Artigo de método

Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

DOI:

10.3791/58690

⸱

26 de outubro de 2018

 , 
1Cold Spring Harbor Laboratory

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve o manual de procedimento para isolar o único neurônios fluorescente etiquetados seguidos em vitro baseada na transcrição de amplificação do mRNA para a sequenciação do ARN de alta profundidade única célula de triagem.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A sequenciação do ARN unicelulares (RNA-seq) agora é uma ferramenta amplamente implementada para análise de expressão gênica. Plataformas de sequenciação do ARN monocelulares comercialmente disponíveis processam tudo entradas células indiscriminadamente. Às vezes, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é usada contra a corrente para isolar uma população especificamente rotulada de interesse. Uma limitação de FACS é a necessidade de números elevados de células entradas com frações significativamente rotuladas, que é impraticável para coleta e criação de perfil de populações raras ou escassamente rotulada neurônio do cérebro do rato. Aqui, descrevemos um método para manualmente coletando esparsas fluorescente etiquetado único neurônios de recém dissociado tecido de cérebro de rato. Este processo permite a captura de neurônios com rótulo único com pureza elevada e subsequente integração com um em vitro protocolo de amplificação baseada na transcrição que preserva os rácios de transcrição endógena. Nós descrevemos um método de amplificação linear duplo que usa identificadores da molécula original (UMIs) para gerar contagens individuais do mRNA. Duas rodadas de resultados de amplificação em um alto grau de deteção de gene por uma única célula.

Introdução

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A sequenciação do ARN unicelulares (RNA-seq) transformou-se estudos de transcriptomic. Enquanto em grande escala RNAseq de célula única pode ser executada usando uma variedade de técnicas, como as gotas1,2, Microfluido3, nanogrids4e micropoços5, a maioria dos métodos não pode classificar tipos de células definidas que expressam fluorophores geneticamente codificado. Para isolar uma população selecione a célula, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é frequentemente usada para classificar as pilhas etiquetadas em um modo de célula única. No entanto, FACS tem algumas restrições e requer etapas de processamento de amostra meticuloso. Em primeiro lugar, um grande número de células de entrada é normalmente necessários (muitas vezes vários milhões de células / mL), com uma fração significativa (> 15 – 20%) contendo a população rotulada. Em segundo lugar, preparações da pilha podem exigir várias rodadas de etapas de centrifugação gradiente de densidade para remover fração glia, detritos e aglomerados de células que caso contrário podem obstruir o bocal ou fluxo de célula. Em terceiro lugar, FACS geralmente emprega a coloração e descoloração passos para viver/morrer coloração (por exemplo, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), iodeto de propidium (PI) e corantes Cytotracker), que ocupam tempo adicional. Em quarto lugar, como uma regra de ouro para duas cores classificação (como DAPI e proteína fluorescente verde/vermelho (GFP/RFP)), geralmente duas amostras e um controle são necessários, exigindo uma amostra sem rótulo para ser processado além da estirpe do mouse desejado. Em quinto lugar, a filtragem é frequentemente realizada várias vezes antes e durante a amostra classificação para proativamente evitar linhas de exemplo obstruído em uma máquina de FACS. Em sexto lugar, o tempo deve ser atribuído em configurações de FACS mais comumente usadas para inicializar e estabilizar o fluxo de fluido e realizar a calibração da gota. Sétimo, controle de amostras geralmente são executadas em sequência antes da colheita de amostra real para criar matrizes de compensação, rejeição de gibão, definindo portões, etc. os usuários também executar as etapas 6 e 7 se antes do tempo ou exigir o assistência de um técnico em paralelo. Finalmente, post-FACS, muitas vezes há medidas para assegurar que somente rotulado única células estão presentes em cada poço; por exemplo, verificando as amostras em uma configuração de alto teor de triagem como um gerador de imagens de prato rápido.

Para contornar as etapas descritas acima e facilitar um relativamente rápida, alvo de sequenciamento de uma pequena população de neurônios fluorescente etiquetadas único, descrevemos um manual de classificação procedimento seguido por duas rodadas de um altamente sensíveis em vitro Protocolo de amplificação, chamado dobro da transcrição in vitro com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq). A geração de biblioteca de amplificação e do cDNA de RNA é adaptada de Eberwine et al . 6 e Hashimshony et al . 7, com certas modificações para atender interneurônios rato que têm volumes menores de celulares; Além disso, encontramos também é igualmente útil para excitatórios neurônios piramidais.

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Protocolo

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Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo IACUC em Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. manual de classificação de neurônios de rato fluorescente etiquetadas

  1. Puxe microcapilares de vidro (veja a Tabela de materiais) para 10-15 µm de diâmetro de saída usando um extrator capilar com as seguintes configurações: calor: 508, puxe: em branco, vel: em branco, tempo: em branco.
  2. Anexe tubos de silicone flexível de 120-150 cm (~0.8 mm diâmetro interno) para um 0,2 µm polivinilideno difluoreto (PVDF) seringa filtro de membrana e uma válvula de tubo bidirecional usando conectores de tubos apropriados.
  3. Preparar 500 mL de gelado (4 ° C) artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF, tabela 1) e oxigenar pelo oxigênio subida de 5% de dióxido de carbono equilibrado através de uma pedra porosa por 15 min ou até que a solução limpa completamente.
  4. Prepare 100 mL de ACSF com um coquetel de bloqueadores de atividade em um copo de 150 mL (tabela 1).
  5. Prepare 100 mL de ACSF com 1 mg/mL Streptococcus protease de IV de fração em um copo de 150 mL (tabela 1).
  6. Preparar 100 mL de ACSF com solução a 1% de soro fetal bovino (FBS) em um copo de 150 mL e oxigenar com 5% de dióxido de carbono equilibrado oxigênio através de uma pedra porosa.
  7. Disseca o cérebro de um rato euthanized abrindo o crânio com uma pequena tesoura e extraindo o cérebro fresco usando pinça fina, sem danificar o córtex.
    Nota: Os ratos de qualquer estirpe, idade e sexo podem ser usados como desejado. Não congelar o cérebro ou executar classificação manual em ratos injetados com vírus ou outros agentes infecciosos/perigosos.
  8. Manter o cérebro em ACSF refrigerado e oxigenado, deixando uma pedra porosa anexada ao oxigênio de equilíbrio de 5% de dióxido de carbono durante toda a duração do seccionamento.
  9. Posicione o cérebro sobre o chuck vibratome e seções coronais ou sagitais em 300 µm de espessura de corte. Coletar tantas seções conforme necessário para obter um mínimo de ~ 10-50 rotulado células até várias centenas de células. Coloque as fatias em um suporte de fatia de malha de algodão, colocado dentro de um copo, então eles são banhados em ACSF oxigenado.
  10. Mova as fatias frescas em um béquer contendo ACSF com bloqueadores de atividade e bloco de 15 – 20 min à temperatura ambiente. Manter o oxigênio subido usando pedra porosa.
  11. Mover as fatias para um béquer contendo ACSF com a solução de protease para executar digestão leve à temperatura ambiente: 20 a 30 min para animais P4-14 ou até 45 – 60 min para animais P28-56. Manter a subida do oxigênio.
  12. Lave ACSF com protease movendo fatias de volta para o béquer contendo ACSF com solução de bloqueadores de atividade por 5 a 10 min à temperatura ambiente. Manter a subida do oxigênio.
  13. Mover seções individuais para um prato de Petri de 100mm contendo ACSF com 1% FBS à temperatura ambiente. Sob um escopo de dissecação fluorescente, microdissect áreas e camadas de interesse ter um mínimo de 10 a 50 células (até alguns cem). Execute o microdissection com um par de pinças bem ou anexando-se agulhas de injeção 22 – 28 G sobre suportes de madeira (espetos).
  14. Com uma pipeta Pasteur, mover as peças de microdissected para um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo ~0.8 mL de 1% FBS em solução ACSF.
  15. Triture o tecido dissecado no tubo de microcentrífuga à temperatura ambiente. Fazer três pipetas Pasteur haste longa com diminuindo diâmetros de saída por rolando-os sobre uma flama aberta. Executar traçados de ~ 10 com cada pipeta, começando com o maior e terminando com a menor.
  16. Dispense as células dissociadas em um prato de Petri de 100mm contendo ACSF oxigenado (placa de Petri pode ser fina revestida com 5 mm de 1% de ágar ou claro silicone composto às 01:10 proporção, se desejado). Manter à temperatura ambiente.
  17. Espere ~ 5-7 min para as células gradualmente resolver, em seguida, observar o sinal GFP/RFP sob um microscópio de dissecação.
    Nota: Células únicas, detritos e pequenos grupos será visíveis no campo claro (BF).
  18. Escolher 10 – 15 células GFP/RFP de cada vez usando uma pipeta capilar (da etapa 1.1), ligada ao tubo de silicone flexível (0.4-0.8 mm de diâmetro interno) e dispense as células em um prato de Petri de 100mm contendo fresco ACSF oxigenado.
  19. Obstruindo a extremidade da válvula da tubulação com a língua, posição do capilar próximo à célula de interesse. Capture células usando a ação capilar após aliviar o bloco e rapidamente bloquear novamente para impedir o excesso de líquido entre a pipeta. Dispense as células em um 100 mm placa de Petri com ACSF oxigenado fresco soprando suavemente, enquanto observa a ponta capilar sob ótica de fluorescência do microscópio dissecação. Objetivo de coletar ~ 100 – 150 células totais.
  20. Repita a etapa 1.19 uma ou duas vezes mais (dependendo de detritos) e a transferência de um total de ~ 50-75 células para um novo prato de Petri de 100mm, certificando-se de que contaminantes, tais como os restos são mínimos em óptica de contraste (DIC) do brilhante-campo de interferência diferencial.
  21. Finalmente, usando uma pipeta conta fresco cada vez, escolher uma única célula em não mais do que o volume de 0,5 µ l e expulsá-la em um tubo de microcentrífuga único 0,2 mL (ou uma tira de oito tubos de microcentrífuga de 0,2 mL) contendo 1 µ l de tampão de amostra coleção com primers N10B1-N10B96 (tabela 2). Quebre a ponta da pipeta no tubo de microcentrífuga para garantir que a célula permanece no buffer de coleção. Descarte as pipetas.
  22. Congele as células, colocando os tubos em gelo seco e armazená-los a longo prazo em um freezer-80 ° C até que estejam prontos para serem processados para a amplificação do RNA.

2. primeira rodada de RNA amplificação

Nota: O procedimento a seguir é para a única faixa de oito tubos de microcentrífuga de 0,2 mL. Escala as reações conforme necessário.

  1. Sintetizar a primeira vertente do cDNA (primeira rodada).
    1. Tiras de calor da etapa 1,22 em 70 ˚ c por 5 min, seguido de 4 ˚ c por 5 min; Repita duas vezes.
    2. Reúnam-se no gelo transcriptase reversa (RT) síntese de mistura/primeiro-costa mestre mestre mistura usando os seguintes ingredientes (ver Tabela de materiais): 10 x primeiro-costa amortecedor (2 µ l), dNTP mix (4 µ l), inibidor de RNase (1 µ l) e enzima (1 µ l).
    3. Brevemente, centrifugar a tira em um centrifugador do tabletop para recolher tudo no fundo. Manter-se no gelo.
    4. Adicionar 1 µ l de mistura de mestre mestre síntese de mistura/primeiro-costa RT para os tubos acima (total de volume de 1 µ l de tampão de amostra da coleção de celular + 1 µ l de RT = 2 µ l/tubo). Misture bem por pipetagem. Brevemente, gire para coletar todo o conteúdo na parte inferior e mantê-lo no gelo.
    5. Incube o tubo/s acima a 42 ° C por 2 h em um forno de ar. Colocar os tubos no gelo imediatamente para terminar a reação e prossiga para a etapa de síntese segundo-costa.
  2. Sintetizar a segunda vertente do cDNA (primeira rodada).
    1. Fazer a segunda vertente mestre mix (80 µ l) no gelo na seguinte ordem em um tubo de 1,5 mL: água livre de nuclease (63 µ l), 10 x segundo buffer de vertente (10 µ l), dNTP mix (4 µ l), DNA polimerase (2 µ l) e RNaseH (1 µ l). Misture os ingredientes bem pela utilização do vortex, então girar para coletar no fundo e mantenha no gelo.
    2. Começar o termociclador, execute o programa a seguir para pre-fixe a unidade, estar pronto para começar a etapa 2.2.3 (tampa de calor = desligado; 16 ° C por 2 h, espera de 4 ° C) e pausar a 16 ° C.
    3. Adicione um 80 µ l/tira (ou 10 µ l/tubo) de mistura mestre da segunda vertente para cada tubo da tira e manter no gelo. Transferir a tira para o termociclador e retomar o passo de 16 ° C iniciado acima. Incubar a tira para 2 h a 16 ° C.
    4. Após a etapa de síntese segundo-costa, coloque os tubos no gelo para prosseguir para a próxima etapa de purificação do cDNA.
  3. Purificar o cDNA encalhado dobro (primeira rodada).
    Nota: Todas as centrifugações são executadas no ~ 8.000 x g, à temperatura ambiente. Nunca exceda a 16.000 x g, para evitar danos ao cartucho do filtro.
    1. Inicie aquecimento 100 µ l de água livre de nuclease para 50-55 ° C para uso posterior em um bloco de aquecimento seco. Nunca exceda a 58 ° C para evitar a desnaturação parcial do cDNA.
    2. Adicione 250 µ l de tampão de ligação do cDNA de um tubo de 1,5 mL. Verifique precipitados no buffer e, em seguida, aquecer a solução-tampão para 37 ° C por 10 min para re-dissolver precipitados.
    3. Transferi os cDNAs de uma única faixa de 8-tubo para o buffer de ligação do cDNA. Combine as células nesta etapa mais a jusante processos (8 células em 1 tubo). Mix completamente por pipetagem 2 - 3 vezes e passar rapidamente 3 - 4 vezes. Rotação para coletar o conteúdo na parte inferior.
    4. Coloque o cartucho de filtro de cDNA para lavagem de tubos (a partir de um kit da transcrição (IVT) em vitro ) firmemente. Adicione a mistura acima para o centro do filtro. Centrifugar a 8.000 x g por ~ 1 min ou até que seja através do filtro. Descartar o escoamento e substituir o tubo de lavagem.
    5. Adicione 500 µ l de tampão de lavagem do kit IVT à coluna.
      Nota: Certifique-se de que o etanol foi adicionado para o tampão de lavagem anteriormente.
    6. Centrifugar a 8.000 x g por ~ 1 min ou até que seja através do filtro. Descarte o escoamento e centrifugar novamente a 8.000 x g, por ~ 1 min esvaziar o cartucho.
    7. Transfira o filtro de cDNA para um tubo de eluição de cDNA (tubo de 1,5 mL nuclease-livre). Aplique 8,5 µ l de água livre de nuclease previamente aquecida no centro do filtro. Aguarde 2 min e centrifugar a 8.000 x g por ~1.5 min.
    8. Eluir novamente com 8,5 µ l de água livre de nuclease pré-aquecido e dirijam-se para a primeira rodada IVT.
      Nota: O volume de recuperação de cDNA Double-stranded será ~ 16 µ l.
  4. Realizar uma reação de transcrição (IVT) em vitro para produção de RNA (aRNA) amplificada de cDNA (primeira rodada).
    1. Programar o forno de ar de hibridização para 37 ° C.
    2. Preparar a mistura de mestre para IVT no gelo na seguinte ordem: a 16 µ l do cDNA double-stranded eluted da etapa 2.3.8, adicionar 4 µ l da solução de T7 ATP (75 mM); 4 µ l da solução de T7 CTP (75 mM); 4 µ l da solução de GTP T7 (75 mM); 4 µ l de solução UTP T7 (75 mM); 4 µ l de tampão de reação 10x T7; e 4 µ l do mix de enzima T7. Misture bem, girar e segurar no gelo.
    3. Adicione 24 μL de mistura de mestre o IVT a cada tubo contendo 16 µ l do cDNA. Misture o conteúdo pipetando delicadamente e completamente. Incube o tubo a 37 ° C por 14 h.
      Nota: Incubação por < 12 h severamente afeta rendimento.
    4. Adicione 60 µ l de pyrocarbonate não-diethyl (não-DEPC) tratados água livre de RNase para aumentar o volume a 100 µ l e parar a reação de IVT.
  5. Purifica o aRNA.
    Nota: Todas as centrifugações são executadas no ~ 8.000 x g, à temperatura ambiente. Nunca exceda a 16.000 x g, para evitar danos ao cartucho do filtro.
    1. Inicie aquecimento ~ 200 µ l de água livre de nuclease para 50-55 ° C para uso posterior em um bloco de aquecimento seco ou máquina PCR. Nunca exceda a 58 ° C para evitar a desnaturação parcial de aRNA.
    2. ARNA transferência para um tubo de 1,5 mL nuclease-livre. Adicione 350 µ l de tampão de ligação aRNA para cada amostra de aRNA. Adicione 250 µ l de etanol 100% a cada tubo e misture por 3 vezes por pipetagem (do vórtice não misturar e rotação).
    3. Transferi a mistura imediatamente para a coluna de purificação de RNA adicionando-o suavemente para o centro do refil do filtro. Centrifugar a 8.000 x g por ~ 1 min ou até que a mistura tenha passado totalmente através do filtro. Descartar o escoamento e reutilizar o tubo de coleta de resíduos
      Nota: RNA começará a precipitação sobre a adição de etanol.
    4. Adicione 650 µ l de tampão de lavagem para cada cartucho de filtro. Centrífuga para ~ 1 min em 8.000 x g, ou até que o buffer inteiro já passou. Descartar a passagem e girar os filtros para uma adicional ~ 1 min remover vestígios do tampão de lavagem.
    5. Transferi o filtro para um tubo de coleta de aRNA fresco. Adicione 100 µ l de água pré-aquecida de nuclease-livre (50-55 ° C) ao centro do filtro. Aguarde 2 min e, em seguida, centrifugar para min ~1.5 em 8.000 x g, ou até que tenha passado para o tubo de coleta.

3. segunda amplificação redonda

  1. Sintetizar a primeira cDNA da Costa (segunda rodada).
    1. ARNA transferência de passo 2.5.5 para um tubo de microcentrífuga de 200 µ l e vácuo concentrar a 100 µ l elutant de 10 µ l. não usando nenhum calor, executar o vácuo concentrador de 65 min. Compare com 10 µ l de água em um tubo de 200 µ l para estimar o volume reduzido.
    2. Pré-aqueça o forno de ar de hibridação a 42 ° C.
    3. Adicionar 2 µ l de primers aleatórios hexâmero do kit IVT de aRNA, vórtice brevemente e girar para coletar o conteúdo.
    4. Incubar o tubo de microcentrífuga a 70 ° C por 10 min em um termociclador e, em seguida, coloque-o no gelo.
    5. Preparar a seguinte mistura de mestre RT: 2 µ l de 10x buffer de síntese primeira vertente, 4 µ l de dNTP mix, 1 µ l de inibidor de RNase e 1 µ l da enzima ArrayScript. Misture bem em um tubo de microcentrífuga 200 µ l vortexing suavemente, em seguida girar para coletar o conteúdo e colocar no gelo.
    6. Adicionar 8 µ l do mestre RT mix (primeira vertente) para cada tubo de microcentrífuga. Coloque os tubos em uma incubadora de ar de 42 ° C por 2 h.
    7. Adicione 1 µ l de RNaseH para a reação acima. Misture bem por 2 - 3 vezes de pipetagem e passando rapidamente 3 - 4 vezes e girar para coletar o conteúdo. Incube a 37 ° C por 30 min em uma máquina PCR. Após a incubação, vá para a etapa de síntese segundo-costa imediatamente.
  2. Sintetizar a segunda vertente do cDNA (segunda rodada).
    1. Adicione 3 µ l de T7-RA5 primer (a diluição de trabalho 25 de ng / µ l, tabela 2) e 2 µ l de água livre de RNase para cada amostra de cDNA. Misture bem e girar para coletar o conteúdo.
    2. Incube a 70 ° C por 10 min em um termociclador. Coloque a reação no gelo.
    3. Preparar o mestre RT misturar (segunda vertente) no gelo: 58 µ l de água livre de nuclease, 10 µ l de 10x buffer de segunda vertente, 4 µ l do dNTP mix e 2 µ l de DNA polimerase. Misture bem por num Vortex e spin para coletar o conteúdo. Manter-se no gelo.
    4. Adicione 74 µ l da mistura acima para cada tubo da etapa 3.2.2. Mistura bem pipetando 2 – 3 vezes e 3 - 4 vezes, passando em seguida girar para coletar o conteúdo. Manter em gelo e segure.
    5. Pre-legal o termociclador a 16 ° C, desligando o calor de tampa. Coloque os tubos no termociclador durante 2 h a 16 ° C.
    6. Após a etapa de síntese segundo-costa, coloque os tubos no gelo para prosseguir para a etapa de purificação do cDNA, ou congelar a-20 ° C.
      Nota: recomenda-se a purificação do cDNA antes do congelamento.
  3. Realizar a purificação do cDNA (segunda rodada).
    Nota: Todas as centrifugações são executadas no ~ 8.000 x g, à temperatura ambiente. Nunca exceda a 16.000 x g, para evitar danos ao cartucho do filtro.
    1. Inicie aquecimento água nuclease-livre para 50-55 ° C para uso posterior em um bloco de aquecimento seco. Nunca exceda a 58 ° C para evitar a desnaturação parcial do cDNA.
    2. Transferi o cDNA para um tubo de 1,5 mL nuclease-livre. Adicione 250 µ l de tampão de ligação do cDNA para cada tubo. Verifique precipitados no buffer e aquecer a solução-tampão para 37 ° C por 10 min para re-dissolver. Mix completamente por pipetagem 2 – 3 vezes e passar rapidamente 3 - 4 vezes. Rotação para coletar o conteúdo.
    3. Coloque firmemente o cartucho de filtro de cDNA em tubos de lava. Adicione a mistura acima para o centro do filtro. Centrifugar a 8.000 x g por ~ 1 min ou até que seja através do filtro. Descartar o escoamento e substituir o tubo de lavagem.
    4. Adicione 500 µ l de tampão de lavagem. Certifique-se de etanol foi adicionado para o tampão de lavagem anteriormente. Centrifugar a 8.000 x g por ~ 1 min ou até que seja através do filtro.
    5. Descartar o escoamento e centrifugar novamente a 8.000 x g por ~ 1 min esvaziar o cartucho. Transfira o filtro de cDNA para um tubo de eluição de cDNA.
    6. Aplique 8,5 µ l de água livre de nuclease previamente aquecida no centro do filtro. Aguarde 2 min e centrifugar a 8.000 x g de ~1.5 min. Elute novamente com µ l 8,5 adicional de água livre de nuclease previamente aquecida.
      Nota: O volume de recuperação de cDNA Double-stranded será ~ 16 µ l.
    7. Proceda de imediato à segunda rodada IVT ou congelar o cDNA a-20 ° C durante a noite.
  4. Realize uma segunda rodada de aRNA produção pelo IVT.
    1. Definir hibridização ar forno a 37 ° C (36 ° C setpoint).
    2. Preparar a mistura de mestre para IVT no gelo na seguinte ordem: a 16 µ l do cDNA double-stranded eluted da etapa 3.3.7, adicionar 4 µ l da solução de T7 ATP (75 mM); 4 µ l da solução de T7 CTP (75 mM); 4 µ l da solução de GTP T7 (75 mM); 4 µ l de solução UTP T7 (75 mM); 4 µ l de tampão de reação 10x T7; e 4 µ l do mix de enzima T7. Misture bem, girar brevemente para coletar o conteúdo e manter no gelo.
    3. Adicione 24 μL de mistura de mestre o IVT a cada tubo contendo 16 µ l do cDNA. Misture o conteúdo pipetando delicadamente e completamente. Incube o tubo a 37 ° C por 14 h.
      Nota: A incubação de 12 h de < severamente afeta rendimento.
    4. Adicione 60 µ l de não-DEPC tratada a água livre de RNase para aumentar o volume a 100 µ l e parar a reação de IVT.
  5. Realizar a purificação de aRNA (segunda rodada).
    Nota: Todas as centrifugações são executadas no ~ 8.000 x g, à temperatura ambiente. Nunca exceda a 16.000 x g, para evitar danos ao cartucho do filtro.
    1. Inicie aquecimento ~ 200 µ l de água livre de nuclease para 50-55 ° C para uso posterior em um bloco de aquecimento seco ou máquina PCR. Nunca exceda a 58 ° C para evitar a desnaturação parcial do aRNA.
    2. Transferi o aRNA para um tubo de 1,5 mL nuclease-livre. Adicione 350 µ l de tampão de ligação aRNA para cada amostra de aRNA. Adicione 250 µ l de etanol de 100% de grau de ACS para cada tubo e misture 3 vezes por pipetagem (do vórtice não misturar e rotação).
      Nota: RNA começará a precipitação sobre a adição de etanol.
    3. Transferi a mistura imediatamente para a coluna de purificação de RNA adicionando-o suavemente para o centro do refil do filtro. Centrifugar a 8.000 x g por ~ 1 min ou até que a mistura tenha passado totalmente através do filtro. Descartar o escoamento e reutilizar o tubo de coleta de resíduos.
    4. Adicione 650 µ l de tampão de lavagem para cada cartucho de filtro. Centrífuga para ~ 1 min em 8.000 x g, ou até que o buffer inteiro já passou. Descartar a passagem e girar os filtros para uma adicional ~ 1 min remover vestígios do tampão de lavagem.
    5. Transfira os filtros para um tubo de coleta de aRNA fresco. Adicione 100 µ l de água livre de nuclease pré-aquecido ao centro do filtro. Aguarde 2 min e, em seguida, centrifugar para min ~1.5 em 8.000 x g, ou até que tenha passado.
    6. Alíquota µ l 2 em um tubo para espectrofotômetro (em 260 nm comprimento de onda) e bioanalyzer espalhou-se a análises para verificar a qualidade e rendimento de aRNA.
      Nota: A concentração deve ser pelo menos 5 ng / µ l; caso contrário, rejeite a amostra. A amostra pode ser armazenada por ~ 1 ano a-80 ° C. Evite o congelamento-descongelamento das amostras.
    7. Verifica as amostras usando um bioanalyzer para visualizar a divulgação adequada do aRNA produtos seguindo o protocolo do fabricante (Figura 2).

4. amplificado RNA fragmentação e limpeza

  1. Misture o seguinte no gelo (volume total 40 µ l, combinar 2 tubos aRNA disjunto amostra de códigos de barras): 36 µ l de aRNA (total de 200 ng) e 4 µ l de tampão de fragmentação de RNA. Incubar a mistura a 94 ° C por 90 s.
  2. Afastar-se imediatamente a mistura de gelo e adicionar 4 µ l de tampão de paragem de fragmentação de RNA. Ajuste o volume a 100 µ l, adicionando 56 µ l de água livre de nuclease.
  3. Adicione 350 µ l de tampão RLT da purificação do RNA kit (veja a Tabela de materiais) e misture bem por pipetagem. Adicionar 250 µ l de EtOH, misture bem por pipetagem e transferir a amostra para a coluna de rotação de purificação de RNA. Girar para 15 s a 8.000 x g.
  4. A coluna de transferência para novo tubo de coleção e adicionar 500 µ l de tampão RPE. Girar para 15 s em 8.000 x g descartar o escoamento. Adicione 500 µ l de 80% EtOH e rodada por 2 min a 8.000 x g.
  5. Transferi a coluna para um novo tubo de coleta, tampa aberta da coluna e rotação por 5 min na velocidade máxima.
  6. A coluna de transferência para um novo tubo de coleta e eluir com 16 µ l de água livre de nuclease, girando em alta velocidade por 1 min.

5. Biblioteca preparação

Nota: Indicativo pode ser agrupado neste ponto, se não houver nenhuma sobreposição em código de barras utilizado. O tempo de tratamento de fosfatase 40 min. poli-nucleotide quinase tratamento tempo é 1 h.

  1. A 16 µ l de aRNA fragmentada em um tubo PCR de 0,7 mL, adicionar 4 µ l da seguinte mistura: 2 µ l de 10x buffer de fosfatase, 1 µ l de fosfatase Antártica e 1 µ l de inibidor do ribonuclease recombinante (por exemplo, RNaseOUT). Incubar em um termociclador com o seguinte protocolo: 37 ° C por 30 min, 65 ° C por 5 min e espera a 4 ° C.
  2. Para o tubo PCR 0,7 mL da etapa 5.1, adicionar 30 µ l da seguinte mistura: 17 µ l de água livre de nuclease, 5 µ l de buffer de fosfatase, 5 µ l de ATP (10 mM), 1 µ l de inibidor do ribonuclease recombinante de 10x e 2 µ l de PNK. Incubar no termociclador a 37 ° C por 60 min, em seguida, mantenha a 4 ° C.
  3. Execute uma limpeza de coluna de fosfatase e aRNA PNK-tratados.
    1. Ajuste o volume a 100 µ l pela adição de 50 µ l de água livre de nuclease. Adicione 350 µ l de tampão RLT e misture bem. Adicionar 250 µ l de EtOH, misture bem por pipetagem e transferir a amostra para a coluna de rotação de purificação de RNA.
    2. Girar para 15 s em 8.000 x g transferir a coluna para um novo tubo de coleção e adicionar 500 µ l de tampão RPE.
    3. Girar para 15 s em 8.000 x g descartar o escoamento e adicione 500 µ l de 80% EtOH.
    4. Rodada por 2 min em 8.000 x g. transferência da coluna para um novo tubo de coleta, abrir a tampa da coluna e rotação por 5 min na velocidade máxima.
    5. A coluna de transferência para um novo tubo de coleta e eluir com 14 µ l de água livre de nuclease, girando a toda a velocidade para 1 min recuperar um ~ 10 µ l volume de material. Descarte a coluna. Reduza o volume de 5 µ l utilizando um concentrador a vácuo para ~ 10 min.
  4. Ligate uma 3' kit de adaptador usando um comercial (ver Tabela de materiais).
    1. Diluir o adaptador 3' (RA3) de dobras de kit 3 TrueSeq com água livre de nuclease e armazenar as alíquotas a-20 ° C.
    2. A 5 µ l de fosfatase e RNA PNK-tratados, adicione 1 µ l de diluídos 3' adaptador. Incubar a 70 ° C por 2 min e imediatamente coloque o tubo no gelo para evitar a formação de estrutura secundária.
    3. Adicionar 4 µ l da seguinte mistura: 2 µ l de 5x buffer de ligadura HM (HML), 1 µ l de inibidor de RNase e 1 µ l de RNA T4 ligase do 2 (truncado). Incube o tubo sobre o termociclador previamente aquecida a 28 ° C, durante 1 h (não aquecido ou com a tampa aberta).
    4. Com o tubo de reação, permanecendo sobre o termociclador, adicione 1 µ l de solução de paragem (STP) e suavemente Pipetar todo o volume acima e para baixo 6-8 vezes para homogeneizar. Continue a incubar o tubo de reação sobre o termociclador a 28 ° C, durante 15 min, em seguida, coloque o tubo no gelo.
    5. Adicione 3 µ l de água nuclease livre para obter um volume total de µ l 12 µ l. 6 de uso e armazenar o restante µ 6 l a-80 ° C.
  5. Realize uma reação de transcrição reversa.
    1. Combinar o seguinte em um tubo PCR: 6 µ l de RNA adaptador-ligados e 1 µ l de primer de RNA RT (RTP). Incubar o tubo a 70 ° C por 2 min e, em seguida, imediatamente, colocar o tubo no gelo.
    2. Adicionar 5,5 µ l da seguinte mistura: 2 µ l de 5 x primeiro buffer de vertente, 0,5 µ l de mistura de 12,5 mM dNTP, 1 µ l de 100 mM DTT, 1 µ l de inibidor de RNase e 1 µ l de transcriptase reversa. Incubar o tubo no termociclador previamente aquecida a 50 ° C, durante 1 h e, em seguida, coloque o tubo no gelo (amostras podem ser mantidas a-20 ° C).
  6. Execute a amplificação por PCR com ciclos de 11-15 para enriquecer 5', produto ligados 3'-primer.
    1. Para cada reação de transcrição reversa, adicionar 35,5 µ l da seguinte mistura: 8,5 µ l de água ultra pura, 25 µ l de mistura PCR (PML) e 2 µ l de primer de RNA PCR (RP1). Para cada reação, adicionar 2 µ l de um primer de RNA PCR excepcionalmente indexado (RPIX, X = 1 a 24).
    2. Amplificar o tubo no termociclador usando as seguintes condições de ciclagem do PCR: 98 ° C por 30 s; 12-15 ciclos de 98 ° C por 10 s; 60 ° C a 30 s; 72 ° C por 30 s; 72 ° C por 10 min; em seguida, mantenha a 4 ° C.

6. PCR produto limpeza e seleção de tamanho

  1. Escaldar AmpureXP grânulos magnéticos à temperatura ambiente. Vórtice as contas até que estejam bem dispersos, em seguida, adicionar 50 µ l da reação de PCR de 50 µ l (1:1 produto: grânulos de PCR). Misture o conteúdo de dez vezes para homogeneizar.
  2. Incube a temperatura ambiente por 15 min. lugar num suporte magnético pelo menos 5 min, até que o líquido parece claro. Remova e descarte a 95 µ l do sobrenadante.
  3. Adicionar 200 µ l de acabadas 80% EtOH. Incube durante pelo menos 30 s, em seguida, remover e descartar o sobrenadante sem perturbar os grânulos. Repita isso mais uma vez.
  4. Secar ao ar livre os grânulos por 15 min ou até completamente seco. Resuspenda com 32,5 µ l de tampão de ressuspensão. Pipete o volume acima e abaixo dez vezes para homogeneizar.
  5. Incube a temperatura ambiente por 2 min. lugar num suporte magnético por 5 min, até que o líquido parece claro. Transferi 30 µ l do sobrenadante para um tubo novo. Adicione 20 µ l de água livre de nuclease para obter um volume total de 50 µ l.
  6. Realize a seleção do tamanho dos produtos do PCR com grânulos magnético de imobilização reversível (SPRI) de fase sólida.
    1. Adicione volume x 0,7 (35 µ l) de grânulos SPRI ao tubo preparado no passo 6.5 e misturar completamente pipetando. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
    2. Coloque o tubo num suporte magnético e espere por 5 min ou até as contas separadas. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar os grânulos.
    3. Adicionar 200 µ l de acabadas 85% EtOH. Espere por 30 s, em seguida, remover o EtOH. Secar ao ar livre os grânulos por 10 min.
  7. Adicione 20 µ l de água livre de nuclease. Coloque o tubo de volta sobre o ímã, aguarde 5 min e pipetar a parte líquida, sem perturbar ou tocar os grânulos. Armazenar o DNA a-20 ° C.

7. determinação da quantidade de biblioteca e de qualidade

  1. Verificar a concentração de DNA com um espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm (esperado a concentração é no mínimo ~ 5-10 ng / µ l).
  2. Executar 1 µ l de cada amostra em um bioanalyzer usando um chip de DNA de alta sensibilidade para examinar a distribuição de tamanho (esperado pico é a bp 300 – 400 (ver Figura 3)).

8. apresentação de amostra

  1. Combine o disjunto sequenciamento PCR códigos de barras (proporção de 1:1). Por exemplo, combinar os produtos de PCR de amostras com RPI-1 e 2-RPI, RPI-3 e RPI-4 juntos em quantidades iguais nanograma cada, de acordo com o RNA sequenciando as recomendações do requisito quantidade total exemplo de entrada do núcleo.
  2. Depois de combinar, ajuste a concentração total de 5 ng / µ l e pelo menos um volume de 10 µ l ou como recomendado pelo núcleo de instalação do sequenciamento.

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Resultados

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Usando o protocolo descrito acima, gabaérgica neurônios manualmente foram classificados (Figura 1) e RNA amplificado, depois foi transformado em uma biblioteca de cDNA (Figura 2) e sequenciado em alta profundidade8. Os produtos amplificados do RNA (aRNA) variaram entre 200 – 4.000 bp em tamanho, com uma distribuição de pico ligeiramente acima de 500 bp (Figura 3A). A bibliotec...

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Discussão

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O manual de classificação protocolo é apropriado para uma sequenciação do ARN supervisionada de neurônio populações que são escassamente rotulada do cérebro de ratos ou estão representando uma população de células raras que caso contrário, não é viável para estudar usando a célula atual da elevado-produção métodos de triagem e amplificação. As células submetidas a FACS geralmente sofrem pressões de linha bainha e amostra na faixa de ~ 9 – 14 psi, dependendo do tamanho do bocal e desejado taxas de evento. Além disso, após...

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Divulgações

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Autores declaram que não há nenhum concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH (5R01MH094705-04 e 01-R01MH109665 para Z.J.H.), pelo fundo de neurociência CSHL Robertson (para Z.J.H.) e por um NARSAD Doctoral Fellowship (para A.P.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ERCC RNA Spike-In Control MixesThermo FisherCat# 4456740
SuperScript IIIThermo FisherCat# 18080093
RNaseOUT Inibidor de Ribonuclease RecombinanteThermo FisherCat# 10777019
Tampão de fragmentação de RNANew England BiolabsCat# E6105S
RNA MinElute kitQiagenCat# 74204
Fosfatase antárticaNew England BiolabsCat# M0289
Polinucleotídeo quinaseNew England BiolabsCat# M0201
T4 RNA ligase2, truncadoNew England BiolabsCat# M0242
Ampure Xp contas magnéticasBeckman CoulterCat# A63880
SPRIselecione o tamanho das contas magnéticasThermo FisherCat# B23317
DL-AP5TocrisCat# 0105
CNQXTocrisCat# 1045
TTXTocrisCat# 1078
Protease de Streptomyces griseusSigma-AldrichCat# P5147
Mensagem Kit Amp IIThermo FisherCat# AM1751
CarbogenAirgasCat# UN3156
Sylgard 184Sigma-AldrichCat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kitIlluminaCat# RS-200-0012
Bioanalisador RNA Pico chip AgilentCat# 5067-1513
Bioanalisador Chip de DNA de alta sensibilidadeAgilentCat# 5067-4626
Bioanalisador 2100Agilent
Microscópio de dissecção com fluorescência e iluminação de campo brilhante com óptica DIC.  (Leica modelo MZ-16F).LeicaModelo MZ-16F
Microcapilar de vidro: Tubos capilares de borossilicato 500/pk. OD= 1 mm, ID=0,58 mm, parede= 0,21 mm, Comprimento= 150 mm.Warner instrumentsModelo GC100-15, Pedido # 30-0017
Extrator de pipeta capilarSutter Instruments CoP-97
VibratomeThermo MicromHM 650V
Unidade de resfriamento de tecido vibratomeThermo Microm65

Referências

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  11. Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
  12. Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
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  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
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