Identificação de codificação e Classes de RNA não-codificante expressa em suínos, sangue total

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para o processamento de codificação (mRNA) e não-codificantes (ncRNA) globina reduzido RNA-seq bibliotecas de uma amostra da unidade de sangue total.

Abstract

O advento da inovadora e cada vez mais poderosas técnicas de sequenciamento próxima geração abriu novos caminhos para a capacidade de examinar a expressão de gene subjacente relacionada a processos biológicos de interesse. Essas inovações não só permitem que os pesquisadores a observar a expressão das sequências de mRNA que codificam genes essa função celular do efeito, mas também as moléculas de RNA (ncRNA) não-codificantes que permanecem untranslated, mas ainda têm funções reguladoras. Embora os pesquisadores têm a capacidade de observar a expressão tanto do mRNA e ncRNA, tem sido habitual para um estudo para se concentrar em um ou outro. No entanto, quando estudos estão interessados na expressão tanto do mRNA e ncRNA, muitas vezes eles usam amostras separadas para examinar ou codificação ou não-codificantes RNAs devido à diferença de preparações de biblioteca. Isso pode levar à necessidade de mais amostras que pode aumentar o tempo, consumíveis e estresse animal. Além disso, pode causar pesquisadores decidir para preparar amostras para análise de apenas um, geralmente o mRNA, limitando o número de questões biológicas que podem ser investigados. No entanto, ncRNAs abrangem várias classes com funções reguladoras aquela expressão de RNAm de efeito. Porque ncRNA são importantes para processos biológicos fundamentais e desordem destes processos em durante a infecção, eles podem, portanto, possam ser alvos para terapêutica. Este manuscrito demonstra um protocolo modificado para a geração do mRNA e não-codificantes do RNA expressão bibliotecas, incluindo o RNA viral, de uma única amostra de sangue total. Otimização do presente protocolo, melhorou a pureza do RNA, aumentou a ligadura para recuperação de RNAs metilados e omitido a seleção de tamanho, para permitir a captura de mais espécies de RNA.

Introduction

Sequenciamento de próxima geração (NGS) emergiu como uma poderosa ferramenta para a investigação das alterações que ocorrem no nível genômico de organismos biológicos. Preparação da amostra para métodos NGS pode variar dependendo do organismo, tipo de tecido, e mais importante as perguntas os pesquisadores fazem questão de endereço. Muitos estudos se voltaram para NGS como um meio de estudar as diferenças na expressão do gene entre Estados como indivíduos sãos e doentes,^1,2,3,4. O sequenciamento tomar lugar numa base de genoma inteiro e perm....

Protocol

Protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado do Animal centro de doença Animal nacional (USDA-ARS-NADC).

1. coleta de sangue de porco amostras

1. Colete amostras de sangue em tubos de RNA. Colete ~2.5 mL ou mais, se a maior coleção de tubos está disponíveis.

2. processamento de sangue de porco amostras

1. Centrifuga os tubos de sangue em 5.020 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (15-25 ° C). Se amostras congelada de processamento incubam o tubo em temperatura ambiente por um mínimo de 2 h antes da centrifugação.
2. Remover o sobr....

Results

Em nosso estudo, as amostras representativas são a globina e amostras de sangue de todo ribo-esgotada. O resultado representativo do protocolo consiste em uma amostra de biblioteca empobrecido de globina com um número de integridade do RNA (RIN) acima de proporções de concentração de nm 260/280 igual ou superior a 2 (Figura 1b e 1C) e 7 (Figura 1um). Validação dos resultados da amostra foi realiz.......

Discussion

O primeiro passo crítico no protocolo que foi otimizado incluiu as etapas de depleção de globina adicionado, que tornou possível obter leituras de qualidade de amostras de sangue total. Uma das maiores limitações sobre o uso de sangue total em estudos de sequenciamento são o elevado número de leituras na amostra que irão mapear para moléculas de globina e reduzir as leituras que poderiam mapear para outras moléculas de interesse¹⁸. Portanto, na otimização do protocolo para o nosso tipo de amostra,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos PAXgene	PreAnalytix	762165
Água de Grau de Biologia Molecular	ThermoFisher	10977-015
Kit de Isolamento de miRNA mirVana	ThermoFisher	AM1560
Rneasy Kit de Limpeza MinElute	QIAGEN	74204
100% Etanol	Decon Labs, Inc.	2716
Tubos de parede fina de 0,2 mL	ThermoFisher	98010540
1,5 mL RNase/DNase - tubos livres	Qualquer fornecedor
Veriti Termociclador de 96 poços	ThermoFisher	4375786R
Oligo de Redução de Globina (α 1)	Qualquer fornecedor		Sequência GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Oligo de Redução de Globina (α 2)	Qualquer fornecedor		Sequência TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Oligo de Redução de Globina (β 1)	Qualquer fornecedor		Sequência AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Oligo de Redução de Globina (β 2)	Qualquer fornecedor		Sequência GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hibridização
, pH 7.6	Fisher Scientific	BP1757-100-KCl
	Millipore Sigma	60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6	Fisher Scientific	BP1757-100
-DTT	ThermoFisher	Y00147
-MgCl2	Promega	A351B
- Água de Grau de Biologia Molecular	ThermoFisher	10977-015
RNase H	ThermoFisher	AM2292
SUPERase-IN	ThermoFisher	AM2694	Inibidor de Rnase
EDTA	Millipore Sigma	E7889
Microcentrífuga	Qualquer fornecedor
Instrumento BioAnalyzer de Eletroforese 2100	Agilent Technologies	G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
Agilent DNA de Alta Sensibilidade  Kit	Agilent Technologies	5067-4626
TruSeq Kit de Preparação Total de RNA Encalhado com Ribo-Zero	Kit de	Illumina RS-122-2201	; Conjunto Humano/Mouse/Rato A  (48 amostras, 12 índices)
Guia de preparação de amostra de RNA total trançado TruSeq	Illumina		disponível on-line
RNAClean XP Beads	BeckmanCoulter	A63987
AMPure XP Beads	BeckmanCoulter	A63880
MicroAmp Tira óptica de 8 tubos	ThermoFisher	N8010580	tubos de parede fina de 0,2 ml MicroAmp
Tampa de tira óptica de 8 tubos	ThermoFisher	N801-0535
RNase/DNase - reservatórios de reagentes livres	Qualquer fornecedor
SuperScript II Transcriptase reversa	ThermoFisher	18064-014
MicroAmp Placas ópticas de 96 poços	ThermoFisher	N8010560	Foram usadas no lugar de placas de 3mL conforme necessário
Filme adesivo óptico MicroAmp	ThermoFisher	4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set para Illumina® (Conjunto 1)	Kit de RNA pequeno New England Biolabs	E73005
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set para Illumina® (Conjunto 2)	de RNA pequeno New	England Biolabs	E75805
QIAQuick Kit de purificação de PCR	QIAGEN	28104
96S Super Magnet Plate	ALPAQUA	A001322