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Usando sistemas robóticos para processar e incorporar Colônica murino amostras para análise histológica

DOI:

10.3791/58654

January 7th, 2019

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Erratum Notice

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 2/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

Summary

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Falta de padronização para processamento do tecido murino reduz a qualidade da análise histopatológica murino em comparação com espécimes humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o exame histopatológico dos tecidos do cólon inflamados e uninflamed murino para mostrar a viabilidade de sistemas robóticos rotineiramente utilizados para processamento e incorporação de amostras humanas.

Abstract

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A compreensão de doenças humanas foi grandemente ampliada graças ao estudo de modelos animais. Não obstante, avaliação histopatológica de modelos experimentais precisa ser tão rigoroso que o aplicado para amostras humanas. Com efeito, conclusões confiáveis e precisos criticamente é influenciado pela qualidade da preparação de secção de tecido. Aqui, descrevemos um protocolo para análise histopatológica de tecidos murino que implementa várias etapas automatizadas durante o procedimento, desde a preparação inicial para a incorporação de parafina das amostras murino. A redução de variáveis metodológicas através de padronização de protocolo rigoroso de procedimentos automatizados contribui para maior confiabilidade global de murino análise patológica. Especificamente, este protocolo descreve a utilização de processamento automatizado e incorporando sistemas robóticos, rotineiramente utilizado no processamento do tecido e parafina incorporação de amostras humanas, para processar amostras murino de inflamação intestinal. Podemos concluir que a confiabilidade do exame histopatológico de tecidos murino é significativamente maior em cima da introdução de técnicas padronizadas e automatizadas.

Introduction

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Nas últimas décadas, vários modelos experimentais foram desenvolvidos para dissecar os mecanismos patogénicos, levando a doenças humanas1,2. Para avaliar a gravidade de uma doença, os pesquisadores devem avaliar o efeito de um tratamento e estudar as variações de arquiteturais citológicas e histológicas ou a quantidade de inflamação3. Para executar esses modelos experimentais, detalhadas análises histopatológicas são necessários, muitas vezes comparando amostras de murino e humano4,5.

Além disso, amos....

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Protocol

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Procedimentos de animais foram aprovados pelo Ministério da saúde (auth. 127/15, 27/13) italiano e seguiram as orientações de cuidados com animais do Instituto Europeu de Oncologia IACUC (Comité de uso e cuidados institucionais do Animal)

1. crônica colite indução pela administração repetitiva de DSS

  1. Idade separada e sexo combinam ratos em 2 grupos (tratamento DSS vs controle de H2O, pelo menos 5 littermates ratos por grupo experimental).
  2. Administrar 2,5% DSS (40 kDa) na água potável por 7 dias para o grupo de tratamento e água ao grupo controle.
    Nota: Esse modelo induz um transmural crônic....

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Results

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Colite crônica experimental, induzida pela administração repetida de DSS na água potável é um modelo murino de inflamação intestinal, muito parecidos com humanos IBD8,9. A Figura 1 descreve os efeitos do tratamento de DSS, incluindo cólon encurtamento (figura 1A), um parâmetro utilizado para marcar a presença de inflamação induzida por DSS e Colônica expressão de genes pr.......

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Discussion

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Nós utilizamos diferentes etapas automatizadas durante a preparação dos tecidos murino para análise histopatológica. Este protocolo visa proporcionar dicas técnicas para aumentar a reprodutibilidade e a padronização de todo o processo, melhorando assim a qualidade geral da avaliação histopatológica final. Implementamos automatizado de instrumentos e métodos para a preparação e a incorporação de tecidos, rotineiramente utilizados em instalações de núcleo de patologia para o estudo de espécimes humanos.

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Agradecemos ao departamento de patologia do Hospital Policlínico IRCCS, Milão para suporte técnico e a facilidade de Animal OIE para assistência na pecuária.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagente de 414605 Carlo Erba anidro
absoluto ETOHHoneywell02860-1Lreagente
Sulfato de potássio de alumínioSIGMAA6435Reagente
de anilinaSIGMA415049
carbocal FucsinaSIGMAC4165reagente
CD11b (clone M1 / 70)TONBO biosciences35-0112-U100anticorpo
CD20 IHC (clone SA275A11)Biolegend150403 anticorpo
CD3 (17A2)TONBO biosciences35-0032-U100anticorpo
CD4 (GK1.5)BD Biosciences552051anticorpo
CD45.2 (clone 104)BioLegend109837anticorpo
CD8 (53-6.7)BD Biosciences553031anticorpo
Tampão citrato pH 6 10xSIGMAC9999reagente
DabVector LaboratoriesSK-4100reagente
DPBS 1xMicrogemL0615-500reagente
DSSTdB ConsultancyDB001reagente
EDTASIGMAE9884reagente
EnVision Flex Reagente bloqueador de peroxidaseDAKOcompreso em GV80011-2
EnVision Flex SubstrateDAKOcompreso em GV80011-2
EnVision Flex/HRPDAKOcompreso em GV80011-2
EnVision Flex+ Rat LinkerDAKOcompreso em GV80011-2
EosinVWR1.09844reagente
F4/80 (clone BM8)BioLegend123108 anticorpo
FormalinaPanReac2,529,311,215reagente
acético glacialSIGMA71251reagente
cabra-anti-Rat-HRPAgilent DAKOP0448anticorpo
hematoxilinaDIAPATHC0303reagente
LEICA micrótomo rotativo (RM2255)LeicaRM2255equipamento
Ly6g (clone 1A8)BD Biosciences551459anticorpo
Óxido de Mercúrio IISIGMAreagente203793
Omnis Clearify Clearing AgentDAKOCACLEGALreagente
Omnis EnVision Flex TRSDAKOGV80011-2reagente
Orange GSIGMAO3756reagente
ParafinaReagente Sakura7052
PelorisLEICAequipamento
PercollSIGMAP4937reagente
RPMI 1640 sem L-GlutaminaMicrogemL0501-500reagente
STS020EquipamentoLeica
Tissue-Teck Paraform SeccionalSAKURA7022equipamento
Tissue-Tek automatizado parafina embedderSakuraequipamento
xilenoJ.T.Baker8080.1000reagente
de etanol de azul ácido

References

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  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Gen....

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Robotic Tissue ProcessingMurine Sample EmbeddingHistological Analysis ProtocolAutomated Paraffin EmbeddingColonic Murine TissueIntestinal Inflammation ModelH E Staining ValidationImmunohistochemical StainingTissue Cassette PreparationAutomated Processor Operation

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