Este papel detalha um protocolo para preparar uma cocultura de pilhas e de amebas criptocócica que é estudado usando imagens imóveis, fluorescentes e imagens de alta resolução do microscópio de elétron da transmissão. Ilustrados aqui é como os dados quantitativos podem complementar tais informações qualitativas.
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Artigo de método
Uso complementar de técnicas microscópicas e leitura de fluorescência no estudo de Cryptococcus-Amoeba interações
Neste artigo
Resumo
Resumo
Para simular a infecção por Cryptococcus , a ameba, que é o predador natural das células criptocócicas no ambiente, pode ser usada como um modelo para macrófagos. Este organismo predatório, semelhante aos macrófagos, emprega fagocitose para matar células internalizadas. Com o auxílio de um microscópio confocal da laser-exploração, as imagens que descrevem momentos interativos entre pilhas e ameba criptocócica são capturadas. O poder da definição do microscópio de elétron igualmente ajuda a revelar o detalhe ultrastructural de pilhas criptocócica quando prendido dentro do vacuole do alimento do ameba. Como a fagocitose é um processo contínuo, os dados quantitativos são então integrados na análise para explicar o que acontece no momento em que uma imagem é capturada. Para ser específico, as unidades relativas da fluorescência são lidas a fim quantificar a eficiência do ameba em internalizantes pilhas criptocócica. Para esta finalidade, as pilhas criptocócica são manchadas com um corante que os faça fluorescência uma vez prendido dentro do ambiente ácido do vacuole do alimento. Quando utilizados em conjunto, as informações recolhidas através de tais técnicas podem fornecer informações críticas para ajudar a tirar conclusões sobre o comportamento e o destino das células quando internalizada pela ameba e, possivelmente, por outras células fagocíticas.
Introdução
Os micróbios evoluíram ao longo do tempo para ocupar e prosperar em diferentes nichos ecológicos, como os limites físicos abertos do solo e da água, entre outros1. Nesses nichos, os micróbios muitas vezes se envolvem na concorrência direta por recursos limitados; importante, para os nutrientes que eles usam para apoiar o seu crescimento ou espaço, que eles precisam para acomodar a população em expansão2,3. Em certos casos, alguns organismos holozoicos como a ameba podem até mesmo antecedem em células criptocócicas como uma forma de extrair nutrientes de sua biomassa4
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Protocolo
Cryptococcus neoformans e algumas cepas de Acanthamoeba Acanthamoeba são consideradas patógenos de nível 2 de biossegurança (BSL-2); assim, os investigadores devem tomar precauções apropriadas ao trabalhar com estes organismos. Por exemplo, o pessoal de laboratório deve ter treinamento específico e equipamentos de proteção individual (EPI), como casacos de laboratório, luvas e proteção ocular. Um armário de segurança biológico (Level-2) deve ser usado para os procedimentos que podem causar a infecção14.
1. cultivo e padronização de células fúngicas (modificada de Madu et al. 15....
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Resultados
Micróbios são organismos microscópicos que não podem ser percebidos a olho nu. No entanto, o seu impacto pode resultar em doenças observáveis clinicamente evidentes, tais como infecções cutâneas. Ao estudar certos aspectos dos micróbios, variando de sua morfologia, subprodutos e interações, ser capaz de fornecer evidências pictóricas e de vídeo é de extrema importância.
Primeiramente, procurou-se Visualizar a interação entre cél.......
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Discussão
No artigo, diferentes técnicas foram empregadas com sucesso para revelar o possível desfecho que pode surgir quando a ameba interage com células criptocócicas. Além disso, estávamos interessados em mostrar os efeitos dos ácidos graxos 3-hidroxi sobre o desfecho das interações Criptococcus-Amoeba.
A primeira técnica utilizada foi a microscopia confocal, que rendeu imagens ainda. A principal desvantagem desta técnica aqui foi que ele só nos deu informações que é limitada a um determinad.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
O trabalho foi apoiado por uma subvenção da Fundação Nacional de investigação da África do Sul (número de subvenção: UID 87903) e da Universidade do estado livre. Também estamos gratos aos serviços e assistência oferecidos por Pieter Van Wyk e Hanlie Grobler durante nossos estudos de microscopia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sigma-Aldrich | D27802-1.5-mL | de 1,4-diazabiciclo-[2.2.2]-octanagem | |
| Thermo Fisher Scientific | 69715-15-mL | ||
| Thermo Fisher Scientific | |||
| 7252018-50-mL | Thermo Fisher Scientific | ||
| 1132017-8-Well corrediça de câmara | Thermo Fisher Scientific | ||
| 1109650-Acetona | Merck | ||
| SAAR1022040LC-Amoeba cepa | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba placa de |
| microtitulação de 96 poços | Thermo Fisher Scientific | 152089-Centrifuge | |
| Hermle | - | ||
| Clorofórmio | Sigma-Aldrich | C2432-Microscópio | |
| confocal | Nikon | Nikon TE 2000-Resina | |
| epóxi: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] Resina ERL Y221 | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimetilaminoetanol) | [4] ALS | [4] R1067-Isotiocianato | de |
| fluoresceína | Sigma-Aldrich | F4274-Ácido | |
| fórmico | Sigma-Aldrich | ||
| 489441-Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Leitor de microplacas |
| Glicose | Sigma-Aldrich | G8270-Glutaraldeído | |
| ALS | R1009 | - | |
| Hemocitômetro | Boeco | - | - |
| Citrato de chumbo | ALS | R1209-Cromatografia | |
| Líquida Espectrômetro de Massa | Thermo Fisher Scientific-Metanol | ||
| Sigma-Aldrich | R 34,860-Agitador | ||
| orbital | Lasec | - | - |
| Tetróxido de ósmio | ALS | R1015-pHrodo | |
| Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | Este é o corante sensível ao pH |
| Solução tampão fisiológico | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB-Agitador | |
| rotativo | Labcon | - | - |
| Tampão de fosfato de sódio: | |||
| [1] hidrogenoortofosfato dissódico di-hidratado | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] di-hidrogenoortofosfato de sódio di-hidratado | [2] Merck | [2] Microscópio eletrônico de transmissão 106345 | |
| Philips | Philips EM 100 | - | |
| Azul tripano | Sigma-Aldrich | T8154-Ultramicrótomo | |
| Leica | EM UC7-Acetato | de | |
| uranilo | ALS | R1260A-Dessecador | |
| a vácuo | Lasec; | - | - |
| Frasco | Sigma-Aldrich | 29651-U-YNB | |
| Lasec | ágar 239210-YPD | ||
| Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
Referências
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R.
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Reimpressões e permissões
