Artigo de método

Immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina

DOI:

10.3791/58735

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7 de janeiro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

Neste artigo

Resumo

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Nós descrevemos o uso de immunoblotting quantitativa para validar a histologia de imunofluorescência, juntamente com a análise de imagens como meio de quantificar uma proteína de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE). Nossos resultados demonstram a utilidade da histologia de imunofluorescência para determinar a quantidade relativa de proteínas biomarcador em amostras de biópsia de rotina.

Resumo

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Quantificação de proteínas de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE) é importante na clínica e aplicações de pesquisa. Um método ideal de quantificação é exato, tem uma ampla gama de dinâmica linear e mantém a integridade estrutural da amostra para permitir a identificação dos tipos de células individuais. Métodos atuais como imuno-histoquímica (IHC), espectrometria de massa e immunoblotting cada um não cumprem estas estipulações devido à sua natureza categórica ou necessidade de homogeneizar a amostra. Como um método alternativo, propomos a utilização de análise de imagem para determinar a abundância relativa de uma proteína de interesse em tecidos FFPE e imunofluorescência (IF). Neste documento vamos demonstrar que este método é facilmente otimizado, produz uma ampla faixa dinâmica e é linearmente quantificável em comparação com o padrão-ouro de immunoblotting quantitativa. Além disso, este método permite a manutenção da integridade estrutural da amostra e permite a distinção de vários tipos de células, que pode ser crucial em aplicações diagnósticas. Globalmente, este é um método robusto para a quantificação relativa de proteínas nas amostras FFPE e pode ser facilmente adaptado para atender clínicas ou as necessidades de investigação.

Introdução

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A necessidade de quantificar proteínas no formalin-fixas, parafina amostras de biópsia de tecido (FFPE) existe em muitos campos clínicos. Por exemplo, quantificação de proteínas biomarcador em espécimes de biópsia de rotina é usada para elucidar o prognóstico e informar o tratamento para pacientes de câncer1. No entanto, métodos atuais são tipicamente subjetivos e faltam de validação.

Imuno-histoquímica (IHC) é usado rotineiramente em laboratórios de patologia e geralmente depende de um anticorpo primário dirigidas a proteína do alvo e um anticorpo secundário conjugado com um rótulo enzimático, tais como a peroxidase de rábano2. IHC convencional é sensível, pode fazer uso de minuto amostras e preserva a integridade morfológica de amostras de tecido, permitindo a avaliação da expressão da proteína dentro de seu contexto histológico relevante. No entanto, porque o cromogênico sinal gerado pelo IHC é subtrativo, sofre de uma faixa relativamente estreita dinâmica e oferece um potencial limitado de multiplexação de3,2,4. Espectrometria de massa de ionização/dessorção do laser assistida por matriz (MALDI-MSI) de imagem preserva a integridade morfológica. No entanto, esta tecnologia em desenvolvimento é associada com a modesta resolução morfológica e requer calibração significativa e normalização, prejudicando sua viabilidade para uso clínico rotineiro5,6,7. Técnicas alternativas para quantificar proteínas em amostras de tecido incluem immunoblotting8, espectrometria de massa9,10,11e enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)12, cada de que começa com um homogeneizado lisado de tecido de amostra. Amostras de tecido primário são heterogêneas em que eles contêm uma infinidade de tipos de células. Portanto, técnicas que impliquem a homogeneização das amostras não permite a quantificação de uma proteína em uma população de célula específica de interesse, tais como células cancerosas.

Como IHC, se é aplicável às pequenas FFPE amostras e permite a manutenção da integridade histológicas13. No entanto, graças à natureza aditiva de sinais de fluorescência, se é passível de aplicação de vários anticorpos primários e etiquetas fluorescentes. Assim, uma proteína de interesse pode ser quantificada relativamente dentro de células específicas ou compartimentos celulares (por exemplo, núcleo e citoplasma) definidos usando outros anticorpos. Sinais de fluorescência também têm a vantagem de uma maior gama dinâmica13,14. A superioridade, reprodutibilidade e multiplexação potencial de se aplicado a amostras FFPE tem sido demonstrada13,14,15.

Neste documento descrevemos o uso de quantitativo immunoblotting utilizando linhagens celulares estabelecidas como padrão ouro para apurar a natureza quantitativa de se juntamente com a análise de imagem computadorizada na determinação da abundância relativa de uma proteína de interesse em cortes histológicos de amostras de tecido FFPE. Nós aplicamos esse método com êxito em uma abordagem multiplex para quantificar proteínas biomarcador em amostras de biópsia clínico16,17,18.

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Protocolo

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Aprovação para usar as amostras de tecido humano primário foi obtida as Ciências da saúde e afiliado hospitais de ensino pesquisa ética Board (HSREB) na Universidade da rainha.

1. construção de um linha celular tecido Microarray (TMA)

  1. Células de colheita e lavagem.
    Nota: Este protocolo foi testado em várias linhas celulares imortalizado estabelecidas (por exemplo, HeLa, Jurkat, RCH-ACV).
    1. Para as células aderentes, colheita aproximadamente 1,3 x 107 células quando atingem cerca de 80% de confluência. Separe células usando um reagente apropriado para essa linha de celular.
      Nota: O ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) é geralmente preferido por tripsina para reduzir o risco de degradação de proteínas de superfície. Se usando tripsina, neutralize a tripsina utilizando soro fetal bovino (FBS) imediatamente após a colheita das células.
    2. Para células de suspensão, colheita cerca de 8 x 107 células em fase de crescimento log.
    3. Colete as células colhidas/separado por centrifugação por 5 min em 225 g de x em um tubo cónico de 50 mL.
    4. Decante o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x. Centrifugue por 5 min em x 225g e decante o sobrenadante.
      Nota: 1X PBS é composto de 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 em água destilada; ajuste o pH para 7,4.
  2. Pelota-los e corrigir as células em formol.
    1. Suspenda o centrifugado no interior do tubo cônico em 10 mL de formol tamponado neutro a 10% (NBF).
      Nota: NBF pode ser preparado diluindo-se 1 mL de solução de formaldeído 37% em 9 mL de 1X PBS.
      Cuidado: Tenha cuidado ao manusear formalina e formaldeído. Use uma coifa para etapas envolvendo formalina e formaldeído.
    2. Incube as células em um roqueiro a 24 rpm na temperatura de quarto durante a noite (cerca de 17 h).
    3. Prepare uma solução de 1% de agarose de baixo ponto de fusão em PBS (0,01 g de agarose por 1 mL de PBS).
      1. Prepare-se para 500 µ l da solução de agarose, por exemplo de linha de celular.
      2. Dissolva o agarose em um 80 ° C água banho ou calor bloco, com ocasionais de mistura para 2-5 min. Uma vez dissolvido, manter a solução em um bloco 37 ° C de água banho ou calor para evitar o endurecimento.
    4. Pellet de células fixas do passo 1.2.2 a centrifugação por 5 min em 225 g. x remover o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de PBS 1x.
    5. Transferi as células em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e pelota por centrifugação por 5 min em 290 x g. aspirado de fora todo o sobrenadante.
  3. Converter células em agarose.
    1. Adicione ~ 500 µ l de solução de agarose 1% (da etapa 1.2.3) para cada tubo contendo as células. Suavemente, mas rapidamente, pipete mistura acima e para baixo usando uma micropipeta P-1000 para misturar.
      Nota: Corte a extremidade da ponta da pipeta para ampliar a abertura e evitar a formação de bolhas. Manter a solução de agarose trabalhando em banho de água a 37 ° C para evitar o endurecimento.
    2. Permitir que a solução de agarose-célula a endurecer (5-10 min) à temperatura ambiente. Adicione 1 mL de 10% NBF para cada microcentrifuga tubo contendo uma amostra e manter à temperatura ambiente até parafina incorporação (até 24 h).
  4. Prepare a ficha de agarose para a incorporação de parafina.
    1. Aspire fora o NBF da amostra.
    2. Retire a ficha da célula usando uma lâmina de barbear para cortar o tubo microcentrifuga, coloque a tomada dentro de tecido plástico. Armazenar fitas em 10% NBF em temperatura ambiente.
  5. Processar as amostras durante a noite ou manualmente ou usando um processador de tecido automatizado e incorporar em cera de parafina usando métodos padrão de histologia.
    Nota: Ver Fischer et al. 19 para um protocolo de exemplo.
  6. Usando um especializados "arrayer de tecido" instrumento, colheita duplicados núcleos de 0,6 mm de parafina bloqueiam de cada linhagem celular e insira-os, nas linhas, um bloco de parafina destinatário vazio a fim de criar uma linha de celular TMA.
    Nota: Os métodos padrão devem ser usados como os descritos em Fedor e De Marzo20.
  7. Incorpore os núcleos de amostras primárias, representando 2-3 tipos de tecido adicional (por exemplo, tonsila, cólon, testículos, etc.) como controles positivos ou negativos para o TMA. Escolha os tecidos que são apropriados para a proteína de interesse.
  8. Use um micrótomo para preparar dois cortes histológicos, aproximadamente de 4 a 6 µm de espessura, da linha celular TMA. Montar a seção em um slide de histologia, secá-lo e deparaffinize (conforme descrito em Fedor e De Marzo20).

2. amostra de coloração por imunofluorescência

  1. Otimize a diluição do anticorpo primário.
    Nota: Os protocolos padrão existem para a otimização de IHC ou se para seções de tecido FFPE tais como em Kajimura et al 21. um breve panorama da abordagem é descrito aqui.
    1. Prepare diluições de 4-5 de anticorpo primário para a proteína de interesse guiado pelas instruções do fabricante.
    2. Identifica um tipo de tecido do controle de fonte animal ou humana que expressa a proteína de interesse em populações de células morfologicamente reconhecíveis. Preparar as seções do tecido e montá-los em um slide, seguindo o procedimento padrão imuno-histoquímica como Fedor e De Marzo20.
      Nota: O número de seções necessárias é o número de diluições de anticorpo primário, mais um extra.
    3. Usando um sistema automatizado ou manual para o immunohistology, teste as diluições de anticorpo primário da etapa 2.1.1 cada em um slide da etapa 2.1.2. Omitir a aplicação de anticorpo primário de slide extra e usá-lo como um controle negativo.
    4. Durante o processo de coloração, manche todas as lâminas com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como um corante de contraste nuclear e um anticorpo secundário fluorescente etiquetado. Se maior sensibilidade for necessária, use um HRP (peroxidase de rábano silvestre)-conjugado anticorpo secundário e o sistema de amplificação de sinal com base em tyramide (veja pilha et al 13).
      Nota: Quando os anticorpos primários de multiplexação, uma etiqueta fluorescente diferente é usada para cada proteína.
    5. Digitalizar slides immunostained usando um instrumento adequado capaz de gerar um arquivo de imagem digital, usando a excitação e deteção comprimentos de onda adequados para o fluorophores que foram usados.
    6. Use o software apropriado para visualizar as imagens digitais e escolha empiricamente a diluição do anticorpo primário que otimiza a intensidade de sinal em relação à fluorescência de fundo.
      Nota: Se desejado, essa otimização pode ocorrer usando um anticorpo secundário conjugado HRP, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) e microscopia brightfield.
  2. Execute se coloração sobre a linha de celular TMA.
    1. Use um sistema automatizado ou manual para o immunohistology para manchar um slide da linha celular TMA com a diluição de anticorpo primário otimizado (conforme determinado na etapa 2.1). Omitir a aplicação de anticorpo primário do segundo slide e usá-lo como um controle negativo.
    2. Durante o processo de coloração, manche todas as lâminas com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) como um corante de contraste nuclear e um anticorpo secundário e tyramide como na etapa 2.1.4.
    3. Digitalizar slides immunostained usando um instrumento adequado capaz de gerar um arquivo de imagem digital, usando a excitação e deteção comprimentos de onda adequados para o fluorophores que foram usados.
    4. Use um pacote de software de análise de imagem para identificar o compartimento celular de interesse (ou seja, citoplasma e núcleo) e quantificar a intensidade de fluorescência média (IFM) para cada linha de celular.
      Nota: Vários pacotes de software podem ser usados para essa finalidade, e muitos são discutidos em pilha et al 13.

3. quantitativo Immunoblotting de linhas celulares

  1. Prepare lysates de células.
    1. Colheita 2 milhões de células de cada linha de celular, como descrito nos passos de 1.1.1 a 1.1.3.
    2. Gire as células para baixo por 5 min a 650 x g em um tubo cónico de 50 mL. Decante o sobrenadante.
    3. Lavam-se células com 10 mL de PBS gelado. Resuspenda em 1 mL de PBS gelada e a transferência para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Centrifugue conforme passo 3.1.2, decantar e deixar as células no gelo.
    4. Adicionar cerca de 200 µ l de tampão de Lise radioimmunoprecipitation frio (RIPA) com inibidores de protease (10 µ l de inibidores de X 100 / mL de tampão de Lise RIPA) para as células, vórtex e incubar no gelo por 15 min.
      Nota: A quantidade de tampão de Lise necessário para lise eficaz varia conforme a linha celular e pode ser determinada empiricamente. O amortecedor de RIPA é composto por 150 mM de NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% de sódio Deoxycholate do, SDS 0,1% em água destilada.
    5. Para garantir o mesmo relativamente a carregar sobre o immunoblots, quantificar a proteína total em uma amostra de 20 µ l de cada lisado usando um método apropriado, tais como o ensaio de Bradford. Adicionar cerca de 40 µ l de tampão de Lise X Laemmli 6 que o restante (aproximadamente 180 µ l) de cada lisado celular e ferve a 100 ° C em um banho de água ou bloco térmico por 5 min.
      Nota: 6 X Laemmli reserva é composta de 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (p/v) SDS, 60% de glicerol, 0,6% (p/v) de bromofenol, 50mm ditiotreitol (DTT) em água destilada.
    6. Armazene as amostras a-20 º C por até duas semanas.
  2. Execute um immunoblot de todas as linhas de células para determinar qual linha celular tem a mais abundante proteína do interesse.
    Nota: Siga o procedimento descrito em Marques, T. e Yang, PC. 22, com as seguintes modificações.
    1. Alíquota de células lisado (preparado no passo 3.1) contendo 10-50 µ g de proteína (dependendo da abundância da proteína de interesse) para tubos de microcentrifuga. Adicione 2,5 µ l de 6 X Laemmli buffer e suficiente do lysis RIPA tornar-se o volume até 15 µ l.
    2. Carregar um 5% de empilhamento e uma concentração adequada resolução (por exemplo, 10% para proteínas entre 15-100 kDa) gel de SDS-PAGE com uma escada de proteína e as amostras da etapa 3.2.1. Carrega 1 buffer de X Laemmli em poços vazios. Execute o fornecimento de energia em configurações apropriadas, normalmente 125 V, para 80 min ou até que o corante azul de bromofenol atinge o fundo do prato.
    3. Executar uma transferência de proteína semi-seca, conforme descrito no Wiedemann et al . 23.
      Nota: para os resultados representativos, uma membrana de nitrocelulose (que não precisa ser embebido em metanol), e buffer de transferência frio Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) foram utilizados. Buffer de BSN é composta de 48 mM Tris, glicina de 39 milímetros, 20% de metanol em água destilada.
    4. Após a transferência, use uma lâmina de barbear para cortar a membrana horizontalmente para separar a porção que contém a proteína de interesse de uma proteína de controlo interno apropriado, como GAPDH.
    5. Proceda à incubação do bloqueio e anticorpo usando o tampão de bloqueio recomendado pelo fabricante dos anticorpos primários.
      Nota: As diluições de anticorpo primário podem variar dramaticamente dependendo da sensibilidade e da abundância de proteína. Para os resultados representativos abaixo, o anticorpo à proteína de interesse necessário uma diluição de 1:1,000 enquanto o controle GAPDH necessária uma diluição de 1:40,000. A diluição de anticorpos secundários usado foi de 1:3, 000.
    6. Após a incubação do anticorpo e lavagem da membrana, coloque as tiras de membrana em uma bainha de plástico transparente como um saco de sanduíche.
    7. Prepare a mistura de quimioluminescência (ECL) de enchanced seguindo as instruções do fabricante. Use uma pipeta P-1000 para cobrir a membrana com a mistura de ECL, fechar a bainha e incubar as tiras de membrana com a mistura no escuro à temperatura ambiente por 1-2 min.
    8. Lugar da bainha da membrana em uma plataforma digital de imagem. Uso da quimioluminescência e deteção de marcador colorimétrico para capturar várias exposições da membrana.
      Nota: Tempos de exposição irá variar com base na quantidade de proteína carregada, abundância de proteína alvo, afinidade do anticorpo etc começar com uma exposição automática (normalmente alguns segundos) e teste de tempos de exposição acima e abaixo por incrementos de alguns segundos.
    9. Empiricamente, ou usando o software de análise de imagem, determinar qual linha celular expressa mais proteína do alvo.
  3. Encontre a gama dinâmica linear de cada anticorpo primário usando uma diluição de série.
    1. Executar etapas 3.2.1-3.2.8 usando uma série de diluições de série da linha celular que expressa a maior concentração da proteína alvo (identificada na etapa 3.2.9).
    2. Use o software de análise de imagem como o ImageJ para realizar densitometria sobre as imagens da exposição.
      1. Por exemplo, usando o ImageJ, use a ferramenta de Seleção retangular para selecionar a primeira pista do gel para quantificar. Ir para analisar | Géis | Selecione a primeira pista. Use o mouse para mover o retângulo resultante para a próxima pista. Ir para analisar | Géis | Selecione próximo Lane. Repetidamente mover o retângulo para a pista ao lado e selecione a pista para o restante das pistas.
      2. Ir para analisar | Géis | Plotar rotas. Use a ferramenta de Linha reta para desenhar linhas entre as bases de cada pico para remover o ruído de fundo. Use a ferramenta varinha para selecionar cada pico e recolher a densidade de cada pico, doravante referida como a intensidade da banda, da janela de resultados .
    3. Use a densitometria saída para criar um gráfico de dispersão da banda intensidade versus a quantidade de proteína total carregado para cada anticorpo primário. Usando uma linha de melhor ajuste e inspeção visual, determine a localização (escala de intensidade) da gama dinâmica linear de cada anticorpo.
    4. Escolha uma concentração de proteína que gera um valor na extremidade superior do intervalo linear para ser a concentração de seguir em frente com todas as linhas de célula.
      Nota: Uma vez que esta concentração é abaixo do nível de saturação na linha de celular com a maior quantidade desta proteína, não deve haver nenhum perigo de sobre expondo as bandas para as outras linhas de célula.
  4. Executar um immunoblot usando a concentração de proteína escolhida na etapa 3.3.4 para todas as linhas de célula e repita etapas 3.2.1-3.2.8.
    1. Realize densitometria nos exames Digitas como na etapa 3.3.2. Escolha as imagens de exposições que geram sinais dentro das escalas lineares para cada anticorpo identificado na etapa 3.3.3.
    2. Usando os sinais de intensidade de banda partir da 3.4.1 os riscos ideais, calcule a relação de intensidade de banda de proteína alvo de intensidade de banda controle para cada linha de célula de carga. Esses valores de relação indicam a abundância relativa da proteína alvo de interesse.
    3. Executar um teste de correlação de Pearson (pode ser feito usando um pacote de software estatístico) para correlacionar os valores obtidos da análise de imagem do se coloração (passo 2.2) àqueles obtidos de immunoblotting (etapa 3.4.2).

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Resultados

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Este protocolo foi utilizado para confirmar a capacidade de se determinar a quantidade relativa da proteína anti apoptótica Bcl-2 em linha de celular feita em blocos de tecido FFPE. Bcl-2 quantificando seletivamente nas células cancerosas pode elucidar mecanismos oncogênicos e pode ser útil no diagnóstico patológico e em informar as decisões de manejo clínico24. Mais especificamente, Bcl-2 desempenha um papel no desenvolvimento de linfócitos adequado, e a sua expre...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos um método que faz uso de immunoblotting quantitativa (IB) para demonstrar a utilidade da imunofluorescência (IF) para determinar a abundância relativa de uma proteína do alvo em amostras de tecido FFPE. Métodos de quantificação da proteína atual são limitados pela sua natureza categórica, como cromogênico IHC32,, ou pela necessidade de homogeneizar as amostras, impedindo a investigação sobre as populações de estrutura e célula de amostra, tais como co...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi parcialmente financiado pela Fredrick Banting e Charles Best Canadá Graduate Scholarship (A.M.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
697DSMZACC 42Linha celular
JeKo-1ATCCCRL-3006Linha celular
JurkatATCCTIB-152Linha celular
RCH-ACVDSMZACC 548Linha celular
Granta-519DSMZACC 342Linha celular
REHDSMZACC 22Linha celular
RajiLinha celular ATCCCCL-86
HeLaLinha celular ATCCCCL-2
Solução de tripsina / EDTAInvitrogenR001100Para separar células adesivas
Soro bovino fetal (FBS)Wisent Inc.81150Para neutralizar a tripsina
Neutro TamponadoFormalina Protocolo245-684Para fixação de pellets de células
UltraPure baixo ponto de fusão agaroseInvitrogen15517-022Para pellets de células de fundição
Anticorpo monoclonal de camundongo Bcl-2 anti-humano, clone 124Dako (Agilent)cat#: M088729-2, RRID: 2064429Para detectar Bcl-2 por imunofluorescência e immunoblot (lote#:  00095786
Ventana Discovery XTRoche-Paraautomação da coloração de imunofluorescência
Sistema EnVision+ - Polímero marcado com HRP (anti-mouse)Dako (Agilent)K4000Para amplificação de sinal de imunofluorescência
Sistema EnVision+ - Polímero marcado com HRP (anti-coelho)Dako (Agilent)K4002Para amplificação de sinal de imunofluorescência
Cianina 5 reagente de tiramidaPerkin ElmerNEL745001KTPara amplificação de sinal de imunofluorescência
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-Paravisualizar lâminas digitalizadas
Software de análise de imagem HALOIndica Labs-Paraquantificação de inibidores de protease de imunofluorescência
(coquetel de inibidores de protease Halt, 100X)Thermo Scientific1862209Para adicionar a Tampão RIPA
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)BioShopEDT001Para tampão RIPA
NP-40BDH Limited56009Para tampão RIPA
Desoxicolato de sódioSigma-AldrichD6750Para tampão RIPA
GlicerolFisherBiotechBP229Para tampão Laemlli
Azul de bromofenolBioShopBRO777Para tampão Laemlli
Ditiotreitol (DTT)Bio-Rad161-0611Para tampão Laemlli
Albumina de soro bovino (BSA)BioShopALB001Para lavagens de immunoblot
Escada de proteína (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374Para gel de proteína em execução
Papel de filtro (papel de borrão extra grosso)Bio-Rad1703969Para blotting transferência
Membrana de nitroceluloseBio-Rad162-0115Para transferência de transferência
Trans-blot SD célula de transferência semi-secaBio-Rad1703940Para transferência semi-seca
Leite em pó desnatado (leite em pó desnatado)Tecnologia de sinalização celular9999SPara bloqueio
de tampão Tween 20BioShopTWN510Para tampão de lavagem
GAPDH coelho anticorpo monoclonalEpitomics2251-1Anticorpo primário da proteína de controle (lote#: YE101901C)
Anticorpo anti-camundongo IgG de cabra (conjugado com HRP)abcamcat#: ab6789, RRID: AB_955439Anticorpo secundário para imunotransferência
Anticorpo IgG de cabra anti-coelho (conjugado com HRP)abcamcat#: ab6721, RRID: AB_955447Anticorpo secundário para immunoblot (lote#: GR3192725-5)
Clarity Western Substratos ECLBio-Rad1705060Para detecção de sinal de immunoblot
Amersham Imager 600GE Healthcare Life Sciences29083461Para detecção de sinal de immunoblot
SoftwareImageJ Freeware, NIH-Paraanálise de densitometria

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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