Pulmão microRNA Profiling através do ciclo estral em camundongos expostos de ozônio

Resumo

Aqui nós descrevemos um método para avaliar a expressão de pulmão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios usar ratos expostos ao ozônio ou ar filtrado em diferentes fases do ciclo estral.

Resumo

Criação de perfil de MicroRNA (miRNA) tornou-se de interesse para os investigadores que trabalham em diversas áreas de pesquisa da biologia e da medicina. Atuais estudos mostram um promissor futuro de usar miRNAs no diagnóstico e cuidados de doenças pulmonares. Aqui, definimos um protocolo para miRNA perfis para medir a abundância relativa de um grupo de miRNAs previstos para regular os genes inflamatórios no tecido do pulmão de um modelo de mouse de inflamação das vias aéreas induzida por ozônio. Porque tem sido demonstrado que os níveis de hormônio sexual circulante podem afetar a regulação da imunidade inata de pulmão em mulheres, a finalidade desse método é descrever um inflamatório miRNA perfilação protocolo em ratos fêmeas, levando em consideração o ciclo estral estágio de cada animal no momento da exposição do ozônio. Abordamos também abordagens aplicáveis bioinformática com miRNA uma métodos de identificação de descoberta e de destino usando- se, um software R/Bioconductor, e software de análise funcional de entender o contexto biológico e caminhos associados expressão diferencial de miRNA.

Introdução

microRNAs (miRNAs) são curtos (19-25 nucleotides), ocorrem naturalmente, não-codificantes moléculas de RNA. Sequências de miRNAs são evolutivas conservada entre espécies, sugerindo a importância de miRNAs na regulação de funções fisiológicas¹. microRNA expression profiling tem provado para ser útil para identificar os miRNAs que são importantes na regulação de uma variedade de processos, incluindo a resposta imune, diferenciação celular, processos de desenvolvimento e apoptose². Mais recentemente, os miRNAs foram reconhecidos por seu potencial uso no diagnóstico da doença e terapêutica. Para pesquisadores estudando os me....

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Penn State University.

1. avaliação do estágio do ciclo estral

1. Corretamente, conter uma fêmea C57BL/6 mouse (8 – 9 semanas de idade) usando a técnica de contenção de rato com uma mão descrita em Machholz et al¹⁰.
2. Encha a pipeta plástica estéril com 10 μL de água ultra pura.
3. Introduza a ponta da pipeta plástica na vagina.
4. Lave suavemente o líquido 4 a 5 vezes para coletar a amostra.
5. Coloque o resplendor final contendo fluido vaginal em uma lâmina de ....

Resultados

Os diferentes tipos de células observados em esfregaços são usados para identificar o estágio do ciclo estral de rato (Figura 1). Estes são identificados pela morfologia celular. Durante o proestro, as células são quase exclusivamente de aglomerados de células epiteliais nucleadas redondas, bem formados (figura 1A). Quando o mouse está na fase de estro, as células são células epiteliais escamosas cornificadas, presentes nos clust.......

Discussão

MicroRNA perfis é uma técnica vantajosa para diagnóstico da doença e investigação mecanicista. Neste manuscrito, definimos um protocolo para avaliar a expressão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios nos pulmões de ratos fêmeas expostos ao ozônio nas fases do ciclo estral diferente. Métodos para a determinação do ciclo estral, tais como o método de detecção visual, têm sido descritos¹⁶. No entanto, estes dependem de medições one-time e, portanto, não são confiáveis. Para i.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	semanas de idade
UltraPure Water	Thermo Fisher Scientific	10813012
Pipeta de plástico estéril	Fisher Scientific	13-711-25	Capacidade: 1,7 mL
Lâminas de Microscópio Fosco	Thermo Fisher Scientific	2951TS
Microscópio de luz	Microscópio Mundial	MW3-H5	10x e 20x objetiva
Cetatesia- Injeção de cetamina HCl USP	Henry Schein Animal Health	55853	90 mg/kg. Medicamento controlado.
Solução estéril de xilazina	Lloyd Laboratories	139-236	10 mg / kg. Droga controlada.
Etanol	Fisher Scientific	BP2818100	Diluir para 70% de etanol com água.
Agulha de calibre 21 G	BD Biosciences	305165
Seringa	Fisher Scientific	329654	1 mL
Tesoura Cirúrgica	World Precision Instruments	501221, 504613	14 cm, Afiada/Sem Corte, Curvada e 9 cm, Reta, Ponta Fina
Pinça	World Precision Instruments	504616
Spectrum  Pulverizadores de Tecido Bessman	Fisher Scientific	08-418-1	Capacidade: 10 a 50 mg
Tubos de Microfuga sem RNase	Thermo Fisher Scientific	AM12400	1.5 mL
Reagente TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus	Zymo Research	R2071
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
Kit miScript II RT	Qiagen	218161
Resposta inflamatória de camundongos e Matriz de PCR de miRNA autoimune	Qiagen	MIMM-105Z
Tubos de PCR de paredes finas, livres de DNase, livres de RNase	Thermo Fisher Scientific	AM12225	para 20 μ Reações L
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control	Qiagen	219610
Microsoft Excel	Microsoft Corporation		https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen		https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software	The R Foundation		https://www.r-project.org/
Termociclador ou bloco de resfriamento / aquecimento	Fornecedor de laboratório geral Fornecedor
de laboratório	geral Fornecedor
Ciclador de PCR em tempo real	Fornecedor
Pipetador multicanal	Fornecedor de laboratório geral
de lavagem	RNA Zymo Research	R1003-3-48	48 tampão
digestão de DNA	mL Zymo Research	E1010-1-4
Tampão de pré-lavagem de RNA	Zymo Research	R1020-2-25
Analisador de ozônio ultravioleta	Teledyne API	Modelo T400	http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Controladores de fluxo de massa	Sierra Instruments Inc	Flobox 951/954	http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

8 Kit dede laboratório geral de laboratório geral Buffer de de de 4 mL de 25 mL