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Artigo de método

Estabelecimento de linhas de celulares superexpressão DR3 para avaliar a resposta Apoptotic a terapêutica antimitótica

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DOI:

10.3791/58705

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11 de janeiro de 2019

 ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University, 2Department of Radiology, University of California, San Francisco, 3Beijing Advanced Innovation Center for Structural Biology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Estabelecer uma linha de celular estável superexpressão de um gene de interesse para estudar a função do gene pode ser feito por estável do transfection-colheita única clones, depois transfecting-los através de infecção retroviral. Aqui nós mostramos que linhas de célula HT29-DR3 geradas desta forma elucidar os mecanismos pelos qual morte receptor 3 (DR3) contribui para a apoptose induzida por antimitotics.

Resumo

Estudar a função de um gene de interesse pode ser conseguido manipulando o seu nível de expressão, tais como diminuindo sua expressão com linhagens celulares "knockdown" ou aumentando a sua expressão com linhas de células de superexpressão. Transfecção transiente e estável são dois métodos que são usados frequentemente para a expressão dos genes exógenos. Transfecção transiente é útil somente para expressão de curto prazo, Considerando que transfection estável permite que genes exógenos ser integrado no genoma da célula de acolhimento onde ele será continuamente expressa. Como resultado, transfection estável é geralmente empregado para pesquisa em regulamento genético a longo prazo. Aqui descrevemos um protocolo simples para gerar uma linha de celular estável superexpressão do receptor de morte marcou 3 (DR3) para explorar a função DR3. Nós escolhemos o único clones após uma infecção retroviral a fim de manter a homogeneidade e a pureza das linhas celulares estável. As linhas de célula estável geradas usando este protocolo processam DR3-deficiente HT29 células sensíveis às drogas antimitóticas, assim, reconstituir a resposta de apoptose em células HT29. Além disso, o tag da bandeira no DR3 compensa a indisponibilidade de bom anticorpo DR3 e facilita o estudo bioquímico do mecanismo molecular pelo qual agentes antimitóticos induzem apoptose.

Introdução

Expressão gênica heteróloga é frequentemente usado para estudar a função dos genes de interesse. Dois métodos, transfecção transiente e estável, são predominantemente utilizados em células e biologia molecular para inserir um segmento de DNA ou RNA em uma célula de acolhimento1,2. Transitoriamente transfectadas DNA ou RNA não pode ser passado às células, para que a alteração genética só pode ser retida por um curto período de tempo. Por outro lado, nas células transfectadas estàvel, genes exógenos são integrados no genoma da célula de acolhimento, sustentando a sua expressão na linhagem celular. Assim, transfection estável é um método que é geralmente reservado para a investigação em regulamento genética a longo prazo. A linha celular estável também pode ser transplantada como xenografts em modelos do rato in vivo estudo3. Transfection estável pode ser dividido em duas categorias: nonviral e virais. Comparado a nonviral transfecção, infecção viral pode transferir genes para uma ampla variedade de células humanas com uma maior eficiência4,5,6,7. Além disso, uma linha de celular estável de um único clone oferece a vantagem de homogeneidade e pureza clonal.

Divisão e crescimento descontrolado de células são as características de câncer. Em ambientes clínicos, agentes antimitóticos são os tratamentos primários para muitos tipos de tumores8. No entanto, algumas limitações significativas de agentes antimitóticos não podem ser ignoradas. Em primeiro lugar, esses agentes quimioterápicos também podem matar células normais juntamente com as células cancerosas indesejáveis e, assim, podem resultar em efeitos colaterais graves8. Segunda, antitubulin de drogas não são eficazes contra todos os tipos de tumores, apesar da expressão de onipresente da tubulina em uma grande variedade de tecidos diferentes, como uma proteína do citoesqueleto9,10. Não está claro por que agentes antitubulin mostraram promissor eficácia contra ovário, pulmão e cancros hematológicos no tratamento clínico, mas não no rim, cólon ou cânceres pancreáticos11. Finalmente, mesmo os pacientes com o mesmo tipo de tumor podem responder para os antimitotics diferente de forma imprevisível. Pode haver uma molécula efetora chave que afeta a sensibilidade dos pacientes diferentes agentes antimitóticos, resultando em diversos resultados vistos no tratamento clínico12. Assim, as potenciais sensibilidades diferenciais dos pacientes ao tratamento antimitóticos devem ser tomadas em consideração para otimizar intervenções terapêuticas13.

Uma tela de biblioteca do elevado-throughput do inteiro-genoma siRNA demonstrou que o knockdown DR3 poderia render sensíveis células resistentes a drogas antimitóticas, implicando um papel para DR3 na apoptose induzida por quimioterapia14. Como um membro da superfamília do receptor (TNFR) de fator de necrose tumoral, DR3 tem sido relatado para mediar a apoptose celular em diversos sistemas15,16,17,18. Assim, partimos para estabelecer linhas de célula estável superexpressão DR3 para estudar os mecanismos moleculares pelos quais Medicamentos antimitóticos induzem apoptose. Um modelo de célula apropriada para o estudo DR3 superexpressão pode ser fornecido pela linha de celular de câncer de cólon humano HT29, que foi encontrado para ser DR3-deficiente. Além disso, na clínica, cancros do cólon são insensíveis a medicamentos antimitóticos19.

Neste artigo, descrevemos um método que permite a geração de uma linhagem de células estáveis de HT29-DR3 através de infecção retroviral. Ainda mais, nós mostramos como validar a expressão DR3 nestas células usando a mancha ocidental e como avaliar a sensibilidade aos agentes antimitóticos usando um ensaio da viabilidade celular e observação morfológica. As células são amplificadas de clones único e, assim, têm a vantagem de um fundo genético homogênea. Além disso, o tag da bandeira no DR3 permitido para a visualização de DR3 celular por microscopia e análise da interação de expressão e da proteína do gene por abordagens bioquímicas. Além disso, as células podem ser xenografted em ratos para analisar mais a progressão do tumor em resposta a antimitotics no vivo14.

O sistema de célula de HT29-DR3 apresentado aqui ofereceu uma ferramenta eficaz para estudar os mecanismos moleculares de como antimitotics matar células de câncer14. Desde superexpressão e linhas celulares "knockdown" são ferramentas comuns para estudar a função do gene, este protocolo pode ser facilmente adaptado para outros genes de interesse ou outras linhas de células e, assim, transformou-se uma abordagem amplamente utilizada.

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Protocolo

Por favor, note que todos os experimentos de rato aqui descritos foram aprovados e efectuados de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) na Universidade de Tsinghua.

1. geração de linhas de células de superexpressão DR3

  1. Construir o plasmídeo de expressão DR3 (pMXs-IRES-DR3-bandeira), inserindo cDNA de DR3 completo com 3 x bandeira no C-terminal em vetor retroviral pMXs-IRES-Blasticidin dos locais de restrição de BamHI/XhoI.
  2. Desenvolvem-se células Plat-A em pratos de 60 mm com 4 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM). No dia seguinte, quando as células atingem 80% - 90% confluência, transfect as células com 2 μg de plasmídeo pMXs-IRES-DR3-bandeira usando o reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais) de acordo com manual20 do fabricante.
  3. Depois de 72 h, recolher o sobrenadante, a mídia usando um filtro de estéril 0,45 μm do filtrado e manter a suspensão viral no escuro a 4 ° C.
  4. Desenvolvem-se células HT29 em DMEM em um prato de 60 mm e incubar a 37 ° C com 5% CO2células.
  5. No dia seguinte, quando as células atingem 30% - 50% de confluência, infectar as células com 2 mL de vírus em suspensão na presença de 8 μg de 1,5-dimetil-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide por mililitro de suspensão viral. Após 4-6 h de incubação a 37 ° C, aspirar a suspensão viral, adicione 4 mL de DMEM fresco e devolver o prato para a incubadora.
  6. Descartar os meios de comunicação de postinfection de 24 h a pratos e lavar cuidadosamente as células com 2 mL de PBS escaldadas. Adicionar 1 mL de tripsina-EDTA para as células e incubar a 37 ° C por 3 min.
  7. Depois de observar ao microscópio com ampliação de 10x que a maioria das células têm destacado, pare a tripsinização com 2 mL de DMEM completo contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Recolher a suspensão de células em um tubo de 15 mL e centrifugar as células a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
  8. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de DMEM. Misture bem delicadamente pipetagem para cima e para baixo. Dilua as células de fatores de 30, 100 e 300. As células em pratos de 150 mm com 20 mL de DMEM contendo 1 µ g/mL blasticidin de sementes. Incube a uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 por ~ 1-2 semanas.
  9. Durante este período, as colônias observe todos os dias com um microscópio invertido na ampliação de 10x. Marca as colônias bem isoladas no fundo do prato quando o diâmetro da colônia é cerca de 1-2 mm.
  10. Aspire o meio e lavar as células com 3 mL de PBS pré-aquecido. Adicione 2 ml de EDTA-tripsina em um prato de 60 mm. Use pinça estéril para pegar autoclavados cilindros clonagem estéril e colocá-los no prato 60 mm. Pegue os cilindros contendo tripsina-EDTA e delicadamente, coloque-os sobre as colônias marcadas. Certifique-se de cada cilindro clonagem só contém uma colônia e evitar a contaminação com colônias vizinhas.
  11. Devolver o prato para a incubadora durante 3 minutos.
  12. Depois de 3 min, verificar as células sob o microscópio com ampliação de 10x para ver se eles têm destacado. Quando as células têm levantado, adicione 70 μL de meio de cultura para cada cilindro para inactivar a tripsina. Misture suavemente a suspensão de células com uma pipeta de 200 μL. Certifique-se de não se mover o cilindro durante este processo.
  13. Transferi a suspensão de células de cada colônia para duas placas de 24 poços contendo 1 mL de DMEM por alvéolo. Adicionar 30 μL da suspensão de células por poço na placa A e 70 μL no correspondente poços na placa B. Label as placas corretamente e colocá-los de volta na incubadora.

2. verificação da linha DR3 Overexpression celular

  1. Quando as células na placa B estão na confluência de 90%, remova a mídia e lavar cuidadosamente as células com 1 mL de PBS. Completamente remover PBS e lyse as pilhas com 50 μL de tampão de carregamento SDS-PAGE 1x. Transferir os lisados celulares da placa de 24 para tubos de centrífuga de 1,5 mL e ferva as amostras durante 10 minutos a 100 ° C.
  2. Execute as amostras no gel de sulfato de sódio (SDS) de dodecil de sódio 10% em uma tensão constante de 80 V por 15 min e, em seguida, em 120 V por 1h.
  3. A proteína de transferência para uma membrana (PVDF) de fluoreto de polivinilideno por transferência molhada em uma corrente constante de 400 mA por 2 h.
  4. Teste a expressão DR3 em diferentes clones com anticorpo anti-FLAG, usando as selvagem-tipo pilhas HT29 como um controle negativo (Figura 1). Diluir o anticorpo primário por um fator de 5.000 em 5% leite desnatado que é dissolvido em TBST (Tris salino contendo 0,1% Tween-20). Incube a membrana com anticorpos de bandeira a 4 ° C durante a noite.
  5. Lave a membrana com TBST sacudindo um agitador decoloring a 200 rpm no RT. Refresh a cada 5 min para um total de tempo de 15 min de lavagem TBST.
  6. Incube a membrana com anti-rato anticorpo secundário diluído por um fator de 10.000 em 5% de leite desnatado a 4 ° C, durante 5-6 h.
  7. Lave a membrana novamente como descrito na etapa 2.5.
  8. Detectar a expressão bandeira usando substrato de quimioluminescência reforçada ocidental (ECL) e a membrana com um sistema de documentação do gel de imagem (consulte a Tabela de materiais). Identifica os clones expressando DR3 como os clones positivos.
  9. Transferi os clones na placa A que correspondem aos clones positivos na placa B para uma placa de 6 e continuam a amplificar as células até cultivá-las em pratos de 10 cm. Faça estoques congelados das células de crescimento de clones positivos e armazená-los a-80 ° C para uso futuro.

3. avaliação da resposta a agentes antimitóticos Apoptotic de células

Nota: Diazonamide é uma nova classe de produto natural marinho que tem notável atividade em inibir o crescimento de células de câncer, que espelha a outros agentes de tubulina-desestabilizando21. No entanto, seu modo de ação ainda não está claro. Para testar a resposta celular das células aos agentes antimitóticos, paclitaxel e diazonamide foram usados para tratar o selvagem-tipo HT29 pilhas e pilhas HT29-DR3. As drogas foram dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO), existências de 10 mM e, depois, mais diluídas para diferentes concentrações: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3.000 nM e 10.000 nM em DMSO.

  1. Recolha pilhas HT29 e HT29-DR3 por tripsinização. Medir a densidade de células usando um contador automático de células. Em seguida, as sementes das células em placas de 12-poços em DMEM com uma densidade de 3 x 104 células por poço. No dia seguinte, adicionar 10 nM diazonamide e usar 1% DMSO como controlo negativo. Após 48 h de tratamento, as células sob um microscópio com ampliação de 10x (Figura 2) da imagem.
  2. HT29 sementes e HT29-DR3 células em placas de 96 poços em DMEM com uma densidade de 3 x 103 células por poço e permitir-lhes a crescer durante a noite a 37 ° C. Em seguida, adicione cada dose maiores concentrações de diazonamide de 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM e 100 nM para cada poço, usando 1% DMSO como controlo negativo.
  3. Após 48 h de tratamento, medir a viabilidade celular usando um kit de ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência de acordo com o manual do fabricante.
    1. Retire a placa de 96 poços da incubadora e deixá-lo ficar em RT por aproximadamente 30 min. Em seguida, adicione 50 µ l de reagentes de ensaio para cada poço, agitar a placa no RT por 2 min para lisar as células e incube a placa na RT para outro 10 min. Determine a luminescência de cada poço usando um leitor de microplacas (Figura 3).
      Nota: A viabilidade celular representa a intensidade de luminescência relativa de cada um para o controle bem tratada com 1% de DMSO.
  4. Use camundongos BALB/c seis semanas de idade fêmeas nuas para na vivo estudo14.
    Nota: Os ratos foram mantidos sob condições específicas isentos de organismos patogénicos.
    1. Trypsinize HT29 e HT29-DR3 célula e, em seguida, pare a tripsinização usando DMEM pré-aquecido a 37 ° C. Recolher a suspensão de células em um tubo de 50 mL e centrifugar as células a 1.000 rpm durante 10 minutos a RT. descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio DMEM sem FBS. Centrifugar as células novamente e ressuspender as células em PBS.
    2. Contar as células usando um contador automático de células e diluir as células a uma concentração de 2,5 x 107 células/mL usando PBS. Gere tumores através de uma injeção subcutânea de 200 µ l de suspensão de célula HT29 ou HT29-DR3 no flanco direito de cada rato (5 x 106 células/mouse)22.
    3. Medir o volume do tumor (TV) usando compassos cada 2 d após o transplante. Calcular a TV usando a seguinte fórmula: TV = 1 / 2L x W x W (aqui, w: largura de tumor, l: comprimento do tumor). Quando o volume do tumor médio atinge cerca de 100 mm3, randomizar os ratos para o controle ou grupo tratado (n = 6 por grupo) e iniciar o tratamento.
    4. Prepare a solução de paclitaxel como segue. Primeiro, dissolver o paclitaxel completamente em etanol a 5% do volume total e, em seguida, adicione o óleo de mamona 5% do volume final de polioxilo 35 hidrogenados. Finalmente, compõem os restantes 90% do volume com D5W (5% dextrose em água, pH 7,4).
    5. Injetar o paclitaxel por via intravenosa na dose de 20 mg/kg 3 x por semana, durante duas semanas. Medir o tumor volume e corpo peso 3 x uma semana14. Encerrar o experimento e eutanásia dos animais, se o peso do corpo diminui em 20% ou o volume do tumor atinge cerca de 2.000 mm3.

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Resultados

Uma caracterização das pilhas HT29 estàvel expressando DR3 é mostrada na Figura 1. Os clones expressam níveis variados de DR3, enquanto as células do tipo selvagem, que serve como um controle negativo, não mostram a expressão dos genes exógenos. Aqui mostramos apenas cinco clones, entre os quais clonar 1 e 5 expressam o alto nível de DR3. Nós escolhemos o clone 1 e 5 para os experimentos seguintes.

...

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Discussão

Este manuscrito, descrevemos um método para gerar linhas de célula estável HT29-DR3. HT29-DR3 células fornecem um modelo para estudar os mecanismos moleculares pelos quais DR3 contribui para a apoptose induzida por agentes antimitóticos. Esta abordagem é versátil e repetíveis. Para garantir o sucesso do procedimento, quatro etapas-chave do protocolo precisam ser considerados. Em primeiro lugar, a fim de produzir uma alta suficiente concentração de vírus, recomenda-se realizar a transfeccao de DNA quando as células Plat-A...

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Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios 53110000117 (a G.W.) e 043222019 (para X.W.) da Universidade de Tsinghua.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMInvitrogenC11965500BTSuplementado com 10% de FBS e 1% de Penicilina/Estreptomicina
Ensaio de Viabilidade de Células LuminescentesPromegaG7571
PaclitaxelSelleckS1150
pMXs-IRES-BlasicidinCell BiolabsRTV-016
Dimetilsulfóxido SigmaD2650
PBSInvitrogenC14190500BT
Tripsina-EDTA (0,25%)Invitrogen25200056
1,5-Dimetil-1,5-diazaundecametileno polimetobromidaSanta Cruzsc-134220
  Reagente de transfecçãoPromegaE2311
Anticorpo secundário anti-camundongoJackson ImmumoResearch115-035-166
anticorpo anti-bandeiraLinha celular SigmaF-3165
HT29 Linha celularATCCHTB-38
plat-A Linha celularCell BiolabsRV-102
PVDF Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Cilindro de clonagemSigmaC1059
Leitor multimodo de imagem celularBiotekBTCYT3MV
CKX53 Microscópio invertidopoços Placas
de cultura de células de 12 poçosPlacasde cultura de células Nest 712001
60 mmTubosde
0,22 μ m filtro estérilSLGP033RBMillipore
5810 REppendorf5810000327
Microplaca de Poliestireno Branco de 96 Poços Corning3903
Western ECL SubstrateBIO-RAD1705060
ImageQuant LAS 4000GE HealthcareImageQuant LAS 4000 
Descolorindo Shaker HINOTECHTS-2000A
BlasticidinaInvivoGenant-bl-1
Contador de células automatizadoBIO-RADTC 20
Opti-MEM I Soro Reduzido MeioThermoFisher 31985070
Placas de cultura de células de 12 centrífuga de 15 mL Nest 705001 601052 Centrífuga

Referências

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