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Artigo de método

Pulmão microRNA Profiling através do ciclo estral em camundongos expostos de ozônio

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DOI:

10.3791/58664

⸱

7 de janeiro de 2019

 , 
1Pulmonary, Immunology and Physiology Laboratory, Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Aqui nós descrevemos um método para avaliar a expressão de pulmão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios usar ratos expostos ao ozônio ou ar filtrado em diferentes fases do ciclo estral.

Resumo

Criação de perfil de MicroRNA (miRNA) tornou-se de interesse para os investigadores que trabalham em diversas áreas de pesquisa da biologia e da medicina. Atuais estudos mostram um promissor futuro de usar miRNAs no diagnóstico e cuidados de doenças pulmonares. Aqui, definimos um protocolo para miRNA perfis para medir a abundância relativa de um grupo de miRNAs previstos para regular os genes inflamatórios no tecido do pulmão de um modelo de mouse de inflamação das vias aéreas induzida por ozônio. Porque tem sido demonstrado que os níveis de hormônio sexual circulante podem afetar a regulação da imunidade inata de pulmão em mulheres, a finalidade desse método é descrever um inflamatório miRNA perfilação protocolo em ratos fêmeas, levando em consideração o ciclo estral estágio de cada animal no momento da exposição do ozônio. Abordamos também abordagens aplicáveis bioinformática com miRNA uma métodos de identificação de descoberta e de destino usando- se, um software R/Bioconductor, e software de análise funcional de entender o contexto biológico e caminhos associados expressão diferencial de miRNA.

Introdução

microRNAs (miRNAs) são curtos (19-25 nucleotides), ocorrem naturalmente, não-codificantes moléculas de RNA. Sequências de miRNAs são evolutivas conservada entre espécies, sugerindo a importância de miRNAs na regulação de funções fisiológicas1. microRNA expression profiling tem provado para ser útil para identificar os miRNAs que são importantes na regulação de uma variedade de processos, incluindo a resposta imune, diferenciação celular, processos de desenvolvimento e apoptose2. Mais recentemente, os miRNAs foram reconhecidos por seu potencial uso no diagnóstico da doença e terapêutica. Para pesquisadores estudando os mecanismos de regulação gênica, medir miRNA expressão pode iluminar sistemas-nível modelos de processos regulatórios, especialmente quando informações miRNA são mescladas com mRNA profiling e outros dados de genoma-escala3. Por outro lado, os miRNAs também foram mostrados para ser mais estável que os mRNAs em uma variedade de tipos de amostra e também são mensuráveis com maior sensibilidade do que proteínas4. Isto levou a interesse considerável no desenvolvimento de miRNAs como biomarcadores para diversas aplicações de diagnósticos moleculares, incluindo doenças pulmonares.

No pulmão, miRNAs desempenham um papel importante nos processos de desenvolvimento e a manutenção da homeostase. Além disso, sua expressão anormal tem sido associada com o desenvolvimento e a progressão de várias doenças pulmonares5. Doença pulmonar inflamatória induzida pela poluição do ar tem demonstrado maior gravidade e pior prognóstico nas fêmeas, indicando que os hormônios e o ciclo estral podem regular pulmão inata imunidade e miRNA expressão em resposta aos desafios ambientais 6. no presente protocolo, usamos a exposição de ozônio, que é um componente importante da poluição do ar, para induzir uma forma de inflamação pulmonar em ratos fêmeas que ocorre na ausência de imunidade adaptativa. Usando ozônio, nós estão induzindo o desenvolvimento das vias aéreas hyperresponsiveness que está associada a danos nas células epiteliais das vias respiratórias e um aumento de neutrófilos e mediadores inflamatórios em vias aéreas proximais7. Atualmente, não existem protocolos bem descritos para caracterizar e analisar os miRNAs em todo o ciclo estral em camundongos expostos de ozônio.

Abaixo, descrevemos um método simples para identificar os estágios do ciclo estral e miRNA expressão no tecido pulmonar de ratos fêmeas exposto ao ozônio. Também abordamos a bioinformática eficazes abordagens para identificação miRNA descoberta e alvo, com ênfase na biologia computacional. Analisamos os dados de microarray usando- se, um software de R/Bioconductor que fornece uma solução integrada para a análise de dados a partir de experimentos de expressão de gene8. Análise de dados de matriz PCR de se tem uma vantagem em termos de poder sobre os procedimentos de teste-t com base quando usando o pequeno número de amostras/matrizes para comparar a expressão. Para compreender o contexto biológico miRNA dos resultados da expressão, usamos o software de análise funcional. Para entender os mecanismos de regulação transcricionais mudanças e prever os prováveis resultados, o software combina miRNA-expressão datasets e conhecimento a partir da literatura9. Esta é uma vantagem quando comparado com o software que só olham para o enriquecimento estatístico em sobreposição a conjuntos de miRNAs.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Penn State University.

1. avaliação do estágio do ciclo estral

  1. Corretamente, conter uma fêmea C57BL/6 mouse (8 – 9 semanas de idade) usando a técnica de contenção de rato com uma mão descrita em Machholz et al10.
  2. Encha a pipeta plástica estéril com 10 μL de água ultra pura.
  3. Introduza a ponta da pipeta plástica na vagina.
  4. Lave suavemente o líquido 4 a 5 vezes para coletar a amostra.
  5. Coloque o resplendor final contendo fluido vaginal em uma lâmina de vidro.
  6. Observe o resplendor imaculado vaginal sob um microscópio de luz com um objectivo de 20x.
    Nota: Animais que não apresentem ciclos regulares devido a pseudopregnancy ou outras causas que devam ser excluídos do experimento. É recomendável executar as secreções vaginais diárias pelo menos três ciclos consecutivos confirmar o simbolo.

2. a exposição ao ozônio

  1. Coloque um máximo de 4 ratos em dois recipientes de vidro 1,2 L com tampas de malha de arame e água ad libitum.
  2. Coloque um recipiente de vidro em câmara de ozônio e o outro em câmara de exposição de ar filtrado.
  3. Ajuste a concentração de ozônio aos níveis de ozono 2 ppm e monitor regularmente.
    Nota: O aparelho de ozônio proporciona um fluxo de ar regulamentado (> 30 ar alterações/h) com controle de temperatura (25 ° C) e umidade relativa (50%). O sistema gera o ozônio por um ozonizador de descarga elétrica, que é monitorado e controlado por um analisador de ozônio ultravioleta e controladores de fluxo de massa, conforme descrito anteriormente,11.
  4. Remova os recipientes de vidro após 3 h de exposição de ar de ozônio/filtrada. Retorno de animais de gaiola com roupa de cama, comida e água ad libitum.

3. pulmão coleção

  1. 4h após a exposição, anestesiar animais com uma injeção intraperitoneal de uma cetamina/xilazina cocktail (90 mg/kg de cetamina, xilazina 10 mg/kg).
    Nota: Para confirmar um nível adequado de anestesia, verifique o mouse para um pedal reflex (pitada de dedo firme) e ajuste o anestésico conforme necessário.
  2. Umedecer a pele de rato com etanol a 70%.
  3. Fazer uma incisão de 2 cm, usando uma operação tesoura e pinça cirúrgica para expor a veia cava.
  4. Sacrificar os ratos por transecção da veia cava e aorta. Se necessário, introduza uma agulha de calibre 21G a veia cava acima das veias renais para coletar o sangue antes da sangria. Alternativamente, colete sangue através de punção do coração seguindo protocolos padrão.
  5. Use uma tesoura cirúrgica para abrir a cavidade abdominal e remover a pele/superior músculo, se movendo para cima na direção das costelas.
  6. Use uma tesoura cirúrgica para perfurar o diafragma.
    Nota: Os pulmões entrará em colapso longe do diafragma.
  7. Corte da caixa torácica usando uma tesoura cirúrgica para expor o coração e os pulmões.
  8. Usando fórceps, tomar um 1,5 mL RNase-livre microcentrifuga tubo e mergulhe-o em nitrogênio líquido para encher o tubo.
    Nota: Use óculos e luvas protetoras para lidar com nitrogênio líquido.
  9. Remover os pulmões, coloque-os nos tubos RNase-livre microcentrifuga 1,5 mL preenchidos com nitrogênio líquido para snap-congelar o tecido e aguarde alguns segundos até que o líquido evapora.
  10. Feche a tampa do tubo e armazenar o tecido a-80 ° C até o uso.

4. RNA preparação

  1. Pulverize todo pulmões usando um pulverizador de aço inoxidável de tecido.
    Nota: O pulverizador de tecido deve ser colocada em nitrogênio líquido antes de usar. Limpe o pulverizador após cada utilização com solução de RNAse.
  2. Dividir os pulmões pulverizados e colocar em dois tubos de 1,5 mL (metade do pulmão cada).
  3. Adicione 500 µ l de tiocianato de guanidínio por tubo de amostra e misture.  Homogeneizar a amostra usando 18g, 21g e agulhas de 23 G, respectivamente.
    Nota: As amostras podem ser cravadas com 5,6 x 108 cópias de um pequeno RNA pico-no controle (a partir de uma espécie diferente) antes de prosseguir com a extração.
  4. Adicionar 500 µ l de etanol para cada amostra e vórtice por 15 s.
  5. Carga a mistura em uma coluna de rotação em um tubo de coleta e centrifugar a 12.000 x g por 1 min. descartar o escoamento.
  6. Para DNase eu tratamento (em colunas);
    1. Adicione 400 µ l de RNA Wash Buffer e centrifugar a 12.000 x g por 1 min.
    2. Num tubo de RNase-livre, adicione 5 µ l de DNase I e 75 µ l de 1 x digestão do DNA de buffer e misture. Adicione a mistura diretamente para a matriz de coluna.
    3. Incube a temperatura ambiente por 15 min.
  7. Adicione 400 µ l de solução prélavagem RNA para a coluna e centrifugar a 12.000 x g por 1 min. descarte o escoamento e repita este passo.
  8. Adicione 700 µ l de tampão de lavagem do RNA para a coluna e centrifugar a 12.000 x g por 1 min. descartar o escoamento.
  9. Centrifugar a 12.000 x g por 2 min remover o restante reserva. Transferi a coluna para um tubo de RNase-livre.
  10. Para eluir RNA, adicione 35 µ l de DNase/RNase-livre água diretamente para a matriz de coluna e centrifugar a 12.000 x g por 1,5 min.
  11. Medir a concentração de RNA total (260 nm) e pureza usando um espectrofotômetro. Siga as instruções para realizar a quantificação de RNA em uma amostra de 1,5 µ l alíquota. Branco do instrumento com DNase/RNase-livre a água utilizada para a eluição.
    Nota: Uma relação de 260/280 de ~2.0 é geralmente aceite como "pura" para o RNA. Concentração de RNA típica geralmente varia entre 750 e 2.500 ng / µ l.
  12. Loja a-80 ° C.

5. miRNA Profiling

  1. Retrô-transcrever RNAs pequeno, uso 200 ng do RNA total.
    1. Prepare a mistura de transcrição reversa reação no gelo (volume total por reação é de 20 µ l). Para cada reação, adicione 4 µ l de 5 x tampão, 2 µ l de 10 x nucleotídeos misturam, 2 µ l de transcriptase reversa e 2 µ l de água livre de RNase. Misture todos os componentes e alíquota em 600 µ l livre de RNAse tubos plásticos (10 µ l do mix por reação).
      Nota: A mistura de transcrição reversa mestre contém todos os componentes necessários para a síntese do cDNA da primeiro-costa exceto modelo RNA.
      Nota: Calcule o volume em excesso (10%) ao preparar a mistura de mestre.
    2. Adicionar o modelo de RNA (200 ng em 10 µ l) para cada tubo contendo a mistura de mestre-transcrição reversa. Mix, centrifugar por 15 s a 1.000 x ge armazená-los no gelo até colocação em thermocycler ou bloco seco.
    3. Incubar durante 60 min a 37 ° C.
    4. Incubar durante 5 min à 95 ° C e coloque os tubos no gelo.
    5. Dilua o cDNA adicionando-se 200 µ l de água livre de RNase para cada reação de transcrição reversa 20 µ l.
  2. Realize o PCR em tempo real usando o Mouse resposta inflamatória e auto-imunidade miRNA matriz de PCR.
    1. Preparar uma mistura de reação (volume total 1100 µ l): para cada reação, adicionar 550 µ l do mix de mestre 2 x PCR, 110 µ l de mistura universal da primeira demão de 10x, 340 µ l de água livre de RNase e 340 µ l do modelo cDNA (diluído reação da etapa 5.1.5).
    2. Adicione 10 µ l da mistura de reação para cada poço da miRNA pré-carregado matriz de PCR usando uma pipeta multicanal.
    3. Selo da placa de matriz de PCR com película adesiva ótica miRNA.
    4. Centrifugue a placa por 1 min a 1.000 x g , à temperatura ambiente para remover as bolhas.
    5. Programar o reciclador em tempo real, passo de ativação inicial de PCR durante 15 minutos a 95 ° C, 3-etapa desnaturação contendo ciclismo por 15 s a 94 ° C, recozimento por 30 s a 55 ° C e extensão por 30 s a 70 ° C para 40 número de ciclos.
      Nota: Siga fabricante ciclismo condições instruções para configurar o reciclador em tempo real. Execute a etapa de curva de dissociação construída no software do reciclador em tempo real.
    6. Realizar análise de dados.

6. análise de dados

  1. Extraia valores de Ct a partir do software PCR em tempo real para cada amostra em um software de análise.
    Nota: Valor de uma tomografia de 34 é considerado como ponto de decisão. Se as amostras contêm pico-no controle (por exemplo,, cel-mir-39), normalize os valores de Ct para o pico de controle para cada amostra. Valores de limiar podem precisar ser configurado manualmente. Valores basais são definidas automaticamente.
  2. Normalizar os valores de Ct para o Ct média de seis controles de limpeza de miRNA: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, utilizando a seguinte equação:
    ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
  3. Desistência alterar cálculos, calcular valores de ΔΔCt usando uma amostra específica como o controle, usando a expressão relativa equação12:
    miRNA de expressão relativa:
    2-∆∆Ct, onde - ∆∆Ct =-[teste ∆ - ∆ controle]
    Nota: Uma mudança de dobra de 200 é considerada como limite.
  4. Dobra de exportação alterar valores de expressão para realizar análise estatística no R usando o pacote se em Bioconductor8.
  5. Corrigi para comparações múltiplas, usando o método de Hochberg Benjamini13.
    Nota:  Uma cópia do script R está disponível em: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Conjuntos de dados e os dados analisados também estão disponíveis para a expressão do Gene Omnibus sob número GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. dados de análise: Análise funcional de Software

  1. Organize o conjunto de dados. Incluem os miRNAs com seus rácios de registro de expressão respectivos e p-valores. Consulte a tabela 1 para a formatação do conjunto de dados específico.
  2. Software de análise funcional aberto (versão 01-10).
  3. Carregar o dataset usando o seguinte formato: formato de arquivo: "formato flexível", contém o cabeçalho de coluna: "Sim", selecione o tipo de identificador: "miRBase (maduro)", plataforma de matriz usada para experiências: escolha a plataforma de matriz.
    Nota: Aceita formatos de arquivos são. txt (delimitado por tabulação arquivos de texto),. xls (excel arquivos) e diff (arquivos. cuffdiff).
  4. Selecione "Observações inferir" e verifique se que o grupo experimental de rotulagem está correto.
  5. Ir para "Resumo de Dataset" para rever o montante total dos miRNAs mapeados e não mapeados.
  6. Clique no botão "novo" na parte superior esquerda do programa. Selecione "Novo filtro de alvo do MicroRNA" e carregar um dataset microRNA.
    1. Definir a fonte: TarBase, engenho conclusões de especialistas, miRecords.
    2. Conjunto de confiança para: experimentalmente observada ou alta (previsto).
    3. Selecione "Adicionar colunas" para incluir uma variedade de informações biológicas sobre os alvos, como espécie, doenças, tecidos, percursos e muito mais.
    4. Para se concentrar em metas que mudaram a expressão no experimento, selecione "Adicionar / substituir mRNA dataset". Use o "Emparelhamento de expressão" para localizar microRNAs com os níveis de expressão iguais ou diferentes.
      Nota: A análise de filtro irá fornecer microRNA nomes e símbolos, alvos de mRNA, a fonte que descreve o relacionamento do alvo e o nível de confiança da relação prevista (Figura 2).
  7. Clique em "Adicionar ao meu caminho" para enviar o conjunto de dados filtrado para uma tela de percurso e explorar relações biológicas mais.
  8. Use caminho Designer para criar um modelo de qualidade de publicação de microRNA efeitos.
  9. Uma opção alternativa é criar um núcleo de análise.
    1. Para o tipo de análise principal, selecione "Análise de expressão".
    2. Tipo de medição, selecione "Expr Log Ratio".
    3. Resumo de filtro de análise: considerar apenas as moléculas e/ou relacionamentos onde: (espécie = rato) e (confiança = observados experimentalmente) e (fontes de dados = "Engenho especialista descobertas", "Ingenuidade ExpertAssist descobertas", "miRecords", "TarBase", ou " TargetScan humanos").
    4. Selecione um limite de p-valor = 0,05.
    5. Execute a análise.
      Nota: O relatório incluirá: caminhos canônicos, análise do montante de reguladores, doenças e funções, efeitos de regulador, redes, moléculas e muito mais.

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Resultados

Os diferentes tipos de células observados em esfregaços são usados para identificar o estágio do ciclo estral de rato (Figura 1). Estes são identificados pela morfologia celular. Durante o proestro, as células são quase exclusivamente de aglomerados de células epiteliais nucleadas redondas, bem formados (figura 1A). Quando o mouse está na fase de estro, as células são células epiteliais escamosas cornificadas, presentes nos clust...

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Discussão

MicroRNA perfis é uma técnica vantajosa para diagnóstico da doença e investigação mecanicista. Neste manuscrito, definimos um protocolo para avaliar a expressão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios nos pulmões de ratos fêmeas expostos ao ozônio nas fases do ciclo estral diferente. Métodos para a determinação do ciclo estral, tais como o método de detecção visual, têm sido descritos16. No entanto, estes dependem de medições one-time e, portanto, não são confiáveis. Para i...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada por concessões do NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Os autores Dr. Joanna Floros agradecer a assistência com experimentos de exposição de ozônio.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664semanas de idade
UltraPure WaterThermo Fisher Scientific10813012
Pipeta de plástico estérilFisher Scientific13-711-25Capacidade: 1,7 mL
Lâminas de Microscópio FoscoThermo Fisher Scientific2951TS
Microscópio de luzMicroscópio MundialMW3-H510x e 20x objetiva
Cetatesia- Injeção de cetamina HCl USPHenry Schein Animal Health5585390 mg/kg. Medicamento controlado.
Solução estéril de xilazinaLloyd Laboratories139-23610 mg / kg. Droga controlada.
EtanolFisher ScientificBP2818100Diluir para 70% de etanol com água.
Agulha de calibre 21 GBD Biosciences305165
SeringaFisher Scientific3296541 mL
Tesoura CirúrgicaWorld Precision Instruments501221, 50461314 cm, Afiada/Sem Corte, Curvada e 9 cm, Reta, Ponta Fina
PinçaWorld Precision Instruments504616
Spectrum  Pulverizadores de Tecido BessmanFisher Scientific08-418-1Capacidade: 10 a 50 mg
Tubos de Microfuga sem RNaseThermo Fisher ScientificAM124001.5 mL
Reagente TRIzolThermo Fisher Scientific15596026
Direct-zol RNA MiniPrep PlusZymo ResearchR2071
NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-W
Kit miScript II RTQiagen218161
Resposta inflamatória de camundongos e Matriz de PCR de miRNA autoimuneQiagenMIMM-105Z
Tubos de PCR de paredes finas, livres de DNase, livres de RNaseThermo Fisher ScientificAM12225para 20 μ Reações L
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610
Microsoft ExcelMicrosoft Corporationhttps://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenhttps://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R SoftwareThe R Foundationhttps://www.r-project.org/
Termociclador ou bloco de resfriamento / aquecimentoFornecedor de laboratório geral Fornecedor
de laboratóriogeral Fornecedor
Ciclador de PCR em tempo realFornecedor
Pipetador multicanalFornecedor de laboratório geral
de lavagemRNA Zymo ResearchR1003-3-4848 tampão
digestão de DNAmL Zymo ResearchE1010-1-4
Tampão de pré-lavagem de RNAZymo ResearchR1020-2-25
Analisador de ozônio ultravioletaTeledyne APIModelo T400http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Controladores de fluxo de massaSierra Instruments IncFlobox 951/954http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html
8 Kit dede laboratório geral de laboratório geral Buffer de de de 4 mL de 25 mL

Referências

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Reimpressões e permissões

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