encurtamento (figura 1A), um parâmetro utilizado para marcar a presença de inflamação induzida por DSS e Colônica expressão de genes pr...

Discussion

Nós utilizamos diferentes etapas automatizadas durante a preparação dos tecidos murino para análise histopatológica. Este protocolo visa proporcionar dicas técnicas para aumentar a reprodutibilidade e a padronização de todo o processo, melhorando assim a qualidade geral da avaliação histopatológica final. Implementamos automatizado de instrumentos e métodos para a preparação e a incorporação de tecidos, rotineiramente utilizados em instalações de núcleo de patologia para o estudo de espécimes humanos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Reagente de 414605 Carlo Erba anidro
absoluto ETOH	Honeywell	02860-1L	reagente
Sulfato de potássio de alumínio	SIGMA	A6435	Reagente
de anilina	SIGMA	415049
carbocal Fucsina	SIGMA	C4165	reagente
CD11b (clone M1 / 70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	anticorpo
CD20 IHC (clone SA275A11)	Biolegend		150403 anticorpo
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	anticorpo
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	anticorpo
CD45.2 (clone 104)	BioLegend	109837	anticorpo
CD8 (53-6.7)	BD Biosciences	553031	anticorpo
Tampão citrato pH 6 10x	SIGMA	C9999	reagente
Dab	Vector Laboratories	SK-4100	reagente
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	reagente
DSS	TdB Consultancy	DB001	reagente
EDTA	SIGMA	E9884	reagente
EnVision Flex Reagente bloqueador de peroxidase	DAKO		compreso em GV80011-2
EnVision Flex Substrate	DAKO		compreso em GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		compreso em GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		compreso em GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	reagente
F4/80 (clone BM8)	BioLegend		123108 anticorpo
Formalina	PanReac	2,529,311,215	reagente
acético glacial	SIGMA	71251	reagente
cabra-anti-Rat-HRP	Agilent DAKO	P0448	anticorpo
hematoxilina	DIAPATH	C0303	reagente
LEICA micrótomo rotativo (RM2255)	Leica	RM2255	equipamento
Ly6g (clone 1A8)	BD Biosciences	551459	anticorpo
Óxido de Mercúrio II	SIGMA	reagente	203793
Omnis Clearify Clearing Agent	DAKO	CACLEGAL	reagente
Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	reagente
Orange G	SIGMA	O3756	reagente
Parafina	Reagente Sakura	7052
Peloris	LEICA		equipamento
Percoll	SIGMA	P4937	reagente
RPMI 1640 sem L-Glutamina	Microgem	L0501-500	reagente
STS020	Equipamento	Leica
Tissue-Teck Paraform Seccional	SAKURA	7022	equipamento
Tissue-Tek automatizado parafina embedder	Sakura		equipamento
xileno	J.T.Baker	8080.1000	reagente