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Artigo de método

Fabricação de matriz de cartilagem-derivado Decellularized andaimes

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DOI:

10.3791/58656

⸱

7 de janeiro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, University Medical Center Utrecht, The Netherlands, 2Department of Veterinary Medicine, Equine Surgery, University of Utrecht, The Netherlands

Neste artigo

Resumo

Decellularized andaimes derivado de cartilagem podem ser usados como um andaime para guia de reparação da cartilagem e como um meio para regenerar o tecido osteocondral. Este documento descreve o processo de decellularization em detalhes e fornece sugestões para usar estes andaimes em configurações in vitro.

Resumo

Defeitos osteocondrais faltam capacidade intrínseca reparação suficiente para regenerar tecidos funcionalmente som do osso e cartilagem. Nesta medida, cartilagem pesquisa centrou-se no desenvolvimento de andaimes regenerativas. Este artigo descreve o desenvolvimento de andaimes que derivam-se completamente da matriz extracelular da cartilagem natural, vindo de um doador de equino. As aplicações potenciais dos andaimes incluem produzindo aloenxertos para reparação da cartilagem, servindo como um andaime para tecido osteocondral engenharia e fornecendo modelos in vitro para estudar a formação de tecido. Por decellularizing o tecido, as células do dador são removidas, mas muitas das dicas bioativas naturais são pensadas para ser mantido. A principal vantagem do uso de um andaime tão natural em comparação com um andaime produzido sinteticamente é que não mais functionalization de polímeros é necessária para a regeneração do tecido osteocondral unidade. Os matriz da cartilagem-derivado andaimes podem ser usados para a regeneração de tecidos do osso e cartilagem nas configurações tanto in vivo e in vitro.

Introdução

Defeitos da cartilagem articular no joelho causadas por eventos traumáticos podem levar ao desconforto e acima de tudo, podem ter um grande impacto na vida da população jovem e ativo1,2,3. Além disso, danos na cartilagem em uma idade jovem podem levar a um início mais rápido da osteoartrite mais tarde na vida4. Atualmente, a única terapia de resgate para osteoartrite generalizada do joelho é a cirurgia de substituição articular. Como a cartilagem é um tecido avascular, aneural e hipocelular, sua capacidade regenerativa é severamente limitada. Portanto, abordagens de medicina regenerativa são procuradas para ajudar e estimular a capacidade regenerativa do tecido nativo. Para esta finalidade, os andaimes são projetados e usados como qualquer célula-portador ou como um material indutivo que incita a diferenciação e regeneração do tecido nativo células5 do corpo.

Decellularized andaimes têm sido amplamente estudados dentro medicina regenerativa6. Teve algum sucesso, por exemplo, em ajudar a regeneração da pele7, estruturas abdominal8e tendões9. A vantagem de usar andaimes decellularized é sua origem natural e sua capacidade de reter as sugestões bioativas que atraem e induzem a diferenciação celular em linhagem adequada necessária para reparação de tecido6,10. Além disso, desde que a matriz extracelular (ECM) é um biomaterial natural, e decellularization impede uma resposta imune potencial removendo conteúdo celular ou genético, questões relativas à biocompatibilidade e biodegradabilidade são superados.

Andaimes de matriz de cartilagem-derivado (CDM) demonstraram chondrogenic grande potencial em experimentos in vitro, quando inoculado com células estromais mesenquimais11. Além disso, estes andaimes têm mostrado o potencial para o tecido ósseo de forma através da ossificação endocondral localizações ectópicas em configurações vivo em12. Como andaimes CDM orientar a formação de ambos nos ossos e tecido cartilaginoso, estes andaimes podem ter potenciais para reparação de defeitos osteocondrais além de reparação da cartilagem.

Este artigo descreve um protocolo adaptado de Yang et al (2010)13 para a produção de andaimes de MDL decellularized de equino sufocar a cartilagem. Estes andaimes são ricos em colágeno tipo II e desprovida de células e não contêm qualquer glicosaminoglicanos (GAGs) após decellularization. Experimentos in vitro e in vivo no reparo de defeito condral (osteo) podem ser realizados usando estes andaimes.

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Protocolo

Para este protocolo, obteve-se asfixiar equinos cartilagem de cavalos que tinham morrido de outras causas de osteoartrite. Tecido foi obtido com a permissão dos proprietários, em conformidade com as normas de éticas institucionais.

Nota: Este protocolo descreve a fabricação de andaimes da cartilagem de equina decellularized, que pode ser usado para aplicações como plataformas de cultura de tecidos in vitro ou para implantação na vivo em estratégias de medicina regenerativa. As etapas de tratamento enzimático devem ser realizadas descrito por ordem cronológica.

1. colheita de cartilagem Articular do doador (cadavéricos) articulações

  1. Em frente da etapa de colheita, preparar 1 L de cartilagem, solução de lavagem, consistindo de estéril fosfato salino (PBS), suplementado com 100 U/mL penicilina, 100 µ g/mL Estreptomicina e 1% (v/v) anfotericina b.
  2. Use luvas e avental durante todo o procedimento colheita, desde que o doador pode transportar patógenos.
  3. Obter uma articulação intacta (cadavérico) para isolamento de cartilagem.
    Nota: Neste ponto, a pele ao redor da articulação ainda está intacta. Cartilagem de equinos asfixiar Obtida de cavalo foi usada no presente protocolo, mas outras articulações de outras espécies também podem ser usadas.
  4. Retire a pele que fica ao redor da área comum de interesse usando um bisturi e uma pinça cirúrgica. Além disso, remova excessivo de gordura e o tecido muscular se necessário, sem danificar a articulação subjacente. Opcionalmente, transferi o cadáver preparado para uma câmara de segurança biológica.
  5. Para executar uma artrotomia, isto é, uma separação da articulação, primeiro defina o local onde a articulação articula-se através da realização de extensão e flexão da articulação.
  6. Remova cuidadosamente o mais camadas de gordura, músculos e tendões com um bisturi e pinça cirúrgica para abrir a área comum.
  7. Fazer uma incisão para alcançar a cavidade articular.
    Nota: A cavidade articular é preenchida com líquido sinovial, que pode gotejar da cavidade ao realizar uma incisão correta.
  8. Continue a abrir-se a articulação completamente cortando através dos tendões que manter a articulação unida.
  9. Inspecione a cartilagem por quaisquer danos macroscópicos.
    Nota: Se a cartilagem articular não tem uma aparência brilhante e macia ou evidente bolhas, fissuras ou defeitos estão presentes, descarte a cartilagem.
  10. Use um bisturi estéril para remover a cartilagem do osso subcondral. Corte todo o caminho até o osso subcondral também remover a zona profunda da cartilagem (Figura 1). Para impedir que a cartilagem da secagem, regularmente gotejamento cartilagem solução de lavagem na cartilagem.
    Nota: Neste momento, não importa o tamanho das fatias de cartilagem.
  11. Recolha as fatias de cartilagem em tubos de 50 mL contendo cartilagem previamente preparada (Figura 2A) de solução de lavagem.
  12. Depois de coletar a cartilagem de todas as áreas de interesse, snap congelar as fatias de cartilagem em nitrogênio líquido por 5 min.
  13. Transferir as fatias de cartilagem para tubos de 50 mL e imediatamente lyophilize as fatias de cartilagem por 24 h em um secador de gelo. Defina o congelamento secador a aproximadamente 0,090 mbar enquanto o condensador de gelo é-51 ° C (Figura 2B).
  14. Armazene as fatias de cartilagem no lugar seco à temperatura ambiente até nova utilização.
    Nota: Até o ponto de formação do andaime, as soluções e a cartilagem não precisa ser preparado e Tratado de forma estéril.

2. criação de Decellularized partículas de cartilagem

  1. Mergulhe as fatias de cartilagem liofilizada em nitrogênio líquido.
  2. Diretamente moa as amostras manualmente ou por uma máquina de trituração. Quando as fatias de cartilagem afiar manualmente, use um almofariz e um pilão e moer as fatias por aproximadamente 45 min, até que eles são pulverizadas (Figura 2 e 2D). Quando moagem automaticamente, use uma máquina de trituração à velocidade pré-definida por alguns segundos até um minuto, até que as fatias de cartilagem snap-congelados são pulverizadas.
    Nota: Pre-legal a argamassa ou compartimento de moagem da máquina trituração pela adição de nitrogênio líquido. Ao usar uma máquina de trituração, certificar-se de que todas as partículas são terra, e que nenhuma partícula permanecer no fundo do compartimento de moagem.
  3. Peneire as partículas de cartilagem para se livrar de peças maiores, usando uma peneira com uma malhagem de 0,71 mm.
  4. Armazene as partículas em lugar seco à temperatura ambiente.

3. enzimática Decellularization com tripsina 0.25%-EDTA

  1. Preparar a solução de digestão, consistindo de tripsina 0,25% com EDTA suplementado com 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL Estreptomicina e 1% (v/v) anfotericina B. loja a solução a 4 ° C.
    Nota: Trypin é uma protease que degrada proteínas residentes no tecido da cartilagem. Esta etapa enzimática abrirá a estrutura da cartilagem densa.
  2. Encha os tubos de 50 mL com as partículas de cartilagem pulverizado até um volume de aproximadamente 7,5 mL por tubo.
  3. Incube as partículas de cartilagem com a solução de digestão preparado a 37 ° C por 24 h no total, ao mesmo tempo refrescante a solução de digestão todas as 4h.
    1. Primeiro, adicione 30 mL da solução de digestão a cada tubo de 50 mL que contém partículas de cartilagem.
    2. Em seguida, resuspenda as partículas usando um vórtice ou pipeta para que todas as partículas estão expostas a solução enzimática.
    3. Incube as amostras por 4 h a 37 ° C em um rolo.
    4. Para atualizar a solução de digestão, centrifuga os tubos por 20 min a 3113 x g, para causar a sedimentação das partículas de cartilagem. Desprezar o sobrenadante.
      Nota: O sobrenadante se tornará mais claro com cada período de incubação de tripsina.
    5. Repita o passo 3.3.1–3.3.4 até as partículas têm sido incubadas com a solução de digestão por 6 ciclos de 4 h.
  4. Após o ciclo final, remover o sobrenadante após centrifugação e lavar as partículas em 30 mL da solução de lavagem duas vezes de cartilagem. Centrifugar as partículas por 20 min a 3113 x g, entre cada uma das lavagens.

4. enzimática Decellularization com tratamento de Nuclease

  1. Prepare uma solução de Tris-HCl pH 7,5 em água desionizada de 10 mM.
  2. Adicione 50 desoxirribonuclease U/mL e 1 ribonuclease U/mL A de tampão Tris-HCl, para obter a solução de nuclease.
    Nota: Esta etapa é executada para degradar especificamente desoxirribonucleases e ribonucleases.
  3. Para remover a cartilagem lavagem com solução de partículas de cartilagem (passo 3.4), centrifugar por 20 min a 3.113 x ge remover o sobrenadante.
  4. Adicione 30 mL da solução de nuclease para as partículas de cartilagem e mexa as partículas através da solução, certificando-se de que todas as partículas são expostas para a solução de nuclease.
  5. Incubar as amostras em um rolo de 4 h a 37 ° C.
  6. Remover a solução de nuclease por centrifugação as partículas de cartilagem por 20 min a 3.113 x g e descartar o sobrenadante.
  7. Lave as amostras adicionando 30ml de 10 mM Tris-HCl solução sem a desoxirribonuclease e ribonuclease às partículas de cartilagem. Resuspenda as partículas e deixar as amostras em um rolo para 20 h à temperatura ambiente.

5. detergente Decellularization

  1. Fazer a solução detergente dissolvendo-se 1% (v/v) em PBS Octoxinol-1.
  2. Remova a solução de Tris-HCl de partículas de cartilagem por centrifugação por 20 min a 3.113 x g e descartar o sobrenadante.
  3. Adicione 30 mL da solução detergente 1% preparado para as partículas de cartilagem. Resuspenda as partículas de cartilagem com cuidado para evitar a formação de espuma da solução.
    Nota: Esta etapa divide as membranas celulares.
  4. Incube as amostras em um rolo por 24 horas à temperatura ambiente em um rolo.
  5. Remover a solução detergente por centrifugação por 20 min a 3.113 x g e descartar o sobrenadante.
  6. Para remover todos os restos das soluções decellularization, lave as partículas de cartilagem em 6 ciclos de 8 h em 30 mL de solução de lavagem de cartilagem. Realize a lavagem em um rolo à temperatura ambiente.
    1. Para mudar para a próxima lavagem, centrifugar a suspensão por 20 min a 3.113 x g, desprezar o sobrenadante e Adicionar nova cartilagem, solução de lavagem.
  7. Deixe a última lavagem dos tubos e armazenar as partículas de cartilagem decellularized a-80 ° C.

6. Criando andaimes das partículas Decellularized

  1. Se as partículas foram armazenadas a-80 ° C, descongele tubos fechados que contêm partículas de cartilagem em água quente antes de criar os andaimes.
  2. Transferi as partículas de cartilagem com uma concha pequena para um molde cilíndrico, por exemplo, um tubo de ensaio plástico com um diâmetro de 8 mm e uma altura de 2 cm.
  3. Ao colocar as partículas de cartilagem no molde plástico, pressione todas as bolhas de ar para fora para evitar cáries no cadafalso e encher o molde até a borda.
    Nota: Será mais difícil tomar os andaimes fora um molde metal depois da formação do andaime, que pode levar a rachaduras no cadafalso.
  4. Congelar os moldes com partículas de cartilagem para min 10 a-20 ° C.
  5. Lyophilize os andaimes de cartilagem dentro seus moldes por 24 h em um secador de gelo.
  6. Após a liofilização, pegue o andaime fora do molde (Figura 3) e cross-link-los com radiação ultravioleta (UV) luz à distância de 30 cm e 365 nm durante a noite.
  7. Para utilizar os andaimes para cultura de células in vitro ou in vivo implantação, esterilize os andaimes com, por exemplo, gás de (EtO) de óxido de etileno.
    Nota: Esterilização EtO é executada por uma parte externa.

7. caracterização dos andaimes Decellularized com colorações histológicas

Nota: Para garantir a completa decellularization e visualizar o caráter natural restante da cartilagem, executar várias colorações histológicas antes de usar os andaimes em qualquer experimento, incluindo hematoxilina e eosina (H & E) coloração para garantir decellularization, safranina-O coloração para visualizar a presença residual de mordaça, colágeno tipo I imuno-histoquímica para diferenciar entre o conteúdo de colágeno e colágeno tipo II imuno-histoquímica para diferenciar entre o conteúdo de colágeno.

  1. Corte os andaimes em fatias finas de aproximadamente 3 mm com um bisturi.
    Nota: Se os andaimes são cortados em tamanhos maiores ou menores, as durações dos ciclos de desidratação precisam ser adaptado.
  2. Incorporar os andaimes em uma queda de 4% (p/v) alginato e induzir o cross-linking, adicionando um volume semelhante de 3,7% em buffer não formol que contém 20 mM CaCl2.
    Nota: Incorporação de alginato torna as fatias de andaime mais rígida em comparação com as etapas de lavagem antes da incorporação de parafina. No caso que os andaimes têm sido célula-semeado ou na vivo implantado, incorporação de alginato não é necessário, como a composição dos andaimes será resistente o suficiente devido à incorporação de ECM pelas células.
  3. Desidratar as amostras por colocando-os em uma série de etanol gradual, começando com uma hora ciclos de 70%, 96%, 96%, 100% e 100% de etanol, seguido por dois ciclos de 1h de xileno e terminando com dois ciclos de 1h de parafina a 60 ° C.
  4. Após desidratação, parafina-incorporar as amostras em um molde e arrefecer as amostras.
  5. Corte as amostras com um micrótomo em fatias de 5 μm de espessura.
  6. Antes de coloração, hidratar as amostras, colocando-os em uma série de etanol classificados retornado. Comece com duas lavagens de xileno por 5 min, seguido por 2 lavagens de etanol 100%, 95% e 70% por 3 min por lavagem. Finalmente, lave as amostras 3 vezes em água por 2 min.
    Nota: No caso de usar alginato para processar amostras para incorporação de parafina, certifique-se de lavar o alginato com ácido cítrico de 10 milímetros antes da reidratação das secções de parafina.
  7. Manchar as amostras com hematoxilina e eosina, safranina-O, colágeno I e colágeno II como descrito anterior11.

8. caracterização dos andaimes Decellularized com análises quantitativas

  1. Obter digests de papaína dos andaimes conforme descrito anteriormente,11.
  2. Realize um ensaio com um kit de quantificação de DNA baseado em fluorescência para medir o teor de DNA dobro-Costa dos andaimes para garantir a completa decellularization. Siga o protocolo fornecido pelo fabricante. Expresse a quantidade de DNA por peso seco do cadafalso.
  3. Realize um ensaio de dimethylmethylene azul para quantificar o restante dos GAGs dentro do andaime, conforme descrito anteriormente,11. Expresse a quantidade na mordaça por DNA.

9. propagação dos andaimes Decellularized

  1. Corte esterilizados andaimes da etapa 6,7 em 3mm fatias grossas.
  2. Transferi os andaimes em separado poços de uma placa de 6.
  3. Re-hidratar por pipetagem 1 mL de meio em cima do andaime andaimes com meio de cultura celular e deixe de molho por 30 min. Use condrócitos ou médio de expansão de células-tronco mesenquimais (MSC).
    Nota: Utilize o mesmo meio para reidratação de andaime quanto a cultura celular das células que será propagada. Condrócito expansão medium consiste em meios de comunicação modificados de Dulbecco (DMEM) com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), 100 penicilina U/mL, 100 μg/mL Estreptomicina e 10 ng/mL fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2). MSC expansão medium consiste em mínimo essencial média alfa (a-MEM) com 10% inactivadas pelo calor FBS, 0,2 mM 2-fosfato de ácido L-ascórbico, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL e 10 ng/mL FGF-2.
  4. Prepare 3 x 106 células em 100 μL de meio, que é o volume necessário para cada andaime com um diâmetro de 8 mm e uma altura de 3 mm.
    Nota: Vários tipos de células de diferentes espécies podem ser usados para propagação. Quando usando condrócitos ou células estromais mesenquimais, isole as células, como descrito anteriormente,11. Quando usando condrócitos, certifique-se de que eles não foram ampliados após a passagem de P1 a fim de minimizar o número de condrossarcoma condrócitos. Ao usar células estromais mesenquimais, eles devem ser testados na sua capacidade de diferenciação da linhagem multi, como descrito anteriormente,14.
  5. Pipetar 50 μL de preparada a suspensão de células em cima do andaime previamente embebido e incubar o andaime para 1 h a 37 ° C.
  6. Cuidadosamente Ligue o andaime de cabeça para baixo, pipetar os restantes 50 μL de suspensão de células deste lado do andaime e incubar durante 1 h a 37 ° C.
  7. Após a incubação, adicionar 3 mL de meio para os poços e cultura os andaimes célula-semeado a 37 ° C. Lidar com a placa de cultura com cuidado para evitar o desprendimento das células.
  8. Cultura os andaimes para o período de tempo necessário para o experimento e mudar o meio 2-3 vezes por semana. Pipeta lentamente e o mais distante longe do cadafalso quanto possível.
  9. Após o cultivo de célula-semeado cadafalso, cortado ao meio, os andaimes e processá-las para histologia e análises bioquímicas.

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Resultados

Decellularization de andaimes CDM sempre deve ser confirmado usando colorações histológicas, bem como usando a quantificação de DNA para medir a quantidade de restos de DNA. Decellularization insuficiente pode levar a respostas imunológicas indesejáveis que influenciam os resultados em configurações em vivo15,16,17. Para este método de decellularization específicos, o DNA foi abaixo da escala da ...

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Discussão

A ECM da cartilagem articular é muito denso e bastante resistente a tratamentos enzimáticos diferentes. O protocolo de decellularization de várias etapas descrito neste artigo aborda tal resistência e com êxito gera matrizes decellularized. Para conseguir isso, o processo se estende durante vários dias. Muitos processos de decellularization têm sido propostos para os diferentes tipos de tecidos,18, e este artigo descreve um protocolo apropriado para o decellularization da cartilagem. Neste protoco...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Os autores gostaria de reconhecer o Boot W. para assistência na produção dos andaimes. K.E.M. Benders é suportado pelo Alexandre Suerman Stipendium do University Medical Center. Levato R. e J. Malda são suportados pela Fundação holandesa de artrite (conceder acordos CO-14-1-001 e LLP-12, respectivamente).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
cadavéricaIsso pode ser obtido como material de descanso no açougue local ou centro veterinário.
Solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS)
Penicilina-estreptomicinaGibco15140
Anfotericina BThermo Fischer Scientific15290026
Nitrogênio
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenolThermo Fischer Scientific25200072
Tris-HCl pH 7,5
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovinoSigma-AldrichDN25
Ribonuclease A do pâncreas bovinoSigma-AldrichR6513
Triton X-100 (octoxynol-1)Sigma-AldrichX100
PapaínaSigma-AldrichP3125
Citrato trissódico di-hidratadoSigma-AldrichS4641
AlginatoSigma-Aldrich180947
Formalina
CaCl2
Etanol
Xileno
Parafina
Esterilização por óxido de etilenoSynergy Health, Venlo, Holanda
Células estromais multipotentes / condrócitos de doadoresMSCs e condrócitos podem ser isolados de articulações doadoras que são material de descanso, provenientes do açougue local ou centro veterinário.
MEM alfaThermo Fischer Scientific22561
Ácido L-ascórbico 2-fosfatoSigma-AldrichA8960
DMEMThermo Fischer Scientific41965
Albumina de soro bovino inativada por calorSigma-Aldrich10735086001
Fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2)R & D Systems233-FB
Kit de quantificação de DNA (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)Thermo Fischer ScientificP7581
1,9-Dimetil-Metileno Azul cloreto de zinco sal duploSigma-Aldrich341088
LiofilizadorSALMENKIPPALPHA 1-2 LD plus
Moinho analíticoIKAA 11 almofariz
Haldenwanger 55/0A
Placa de roloCATRM5
Centrífuga (para tubos de 50 mL)Eppendorf5810R
Cápsula (molde cilíndrico)TAAB8 mm plana
Superlite S UVLumatec2001AV
Incubadora
Micrótomo
Peneira (malha 0,71 mm)VWR34111229
Bisturi
Porta-bisturi Concha
Articulação líquido equinos /pilão básico pequena

Referências

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