Avaliação da interação entre o complemento protéico-de-n-n e ácido hialurônico na promoção da adesão celular

Resumo

O componente complementar de-de-de-a é uma molécula pró-inflamatória altamente expressa no microambiente tecidual que pode interagir com a matriz extracelular. Aqui, nós descrevemos um método para testar como o-de-de-ácido hialurônico afeta a adesão celular.

Resumo

Tem sido demonstrado cada vez mais que o microambiente tumoral desempenha um papel ativo no crescimento e metástase da neoplasia. Através de diferentes vias, as células tumorais podem eficientemente recrutar células estromal, imunológicas e endoteliais secretando fatores estimulatórios, quimiocinas e citocinas. Por sua vez, essas células podem alterar as propriedades de sinalização do microambiente, liberando sinais de promoção de crescimento, metabólitos e componentes da matriz extracelular para sustentar alta proliferação e competência metastática. Neste contexto, identifica-se que o componente complementar-de-n, altamente expresso localmente por uma gama de tumores malignos humanos, ao interagir com o ácido hialurônico da matriz extracelular, afeta fortemente o comportamento das células primárias isoladas do tumor humano Espécimes. Aqui, nós descrevemos um método para testar como o-de-de-aço para o ácido hialurônico (HA) impacta a adesão de células tumorais, subjacente ao fato de que as propriedades biológicas dos principais componentes da matriz extracelular (neste caso HA) podem ser moldadas por sinais bioativos em direção ao tumor Progressão.

Introdução

O microambiente do tumor (TME) influencia o desenvolvimento e a progressão do cancro desde que pode fornecer um Niche permissiva para a sobrevivência, o crescimento e a invasão da pilha. A identificação de novos atores-chave na TME pode ser útil para a descoberta de novas ferramentas moleculares para a terapia alvo. A TME inclui uma rede complexa e dinâmica de células não malignas, como células endoteliais, fibroblastos e células do sistema imunológico, encaixadas nos componentes da matriz extracelular circundante (ECM), incluindo colágenos, lamininas, fibronectinas, proteoglicanos e hyaluronans. Ambas as células tumorais e não-tumorais sintetizam e secretam componentes de ECM em conjunto com citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e enzimas de remodelação inflamatória e matricial que alteram globalmente as propriedades físicas, químicas e de sinalização da TME. Entre esses constituintes, o ácido hialurônico (HA) surgiu para exercer um papel crucial na biologia tumoral. Apesar de sua simples composição química, a HA, juntamente com suas moléculas de ligação à HA (hialaderinas), pode modular a angiogênese, a responsividade do sistema imunológico e a remodelação do ECM de forma dependente de tamanho e concentração¹.

O sistema complementar (C) também faz parte do TME local, que recentemente recebeu uma atenção crescente. O sistema C engloba um conjunto de proteínas solúveis e ligadas à membrana envolvidas na primeira linha de defesa contra não-células-auto, elementos hospedeiros indesejados e patógenos. Funcionalmente, o C vincula os braços de dois efetores de sistemas inatos e adaptativos para promover a matança direta de células ou a montagem de uma resposta inflamatória². A ativação de C pode suprimir o crescimento do tumor, destruindo as células cancerosas ou inibindo seu crescimento, mas tornou-se cada vez mais claro que ele pode possuir uma atividade que promove o tumor, sustentando a inflamação crônica, promovendo o estabelecimento de um meio imunossupressor, induzindo a angiogênese e ativando as vias de sinalização relacionadas ao câncer³. Neste contexto, foi a primeira molécula de reconhecimento da via clássica do sistema C que tem emergido para exercer funções importantes no microambiente tumoral, independentemente da ativação do C⁴. Foi demonstrado que a r. 5 foi expressa localmente por uma série de tumores malignos humanos, onde pode favorecer a adesão, a migração e a proliferação de células cancerosas, além da angiogênese e metástase^cinco. Curiosamente, a-n interage com um dos principais constituintes do ECM, como HA.

Nós desenvolvemos uma técnica para isolar as pilhas de cancro preliminares da massa de tumor. Além disso, nós criamos a matriz, que pode estimular o microambiente do tumor, particular a interação entre o de-o e o ácido hialurónico do peso molecular elevado. A capacidade para a HA foi capaz de induzir a adesão das células tumorais.

Protocolo

Amostras de tecido de pacientes foram coletadas após consentimento informado após aprovação das considerações éticas pelo Conselho institucional do hospital universitário de Trieste, Itália.

1. isolamento e cultura de células tumorais (dia 1)

1. Isole pilhas humanas do mesotelioma dos espécimes contínuos do MPM. Picar finamente o tecido com um cortador para obter fragmentos de cerca de 2-3 mm² em tamanho e incubar em 5 ml de solução de digestão composta de Hanks ' Balanced Salt Solution (HBSS) suplementado com 0,5 mm CA^{2 +}/mg^{2 +}, 0,5% tripsina e 50 μg/ml DNase I, durante a noite a 4 ° c.
2. Isolamento e cultura de células tumorais (dia 2)
   1. Após a incubação durante a noite, coloque o tecido digerido por 30 min em uma incubadora de 37 ° c com agitação suave.
   2. Substitua a solução de digestão após a centrifugação (250 x g) com 3 mg/ml de colagenase tipo 1 dissolvida em 5 ml de média 199 com HBSS e incubar mais por 30 min a 37 ° c com agitação suave.
   3. Bloqueie a reação enzimática adicionando 10% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS). Resuspend as pilhas muito com cuidado com um Pipet de 5 mL para assegurar-se de que a maioria das pilhas estejam liberadas do tecido. Em seguida, filtre a suspensão da célula através de um filtro de poros de 100 μm.
   4. Sementes as células em um 12,5 cm² balão e cultura-los a 37 ° c com células endoteliais humanas médio livre de soro (hesf), com 10% FBS e suplementado com EGF (10 ng/ml), FGF básico (20 ng/ml), e 1% penicilina-estreptomicina.
      Nota: substitua por meio fresco a cada 2-3 dias.

2. revestimento de HA (dia 1)

1. Ressuscito de alto peso molecular HA (1,5 kDa) em água destilada dupla na concentração de 1 mg/mL⁶.
2. Diluir a solução de estoque de HA para 50 μg/mL em tampão carbonato/bicarbonato (0,1 M, pH 9,6) com pipetagem suave.
3. Cubra a placa 96-well com 100 μL de solução de estoque de HA diluir por poço durante a noite a 4 ° c.
   Nota: o ácido hialurónico era um presente amável do professor Ivan Donati, departamento de Ciências da vida, Universidade de Trieste⁷.

3. de revestimento (dia 2)

1. Após a incubação durante a noite, aspirar os poços tratados e lavar a placa 96-well com 100 μL de PBS de Dulbecco (dPBS) por poço.
2. Permitir (25 μg/mL ou concentrações diferentes para experimentos de resposta à dose) ou BSA (como um controle negativo) para ligar ao plástico imobilizados-HA incubando essas proteínas em uma concentração de 25 μg/mL em 100 μL de dPBS + 0,5% BSA e 0,7 mM CA^{2 +}/mg^{2 +} . Em seguida, incubar durante a noite a 4 ° c.
3. Aspirar os poços e lavar a placa 96-well com 100 μL/poço de dPBS.

4. rotulagem celular com FAST DiI

1. Resuspend 1 x 10⁵ células tumorais em 500 ΜL de dpbs contendo 10 μg/ml de corante fluorescente Fast DII. Incubar por 15 min a 37 ° c em uma incubadora de 5% v/v CO₂ para a rotulagem, misturando manualmente após intervalos de 5 minutos.
   1. Para remover o excesso FAST DiI, adicionar 10 mL de dPBS, pipeta suavemente para cima e para baixo, e centrifugar a 250 x g por 7 min. ressuscite o pellet celular em 1 ml de soro endotelial humano livre médio contendo 0,1% BSA (hesf + 0,1% BSA).

5. adesão de células em matrizes HA/1 (1º dia)

1. Aspirar os Poços revestidos com as diferentes matrizes (os poços foram revestidos na etapa 3,2).
2. Distribuir 100 μL da suspensão da célula rotulada para os Poços revestidos e incubar a placa por 35 min a 37 ° c em 5% v/v CO₂ incubadora.
3. Retire as células não aderentes aspirando o sobrenadante. Lave uma vez com dPBS contendo 0,5% BSA, 0,7 mM CA^{2 +} e 0,7 mm mg^{2 +}_.
4. Lyse as células aderentes, adicionando 200 μL/poço de 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS e imediatamente ler a placa 96-bem com um leitor de fluorescência (544 nm, emissão 590 nm) usando uma curva de calibração gerada através da lise de um número crescente de rotulados Células.

Resultados

HA é um polissacárido de alto peso molecular carregado negativamente, que é composto de repetição (β,1-4)-D-glucurônico ácido-(β,1-3)-N-acetil-D-glucosamina dissacarínico unidades (Figura 1b)⁷. A ocorrência da ligação de HA na placa 96-well, bem como a eficiência de sua imobilização foram testadas aproveitando-se de HA biotinylated (bio-HA). Diferentes concentrações de bio-HA, variando de 10 μg/mL a 1 mg/mL, foram resuspensas em 100 mM...

Discussão

Nós descrevemos um método fácil para investigar como o componente do complemento, que interage com o ácido hialurônico, é capaz de modular o comportamento de células primárias isoladas de tecidos tumorais humanos. Tanto o HA quanto o n. º n estão presentes no microambiente tecidual em condições fisiológicas e patológicas, participando de diversos processos biológicos celulares. Por exemplo, foi demonstrado que o n. º-8 está presente no microambiente da placenta, onde favorece a invasão de trofoblastos trophoblast da decí...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100  µ Filtro de poros BD	Falcon	352360
Solução de Anfotericina B (fungizona)	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Ciências Imunológicas Básicas FGF		GRF-15595
Cloreto de Cálcio	Sigma-Aldrich	C-4901
Colagenase tipo I	Worthington Biochemical Corporation, DBA	MX1D12644
D-Glucose	Sigma-Aldrich	50-99-7
DNase I	Roche	10 104 159 001
EDTA	Sigma-Aldrich	60-00-4
EGF	Ciências Imunológicas	GRF-10544
Sondas moleculares FAST DiI	, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	D7756
Soro fetal bovino	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	10270-106
Fibronectina	Roche	11051407001
Frasco para cultura de células	Corning	430639	estéril e ventilada
de gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397-10ML
Hank ' s Solução salina balanceada (HBBS)	Sigma-Aldrich	H6648	Suplementado com EDTA, Glicose, penicilina-estreptamicina, gentamicina e fungizona
Ácido hialurônico de alto peso molecular	Gentil presente do Prof. Ivan Donati
Soro endotelial humano meio livre	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	11111-044	Suplementado com EGF (5  ng/mL), FGF básico (10  ng/mL) e  1% de penicilina– estreptomicina (Sigma-Aldrich)
Cloreto de magnésio	Carlo Erba	13446-18-9
Médio 199 com Hank' s sal	Sigma-Aldrich	M7653
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P0781
Microscopia de lapso de tempo	Nikon	Sistema de Imagem BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader	Flow Labs
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4674