Artigo de método

Diferenciação de células-tronco nervosas por um One-Step Plasma atmosférico frio tratamento In Vitro

DOI:

10.3791/58663

⸱

11 de janeiro de 2019

 ,  , 
1State Key Laboratory of Advanced Electromagnetic Engineering and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo visa proporcionar detalhadas etapas experimentais de um tratamento de plasma frio atmosférico sobre células-tronco neurais e detecção de imunofluorescência para aprimoramento de diferenciação.

Resumo

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Como o desenvolvimento da tecnologia da física de plasma, TVs de plasma atmosféricos frios (CAPs) têm sido amplamente investigados na descontaminação, tratamento de câncer, cicatrização de feridas, tratamento de canal, etc., formar um novo campo de pesquisa chamado medicina de plasma. Sendo uma mistura de espécies reactivas elétricas, químicas e biológicas, CAPs mostraram suas habilidades para aumentar a diferenciação de células-tronco nervosas ambos em vitro e in vivo e está se tornando um caminho promissor para o tratamento de doença neurológica no futuro. A notícia mais emocionante é que usando tampões pode realizar uma etapa e com segurança dirigido, diferenciação de células-tronco neurais (NSCs) para transporte de tecido. Demonstramos aqui o protocolo experimental pormenorizado de usando um dispositivo de jato CAP self-made para reforçar a diferenciação de NSC em C17.2-NSCs e células-tronco neurais rato primário, bem como observar o destino da célula por invertido e microscopia de fluorescência. Com a ajuda de mancha tecnologia, encontramos ambas as NSCs mostrou um ritmo acelerado de diferenciais que o grupo não tratado, e ~ 75% das NSCs seletivamente diferenciadas em neurônios, que são principalmente maduro, colinérgicos e motor neurônios.

Introdução

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A diferenciação dirigida de NSCs em uma certa linhagem para o transporte de tecido é considerada uma das mais promissoras terapias de doenças neurodegenerativas e neurotraumatic1. Por exemplo, os neurônios dopaminérgicos de catecolaminérgica são especialmente desejados no tratamento da doença de Parkinson (PD). No entanto, os métodos tradicionais para preparar as células desejadas para transporte tem muitos inconvenientes, tais como toxicidade química, formação de cicatriz ou outros, o que dificulta em grande parte as aplicações de NSCs em medicina regenerativa2. Portanto, é muito necessário encontrar uma maneira segura ....

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Protocolo

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1. culturas e Predifferentiation de pilha

  1. Predifferentiation e cultura de células-tronco neurais
    1. Prepare as lamelas de poli-D-lisina-revestido. Colocar uma lamínula estéril (20 mm de diâmetro) em uma placa de 12. Cubra o tampa de vidro com poli-D-lisina, 0,1% w/v, em água (Tabela de materiais) para uma melhor aderência da célula sobre as lamelas, seguindo os próximos passos.
      Nota: Condições ideais devem ser determinadas para cada linhagem celular e aplicativo.
      1. Assepticamente revesti a superfície da lamela com poli-D-lisina, 0,1% w/v, na água. Rocha suavemente para garantir um mesmo revestimento da super....

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Resultados

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Morfologia celular foi observada ao microscópio invertido todos os dias após o tratamento do CAP. A Figura 2 mostra as imagens do microscópio óptico comum de contraste de fase invertida da diferenciação celular em ambas as linhas de célula. O grupo tratados com plasma apresenta uma taxa acelerada diferenciação e uma relação de elevada diferenciação em relação ao grupo de fluxo de controle e gás.

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Discussão

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C17.2-NSCs é um tipo de células-tronco neurais imortalizado linha de células de rato neonatal cerebelar camada granulosa, desenvolvida por Snyder e outros10,11. C17.2-NSCs podem se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos e são amplamente utilizados em neurociência12. Em nosso estudo anterior, CAPs poderiam reforçar a diferenciação de C17.2-NSCs em neurônios. Um prova de princípio também realizou estudo usando NSCs rato prim.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo programa de estudioso de Huazhong, o fundo de inovação independente de Huazhong Universidade de ciência e tecnologia (n º 2018KFYYXJJ071) e a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. 31501099 e 51707012).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
LamínulaNEST801008
Poli-D-lisinaBeyotimeP0128
DMEM meioHyCloneSH30022.01Barmazenado a 4 &graus; C
Meio DMEM/F12HyCloneSH30023.01Barmazenado a 4 &graus; O
suplemento C N2Gibco17502048armazenado a -20 ° C e proteger da luz
suplemento B27Gibco17504044armazenado a -20 > C e proteger da luz
Soro fetalbovino HyCloneSH30084.03armazenado a -20 ° C, evite o congelamento e descongelamento repetidos
do soro do cavalo doadorHyCloneSH30074.03tored em -20 ° C, evite o congelamento e descongelamento repetidos
penicilina / estreptomicinaHyCloneSV30010armazenados a 4 graus; C
TripsinaHyClone25300054armazenado a 4 ° C
Solução PBSHyCloneSH30256.01Barmazenado a 4 > C
4% paraformaldeídoBeyotimeP0098armazenado a -20 ° C
TritonX-100SigmaT8787
Solução de Bloqueio de Soro de Cabra NormalVector LaboratoriesS-1000-20armazenado a 4 &graus; C
anti-NestinBeyotimeAF2215armazenado a -20 ° C, evite congelamento e descongelamento repetidos
anti-β-Tubulina IIISigma AldrichT2200armazenado a -20 &graus; C, evite o congelamento repetido e o descongelamento
anti-O4R& D Os sistemasMAB1326armazenados a -20 > C, evite congelamento e descongelamento repetidos
anti-NF200Sigmaarmazenados a -20 & C, evite congelamento e descongelamento repetidos
anti-ChATSigmaarmazenados a -20 ° C, evite congelamento e descongelamento repetidos
anti-LHX3Sigmaarmazenados a -20 ° C, evite o congelamento repetido e o descongelamento
anti-GABASigmaarmazenado a -20 ° C, evite congelamento e descongelamento repetidos
anti-serotoninaAbcam, Cambridge, MAarmazenados a -20 ° C, evite congelamento e descongelamento repetidos
anti-THAbcam, Cambridge, MAarmazenados a -20 ° C, evite o congelamento e o descongelamento repetidos
BeyotimeP0103diluição do anticorpo da coloração de Immunolarmazenado em 4 ° C
Cy3 Rotulado Goat Anti-Rabbit IgGBeyotimeA0516armazenado a -20 ° C e proteger da luz
Alexa Fluor 488- Rotulado GoatBeyotimeA0428armazenado a -20 ° C e proteger da luz
Anti-Mouse IgG 
Placa de 12 poçoscorning3512
25 cm2 frascocorning430639
Hoechst 33258BeyotimeC1018armazenado a -20 ° C e proteger da luz
Meio de montagemBeyotimeP0128armazenado a -20 ° C e proteger da luz
Microscópio de luzNanjing Jiangnan Novel Optics CompanyXD-202
Microscopia de fluorescênciaNikon80i
Amplificador de potência de alta tensãoPVX-4110
Fonte de alimentação DCSpellmanSL1200
Gerador de funçãoAligent 33521A
OsciloscópioTektronixDPO3034
Sonda de alta tensãoTektronixP6015A
de Tampão preliminar da

Referências

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  1. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
  2. Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
  3. Graves, D. B.

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