Uso complementar de técnicas microscópicas e leitura de fluorescência no estudo de Cryptococcus-Amoeba interações

Summary

Este papel detalha um protocolo para preparar uma cocultura de pilhas e de amebas criptocócica que é estudado usando imagens imóveis, fluorescentes e imagens de alta resolução do microscópio de elétron da transmissão. Ilustrados aqui é como os dados quantitativos podem complementar tais informações qualitativas.

Abstract

Para simular a infecção por Cryptococcus , a ameba, que é o predador natural das células criptocócicas no ambiente, pode ser usada como um modelo para macrófagos. Este organismo predatório, semelhante aos macrófagos, emprega fagocitose para matar células internalizadas. Com o auxílio de um microscópio confocal da laser-exploração, as imagens que descrevem momentos interativos entre pilhas e ameba criptocócica são capturadas. O poder da definição do microscópio de elétron igualmente ajuda a revelar o detalhe ultrastructural de pilhas criptocócica quando prendido dentro do vacuole do alimento do ameba. Como a fagocitose é um processo contínuo, os dados quantitativos são então integrados na análise para explicar o que acontece no momento em que uma imagem é capturada. Para ser específico, as unidades relativas da fluorescência são lidas a fim quantificar a eficiência do ameba em internalizantes pilhas criptocócica. Para esta finalidade, as pilhas criptocócica são manchadas com um corante que os faça fluorescência uma vez prendido dentro do ambiente ácido do vacuole do alimento. Quando utilizados em conjunto, as informações recolhidas através de tais técnicas podem fornecer informações críticas para ajudar a tirar conclusões sobre o comportamento e o destino das células quando internalizada pela ameba e, possivelmente, por outras células fagocíticas.

Introduction

Os micróbios evoluíram ao longo do tempo para ocupar e prosperar em diferentes nichos ecológicos, como os limites físicos abertos do solo e da água, entre outros¹. Nesses nichos, os micróbios muitas vezes se envolvem na concorrência direta por recursos limitados; importante, para os nutrientes que eles usam para apoiar o seu crescimento ou espaço, que eles precisam para acomodar a população em expansão^2,3. Em certos casos, alguns organismos holozoicos como a ameba podem até mesmo antecedem em células criptocócicas como uma forma de extrair nutrientes de sua biomassa⁴

Protocol

Cryptococcus neoformans e algumas cepas de Acanthamoeba Acanthamoeba são consideradas patógenos de nível 2 de biossegurança (BSL-2); assim, os investigadores devem tomar precauções apropriadas ao trabalhar com estes organismos. Por exemplo, o pessoal de laboratório deve ter treinamento específico e equipamentos de proteção individual (EPI), como casacos de laboratório, luvas e proteção ocular. Um armário de segurança biológico (Level-2) deve ser usado para os procedimentos que podem causar a infecção¹⁴.

1. cultivo e padronização de células fúngicas (modificada de Madu et al. ¹⁵....

Results

Micróbios são organismos microscópicos que não podem ser percebidos a olho nu. No entanto, o seu impacto pode resultar em doenças observáveis clinicamente evidentes, tais como infecções cutâneas. Ao estudar certos aspectos dos micróbios, variando de sua morfologia, subprodutos e interações, ser capaz de fornecer evidências pictóricas e de vídeo é de extrema importância.

Primeiramente, procurou-se Visualizar a interação entre cél.......

Discussion

No artigo, diferentes técnicas foram empregadas com sucesso para revelar o possível desfecho que pode surgir quando a ameba interage com células criptocócicas. Além disso, estávamos interessados em mostrar os efeitos dos ácidos graxos 3-hidroxi sobre o desfecho das interações Criptococcus-Amoeba.

A primeira técnica utilizada foi a microscopia confocal, que rendeu imagens ainda. A principal desvantagem desta técnica aqui foi que ele só nos deu informações que é limitada a um determinad.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sigma-Aldrich	D27802-1.5-mL		de 1,4-diazabiciclo-[2.2.2]-octanagem
	Thermo Fisher Scientific	69715-15-mL
	Thermo Fisher Scientific
7252018-50-mL	Thermo Fisher Scientific
1132017-8-Well corrediça de câmara	Thermo Fisher Scientific
1109650-Acetona	Merck
SAAR1022040LC-Amoeba cepa	ATCCÒ	30234TM	-
ATCC medium 712	ATCCÒ	712TM	Amoeba placa de
microtitulação de 96 poços	Thermo Fisher Scientific		152089-Centrifuge
	Hermle	-
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	C2432-Microscópio
confocal	Nikon	Nikon TE 2000-Resina
epóxi:
[1] NSA	[1] ALS	[1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS	[2] R1073	-
[3] Resina ERL Y221	[3] ALS	[3] R1047R	-
[4] S1 (2-dimetilaminoetanol)	[4] ALS	[4] R1067-Isotiocianato	de
fluoresceína	Sigma-Aldrich	F4274-Ácido
fórmico	Sigma-Aldrich
489441-Fluoroskan Ascent FL	Thermo Fisher Scientific	374-91038C	Leitor de microplacas
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270-Glutaraldeído
	ALS	R1009	-
Hemocitômetro	Boeco	-	-
Citrato de chumbo	ALS	R1209-Cromatografia
Líquida Espectrômetro de Massa	Thermo Fisher Scientific-Metanol
	Sigma-Aldrich	R 34,860-Agitador
orbital	Lasec	-	-
Tetróxido de ósmio	ALS	R1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticles	Life Technologies	P35365	Este é o corante sensível ao pH
Solução tampão fisiológico	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB-Agitador
rotativo	Labcon	-	-
Tampão de fosfato de sódio:
[1] hidrogenoortofosfato dissódico di-hidratado	[1] Merck	[1] 106580	-
[2] di-hidrogenoortofosfato de sódio di-hidratado	[2] Merck	[2] Microscópio eletrônico de transmissão 106345
	Philips	Philips EM 100	-
Azul tripano	Sigma-Aldrich	T8154-Ultramicrótomo
	Leica	EM UC7-Acetato	de
uranilo	ALS	R1260A-Dessecador
a vácuo	Lasec;	-	-
Frasco	Sigma-Aldrich	29651-U-YNB
	Lasec	ágar 239210-YPD
	Sigma-Aldrich	Y-1500	-