Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Визуализации клеточных гиббереллин уровни, используя энергию резонанса Фёрстер NlsGPS1 передачи биосенсора (ЛАДА)

Published: January 12, 2019 doi: 10.3791/58739
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sainsbury Laboratory, University of Cambridge

Summary

Гиббереллин восприятие датчик 1 (GPS1) является первым Фёрстер резонанс энергии на основе передачи биосенсора для измерения клеточном уровнях гиббереллин фитогормонов с высоким разрешением пространственно-временных. Этот протокол сообщает о метод визуализации и количественной оценке клеточных гиббереллин уровней с помощью биосенсора генетически закодированный nlsGPS1 арабидопсиса гипокотиля и корень советы.

Abstract

Гиббереллин фитогормона (GA) является небольшой, мобильные сигнальной молекулы, которая играет ключевую роль в прорастания семян, сотовой удлинение и развития переходы в растениях. Гиббереллин восприятие датчик 1 (GPS1) является первой передачи энергии резонанса Фёрстер (ЛАДА)-на основе биосенсор, что позволяет мониторинг клеточного уровня га в естественных условиях. Путем измерения флуоресценции выбросов соотношение ядерных локализован GPS1 (nlsGPS1), пространственно-временных карт эндогенно и экзогенно предоставленного GA градиентов в различных тканей типа возможна на клеточном уровне. Этот протокол описывает как изображение nlsGPS1 коэффициентов выбросов в три примера экспериментов: стационарном, лечения экзогенных до и после гиббереллин A4 (4га) и через время курс лечения. Мы также предоставляют методы для анализа nlsGPS1 коэффициенты выбросов с использованием коммерческих трехмерной (3-D) Микрофотография визуализации и анализа программного обеспечения и Фиджи и объяснить ограничения и вероятно ловушки с использованием nlsGPS1 для количественного определения уровней гиббереллин.

Introduction

Растительные гормоны играют основополагающую роль в рост и развитие растений. Эти небольшие, мобильные сигнальных молекул, обычно регулируются на нескольких уровнях, например, биосинтез, катаболизм и краткосрочных и долгосрочных междугородной перевозки1,2,3,4. Понимание гормон сигнальные пути и ниже по течению транскрипционный анализ ответов обострило годами. Однако чтобы связать различных клеточных реакций гормон сигнальных путей регулирования материалов, направляя гормон дистрибутивов, мы требуем пространственно-временных количественную оценку уровня гормонов на клеточном уровне. На основе ладу биодатчики, которые может обнаружить фитогормонов могут продвигать ученых возможность количественного определения уровня гормонов на клеточном уровне. На основе ладу биодатчики состоят из ладу пары (доноров и акцепторов флуоресцентные белки) связан с сенсорными домен, связывает конкретные лигандом или реагирует на биологических раздражитель. Для малых молекул биодатчики Связывание лиганда вызывает конформационные изменения сенсорные домена, что приводит к изменению расстояния и/или ориентации между двумя флуоресцентные белки ладу пары. Анализ ratiometric ладу биосенсора достигается путем захватывающие донора и измерения флуоресценции выбросов соотношение акцептора доноров5,6. Связывание лиганда является обнаруживаемой как изменение в этом выбросов соотношение7.

Мы недавно разработал на основе ладу биосенсор для завода гормона GA. газ класса гормонов, которые могут способствовать прорастания семян, сотовой удлинение и развития переход от вегетативной стадии цветения. Биосенсор nlsGPS1 ядерной локализации и обеспечивает пространственно-временных понимание динамики GA в тканях различных растений. В клетках Arabidopsis GA связывается Растворимые рецепторы, зависящие от гиббереллин карлик (GID), и комплекс вызывает деградацию ДЕЛЛА белков, которые действуют как негативные регуляторы сигнализации2га. GA-сенсорные домен nlsGPS1 состоит из Arabidopsis GA рецептора (AtGID1C) связан с 74-амино кислоты усечение ДЕЛЛА белка (AtGAI) и ладу пары, состоящей из более димеризации варианты Cerulean как доноров флуоресцентный белок и Афродита (кодон диверсифицированная Венера) как акцептор флуоресцентный белок8. NlsGPS1 биодатчик является датчик высокоспецифичные биологически GA4 (Kd = 24 Нм для GA4) и он может быть использован в различных тканей типы сопоставить и количественно определить GA градиентов. Чтобы избежать неправильного толкования Arabidopsis GA уровней в естественных условиях, мы разработали также свертывать вариант nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) для использования в качестве отрицательного контроля. NlsGPS1-NR белок несет мутации в кармане GA-привязки, которые нарушают связывание GA и мутации в ДЕЛЛА белков, которые нарушают взаимодействие с GID рецептор белков7,9. Шаблоны коэффициент выбросов или изменения наблюдаются в nlsGPS1 и nlsGPS1-NR линии можно считать артефакты, непосредственно не связанные с событиями GA-привязки. Важно также отметить, что быстро nlsGPS1 привязки для GA4 не обратима, и поэтому, сотовой nlsGPS1 коэффициенты выбросов следует толковать как представляющие самую высокую концентрацию последние GA данного ядра, а не в реальном времени стационарном уровнях. Как следствие снижение уровней GA возможен анализ не с nlsGPS1.

Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования nlsGPS1 биосенсор в клетках модели растение Arabidopsis, используя конфокальный подходы на основе изображений в высоком разрешении. Протокол предоставляет информацию о тепловизионных корни растений и гипокотиля как в стационарном, так и через время курсы. NlsGPS1 датчик потенциально могут быть использованы различные типы тканей, а также различных видов растений, чтобы сопоставить и количественно определить GA дистрибутивов.

Protocol

1. Подготовка

  1. Подготовьте ½ фотосинтетическую и Скуг агар рН 5,7 с не сахарозы (1 Л).
    1. Растворите 2,2 g фотосинтетическую и Скуг (МС) базальной среды в 950 мл ультрачистая вода. Отрегулируйте пэ-аш до 5,7 с 5 М Кох.
    2. Составляют решение окончательное объемом 1 Л с ультрачистая вода. Разделите его на две 500 мл бутылки, каждый содержащих агар завод 1%. Обработайте автоклавированием при температуре 121 ° C в течение 20 мин.
  2. Подготовьте ¼ MS жидкости при рН 5,7 с не сахарозы (1 Л).
    1. Растворите 1.1 g МС в 950 мл ультрачистая вода. Отрегулируйте пэ-аш до 5,7 с 5 М Кох. Составляют решение окончательное объемом 1 Л с ультрачистая вода. Разделите его на две 500 мл бутылки. Обработайте автоклавированием при температуре 121 ° C в течение 20 мин.
  3. Подготовка4га.
    1. Растворите GA4 в этанол 70% сделать окончательный концентрации 100 мм GA4 акций.
    2. Чтобы приготовить рабочий раствор, разбавить фондовой4 га до 0,1 – 1 мкм в ¼ MS жидкости рН 5,7.

2. рост растений

  1. Стерилизуйте Arabidopsis семена.
    1. Работа с использованием химических Худ. Аликвота семена (примерно 200 семена) в 2 мл microcentrifuge трубы. Используйте маркер с хлор стойкие чернила и поместите трубки с открытой крышки стерилизации судна (большое поле, которое может быть закрыты).
    2. Поместите стакан 250 мл, содержащие 50 мл сверхчистой воды и 50 мл раствора гипохлорита натрия внутри судна стерилизации.
    3. Добавьте 3 мл концентрированной соляной кислоты (HCl) в стакан. Сразу же печать судна и разрешить стерилизации хлоргаза для 6 – 16 ч.
    4. После вскрытия судна, закройте крышки всех трубок microcentrifuge в стойку семян. Стерилизованные семена можно хранить в сухом вплоть до обшивки.
  2. Сеять примерно 20 стерилизованные Arabidopsis семена на ½ MS агар квадратные плиты. Печать пластины пористые хирургическая лента и обернуть их алюминиевой фольгой. Инкубируйте их в 4 ° C для 1-3 дней для стратификации.
  3. Для корневого изображений, передачи пластины роста палату в вертикальном положении в течение 3 дней с соблюдением следующих условий роста: Лонг день условия (Л.Д., 16 ч света/8 h темного); 120 µmol⋅m-2s-1 интенсивность света; Температура 22 ° C (во время свет цикла) или 18 ° C (во время темных цикла), 65% относительная влажность (RH).
  4. Для темного вырос гипокотиля: передачи пластины роста камере для светового импульса 1-4 ч для синхронизации всхожесть. Оберните пластины с алюминиевой фольгой и поместите их в рост палата в вертикальном положении в течение 3 дней.

3. Пробоподготовка

  1. Измерения установившегося (Рисунок 1A)
    1. На чистой микроскопа 50 мкл ¼ MS жидкости (теперь называется как макет решение). Аккуратно передачи саженцев, выражая nlsGPS1 от плиты к слайду.
    2. Возьмите чистую coverslip и месте капля вакуумных смазка на каждом углу coverslip. Осторожно поместите coverslip саженцев и тщательно добавить дополнительные макеты решение удалить все пузырьки воздуха.
  2. 4 лечение GA: химический обмен эксперимент (Рисунок 1B).
    1. Перед началом лечения4 га, используйте 20 мл шприц, заполнены с вакуумной смазка (прилагается к наконечник пипетки) нарисовать прямоугольник (длина: 3,5 см, высота: 2,5 см) с равномерным слоем вакуумных смазки на слайде чистого стекла (рис. 1B). Чтобы разрешить для тонкой линии вакуумной смазка, наконечник пипетки следует сократить иметь отверстие 1 мм в диаметре.
    2. 50 мкл фиктивного решения на стеклянное скольжение. С чистые пинцет выбрать nlsGPS1 саженцев и осторожно поместите их на макет решение. Чтобы предотвратить любые повреждения, передачи саженцев, поддерживая нижние двулопастной без цепляния сец с щипцами.
    3. Возьмите чистую coverslip и месте капля вакуумных смазка на каждом углу coverslip. С помощью щипцов, место coverslip в центре прямоугольника, вакуумные смазка. Теперь coverslip герметизируется с обеих сторон, соответствующие длинный краев прямоугольника вакуумные смазка.
    4. Аккуратно добавьте дополнительные макеты решение заполнить водохранилище и удалить любые воздушные пузыри в водохранилище не беспокоя seedling(s) внутри.
    5. Получение изображений перед началом лечения4 га с помощью конфокального микроскопа. Следуйте инструкциям, как описано в разделе 4 настоящего Протокола.
    6. Для лечения4 га удалите из стадии конфокального микроскопа. Установите таймер на 20 мин.
    7. После запуска таймера, Обмен буферного раствора с ¼ MS жидкости, содержащие 1 мкм GA4. Добавьте решение4 га (около 50 мкл) с левой стороны coverslip и удалите предыдущий (макет) решение с правой стороны. Держите на обмене решение заменить макет решение полностью, который занимает приблизительно 10 мин (Рисунок 1B).
    8. Место стеклянное скольжение назад на микроскопа. Ждать еще 10 мин до приобретения изображения после га.
  3. Настройка времени курса для ткани интерес
    Примечание: Ткани интерес может быть, например, гипокотиля или корни. Мы регулярно выполнять время курсы для изображений nlsGPS1 биосенсора с использованием коммерческих перфузии системы (рис. 1 c, смотрите Таблицу материалы) или7,,10RootChip11.
    1. Добавить 200 мкл фиктивного решения центр перфузии канала липкое-слайда (см. Таблицу материалы). Аккуратно выбрать nlsGPS1 саженцев и разместить их на решение макет в липкое слайд.
    2. С помощью щипцов, мягко место coverslip стекла и, используя зад щипцы, слегка нажмите на внешних краях coverslip так, что она образует прочную связь с липким материалом на периферии липкое слайд.
    3. Используя два локтя Luer разъемы (с внутренним диаметром 0,8 мм [ID]) и Силиконовая трубка (с идентификатором 0,8 мм), подключите липкой слайд-20 мл шприц и выход контейнер, сбор отток решения. Разъем замка Luer (с идентификатором 0,8 мм) используется для подключения шприц к Силиконовая трубка.
    4. Аккуратно нажмите шприц, содержащий макет решение вручную пусть достаточно раствор проходит через камеру так, что нет пузырьков воздуха оставили в камере. Место и удерживайте шприц на программируемых шприцевой насос.
    5. Установите параметры насоса для шприц используется (т.е.., диаметр и объем) наряду с скорость потока в соответствии с руководством, с насосом.
      Примечание: В этом протоколе скорость потока 1 – 3 мл/ч была использована, и это может быть изменено в соответствии с требованиями экспериментальной. Инициировать время курс, начав насоса.
    6. Для GA4 лечения во время курса (рис. 1 c) остановить перфузии, приостановка насоса и изменить шприц с новой один содержащие ¼ MS жидкостью дополнена GA4. Продолжайте с конфокальная томография, как показано в следующем разделе.

4. микроскопия

Примечание: Мы выполняем Конфокальная лазерная микроскопия.

  1. Получение изображений с помощью Конфокальный микроскоп оснащены лазерами для выполнения визуализации ладу.
    Примечание: Для nlsGPS1 отражаются варианты голубой флуоресцентный белок (СЛТ) и желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП). В этом протоколе коммерческие микроскопы (см. Таблицу материалы, перечисленные как Микроскоп 1 и 2) используются с 10 x или 20 x сухой 0,70 гармоническое соединение план АПО целей.
  2. Для Микроскоп 1, использование 448 Нм и 514 Нм длины волны лазеров для возбуждения CFP и рекламы ЯФП, соответственно. Приобрести последовательных сканирований. Установите детекторы (например, HyD SMD) для обнаружения 460 – 500 Нм для CFP (доноров выбросов) и 525 – 560 Нм для рекламы ЯФП (ладу выбросов) после возбуждения СЛП. С помощью второй последовательности, установите детектор для обнаружения 525 – 560 Нм для рекламы ЯФП (рекламы ЯФП выбросов) после возбуждения рекламы ЯФП.
    Примечание: Этот рекламы ЯФП флуоресценции используется элемент управления выражения, а также в сегментации ядра, для создания поверхности с помощью коммерческих Микрофотография 3-D визуализации и анализа программного обеспечения.
  3. Для Микроскоп 2, использование 440 Нм и 514 Нм волны лазера линии для возбуждения CFP и рекламы ЯФП, соответственно. Приобрести два трека. Для дорожки 1 Установите детекторы (например,., ChS) для обнаружения 464 – 500 Нм для CFP (доноров выбросов) и 526 – 562 Нм для рекламы ЯФП (ладу выбросов) после возбуждения СЛП. Для отслеживания 2, установить детектор для обнаружения 526 – 562 Нм для рекламы ЯФП (рекламы ЯФП выбросов) после возбуждения рекламы ЯФП.
    Примечание: Этот рекламы ЯФП флуоресценции используется элемент управления выражения, а также в сегментации ядер, для создания поверхностей в 3-D визуализации и анализа программного обеспечения.
  4. Получение изображений с помощью формата 512 x 512 пикселей и разрешением 12 бит.
  5. Коэффициент усиления необходимо скорректировать эмпирически определяется значение, которое позволяет хороший сигнал пока не насыщая пикселей. Выигрыш не следует менять между CFP и ладу выбросов над эксперимент. Установите обскуры 1 блок Эйри (АС). Место IBIDI липкое слайд на стадии конфокального микроскопа и продолжите изображений показано, как ранее.
  6. В Микроскоп 1 программного обеспечения в то время как активного живой сканирования, используют свечение над/под расположен на верхней левой стороне экрана изображения для определения недоэкспозицией и насыщенности региона интерес. В Микроскоп 2 программного обеспечения используйте Индикатор диапазона , расположенный на нижней стороне изображение экрана для определения недоэкспозицией и насыщенности региона интерес. Для любого анализа количественных изображения должна быть не точки насыщения.
  7. Установка z стеки с размером шаг 1 мкм. Размер шага может быть уменьшена для увеличения z резолюции или увеличить для увеличения скорости приобретения или увеличить количество позиций/образцы, которые могут быть образы. Для автоматизированной время курс установите время наряду с z стеки (xyzt режим на вкладке режим приобретения) для получения изображения промежутки времени.

5. изображения анализ с использованием Фиджи

Примечание: С помощью ImageJ (Фиджи) возможна процесс визуализации данных и производить двухмерных изображений (2-D) коэффициента выбросов nlsGPS1 в проростках арабидопсиса . Примеры изображений см. рисунок 2A, 2 C, 2E, 2 Gи 3А. В ImageJ можно найти каждой команды этого протокола, с помощью функции поиска. Нажмите пробел и L на клавиатуре компьютера. Откроется новое окно; Введите необходимые команды в поле поиска.

  1. Перетащите файл (файлы .lif или теперь) в Фиджи (изображение J) и откройте изображения как гипер стека.
  2. В главном меню выберите изображение > стека > Z проекта и выберите сумму ломтиками захватить все пикселы, а не только яркие пикселы, как Макс проекции.
  3. В главном меню выберите пункт процесс > вычитание фона и набор радиусу качения шарика в 50 пикселей. Снимите все другие варианты и обрабатывать все три изображения. Это действие удаляет фон с использованием алгоритма «плавающий шар».
    Примечание: 50 пикселей определялась эмпирически включить ядер переднего плана.
  4. В главном меню выберите изображение > Цвет > разделить каналы. Три новых windows откроет: C1-SUM (CFP канал); C2-сумма (Канал ладу) и C3-SUM (рекламы ЯФП канал).
  5. Выберите окно C3-суммы и в главном меню выберите пункт процесс > фильтры > Gaussian Blur и применить размытие Gaussian Blur 1 для уменьшения шума изображения.
  6. В главном меню выберите изображение > Настройка > Яркость/контрастность и выберите Авто.
  7. В главном меню выберите пункт процесс > Повысить контрасти установить насыщенных = 0,35.
  8. В главном меню выберите изображение > тип > 8-бит и преобразовать стеки в 8-битного изображения.
  9. В главном меню выберите изображение > Настройка > Авто-местное порог. В Авто-местное порог, выберите следующие параметры: Phansalkar метод, радиус = 15, параметр 1 = 0, параметр 2 = 0и белый стека. В этом шаге стеки рекламы ЯФП используются сделать бинарный маску.
  10. Выберите окно C2-суммы и в главном меню выберите пункт процесс > фильтры > Gaussian Blur и применить размытие Gaussian Blur 1.
  11. Выберите окно C1-суммы и в главном меню выберите пункт процесс > фильтры > Gaussian Blur и применить размытие Gaussian Blur 1.
  12. Для создания стека коэффициент выбросов из двух каналов, в главном меню выберите пункт процесс > Калькулятор изображения. В новом окне, которое появится, выберите C2-сумма как изображение 1, выберите разделить как оператор и выберите сумму C1 как изображение 2.
  13. Убедитесь в том выбрать создать новое окно и 32-битный формат. Именованные Результат C2-суммапоявится новое окно.
  14. В главном меню выберите изображение > таблицы подстановки > LUT 16_colors.
  15. В главном меню выберите пункт процесс > Калькулятор изображения. В новом окне, которое появится, выберите Результат C2-сумма как изображение 1, выберите умножить как оператор и выберите C3-сумма как изображения 2. В этот шаг с рекламы ЯФП/CFP стек, чтобы показать только те пикселы, которые присутствуют в канале управления рекламы ЯФП умножается рекламы ЯФП двоичные маска.
  16. В главном меню выберите пункт процесс > математика > разделить и задайте значение 255. В новом окне, которое открывается выберите Да для анализа всех изображений в стеке. Новый образ будет отображаться именованный Результат результат C2-сумма.
  17. В главном меню выберите изображение > Настройка > Яркость/контрастность и выберите Авто.
  18. В главном меню выберите пункт процесс > Повысить контраст, а затем выберите типа насыщенных = 0,35.
  19. В главном меню выберите изображение > Настройка > Яркость/контрасти установить минимальное и максимальное значения для захвата GA распределения. Необязательный шаг: в главном меню выберите анализировать > инструменты > Калибровка бар и бар Показать LUT-калибровкии сохранить Результат результат C2-сумма в формате .tiff.
  20. Для получения значений выбросов коэффициенты, в главном меню выберите анализировать > задать измерения и выберите означает серый значение и стандартное отклонение.
  21. Выберите прямоугольник на панели инструментов и нарисуйте региона интерес (ROI). В главном меню выберите анализировать > мера. Новое окно сообщит среднее значение из выбранных ROI.
  22. Скопируйте и вставьте полученные значения в таблицу программного обеспечения (например, Excel или OriginPro) и сделать гистограммы для до и после лечения4 GA эксперимент или линейный график курса время экспериментировать.

6. изображения анализ с использованием 3-D визуализации и анализа программного обеспечения

Примечание: Преимущество использования выбранного программного обеспечения (см. Таблицу материалов) является сегмент объектов (например, ядра) и создание трехмерных изображений из конфокальный z стека. Примеры изображений см. Рисунок 2B, 2D, 2F, 2 Hи 3B.

  1. Открытое программное обеспечение и импортировать файл (.lif или теперь файлы).
  2. Сегмент ядер на основе элемента управления рекламы ЯФП выбросов канала с помощью мастера поверхностей. Сегментирована объектов называются «поверхность». Этот шаг Сегментация позволяет анализ всех вокселей в ядро как один объект устраняя фон от вокселей вне ядра.
  3. В мастере поверхностейустановите вычитание фона (локальный контраст) до 3 мкм и порога по умолчанию. Маска CFP выбросов (доноров возбуждения доноров выбросов [DxDm]) и каналы выбросов (доноров возбуждения акцептора выбросов [DxAm]) ладу, основанные на поверхности, созданные с помощью рекламы ЯФП выбросов (акцептор возбуждения акцептора выбросов [AxAm]) канала.
  4. Используйте расширение XT означает коэффициент интенсивности для вычисления соотношения доноров возбуждения акцептора выбросов разделены доноров возбуждения доноров выбросов (DxAm/DxDm) между значениями средней интенсивности индивидуальных поверхностей в двух каналов.
    Примечание: Это расширение доступно онлайн для скачивания.
  5. Чтобы цвета отдельных поверхности с nlsGPS1 коэффициент выбросов, выберите цветовое кодирование с статистики, которая представлена в виде значка колесо цвета. Выберите тип статистики означает коэффициент интенсивности .
  6. Экспортируйте соотношения отдельных значений из таблицы, которая находится под значком статистики .
  7. Скопируйте и вставьте значения в таблицу и сделать гистограмму для до и после лечения экспериментов GA4 или линейный график время курс экспериментов.

7. Статистический анализ

Примечание: Смотрите Рисунок 3D beeswarm и поле участок nlsGPS1 коэффициентов выбросов.

  1. Открытое программное обеспечение и вставьте выбросов соотношение ядер поверхностей как Y столбцы.
  2. Выберите столбцы интерес и Статистика > Статистика описание > испытания нормальности знать ли образцы нормально распределены. Запустите тест нормальности и новое окно будет открыто и сообщить о результатах.
  3. Если образцы обычно распределяются, используйте t-теста как статистический тест. Выберите статистические данные > Проверка гипотез > Двухвыборочный t тест на строках и запустить t-теста.
  4. Если образцы не распространяется правило, выберите Статистика > Проверка статистических гипотез > двухвыборочный тест для дисперсии , чтобы знать, является ли разница между образцами не значительно отличаются.
  5. Если разница не значительно отличается, используйте тест Манна-Уитни U как статистический тест. Выберите Статистика > Непараметрический тест > тест Манна-Уитни и запустить тест.
  6. Если отклонение значительно отличается, используйте Крускала-Уоллиса дисперсионного анализа тест как статистический тест. Выберите Статистика > Непараметрический тест > Крускала-Уоллиса дисперсионного анализа протестировать и запустить тест.

Representative Results

С помощью nlsGPS1, это можно измерить сотовой GA4 уровней в тканях поддаются флуоресценции изображений, включая корневой советы и темного вырос гипокотиля (рис. 2). В корне Arabidopsis градиент коэффициент выбросов nlsGPS1 свидетельствует о низких уровней GA в зонах меристемовые и Отдела и высокий уровень GA в конце удлинение зоне (рис. 2A и 2B). В отличие от градиента коэффициент выбросов не наблюдалось в nlsGPS1-NR корни, о том, что эндогенного GA градиент не артефакт (рис. 2 c и 2D). Градиент коэффициент выбросов nlsGPS1 также была сформирована в темного вырос гипокотиля, с низким уровнем семядоли и апикального крюк и высокого уровня в регионе быстро elongating базальную гипокотиля (Рисунок 2E и 2F). В отличие от градиента коэффициент выбросов не наблюдалось в nlsGPS1-NR гипокотиля (Рисунок 2 g и 2 H). В обоих Arabidopsis корни и темного вырос гипокотиля клетки эндогенного GA накопления коррелирует с сотовой удлинение курса.

Кроме того экзогенно предоставленного GA4 накапливается преимущественно в зоне удлинение, по сравнению с Отделом зоны Arabidopsis корня (рис. 3), указав, что nlsGPS1 может использоваться для изучения эндогенных и экзогенных GA кучность.

Во время курса экспериментов, nlsGPS1 саженцы были размещены в камерах липкие слайд и увлажненную с ¼ MS жидкость, после лечения с 0,1 мкм GA4 за 30 минут. Видео показывает ускоренное накопление экзогенных GA4 в корневой зоне удлинение, по сравнению с Отделом зоны (видео 1).

Figure 1
Рисунок 1: Пробоподготовка для конфокальная томография. Эти панели показывают схематическое представление Пробоподготовка для (A) статичных эксперимент, (B) до и после экзогенных GA4 обработок и (C) эксперимент курс время лечения с помощью липкие слайды (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: GA градиент Arabidopsis корни и темного вырос гипокотиля. Двухмерные изображения nlsGPS1 (A) и (C) nlsGPS1-NR корни были проанализированы с использованием программного обеспечения ImageJ и трехмерные изображения nlsGPS1 (B) и (D) nlsGPS1-NR были проанализированы с использованием коммерческих трехмерных программное обеспечение для анализа изображения. Оба анализы показали эндогенного GA4 градиента в проростках Arabidopsis корни. Двухмерные изображения nlsGPS1 (E) и (G) nlsGPS1-NR темного вырос гипокотиля были проанализированы с использованием программного обеспечения ImageJ и трехмерные изображения nlsGPS1 (F) и (H) nlsGPS1-NR были проанализированы с использованием программное обеспечение для анализа коммерческих трехмерных изображений. Оба анализы показали эндогенного GA4 градиента в гипокотиля темного вырос. LUT бар показывает ложные окраска nlsGPS1 коэффициентов выбросов. Рекламы ЯФП изображения отображаются как выражение элементов управления. Гипокотиля изображения были приобретены с помощью две стадии позиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: экзогенные GA градиент в корнях. Первые две панели шоу (A) двумерные и трехмерные изображения (B) и nlsGPS1 корня до 20 мин после лечения экзогенных GA4 (1 мкм). Рекламы ЯФП изображения отображаются как выражение элементов управления. Показать последние две панели (C) среднее и стандартное отклонение и (D) beeswarm и поле сюжет nlsGPS1 коэффициентов выбросов для ядер удлинение зоны (район, который определен с белой рамкой). В зоне удлинения, коэффициент выбросов nlsGPS1 был значительно выше после лечения4 га (U Манна-Уитни тест, *** P-значение < 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Video 1
Видео 1: перфузии эксперимент nlsGPS1 корня с помощью липкой слайд. Это видео показывает трехмерные изображения nlsGPS1 увлажненную с ¼ MS жидкости и лечат 0,1 мкм GA4 за 30 минут. В ходе времени изображений была приобретена каждые 10 мин за 3 ч со следующими интервалами: 30 мин макет раствора (кадр t = 1, т = 2, t = 3), 30 мин лечения4 га (кадр t = 4, t = 5, t = 6), 2 h макет так устные (кадр t = 7 до t = 18) решение. До приобретения образец был увлажненную раствором макет для 2 h. пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Discussion

NlsGPS1 биосенсор на основе ладу GA обеспечивает количественный метод сообщать и измерить GA гормон градиенты в многоклеточные растения. На основе ладу Биодатчики можно количественно динамика с улучшенным разрешением пространственно-временных через прямое обнаружение по масс-спектрометрии и косвенные измерения transcriptional Репортеры или сигнализации белка деградация-методы на основе12, 13. Высоким разрешением сотовой изображений в различные типы тканей может дать значимые идеи в GA биологии и искры новых гипотез относительно регулирования и функции GA накоплений в рамках многоклеточных. Например мониторинг изменений в nlsGPS1 биосенсор конкретных GA биосинтетических, катаболических и мутанты транспорта, а также во время spatiotemporally индуцированных возмущений, может быть очень информативным для тестирования специально как GA градиенты, установлены в корень и корневой адрес ячейки ответы на GA градиентов. Датчик может использоваться в других видов модели и сельскохозяйственных культур для проверки сохранения механизмов, которые управляют GA-опосредованный контроль прорастания семян, сотовой удлинение и цветения.

Важнейшие шаги в ладу на основе изображений биосенсора nlsGPS1, что, 1 пикселей не должно быть насыщенным в ходе количественного анализа ладу, 2) визуализации параметров, таких как «детектор выгоды» должен оставаться постоянным для доноров выбросов (DxDm) и Акцептор поглощения выбросов (DxAm), 3) nlsGPS1-NR линии контроля должны использоваться для исключает артефактов и 4) образцы должны быть готовы к минимуму смещения фокуса-вопросам и изменения. Кроме того экологические условия, в которых выращиваются образцы имеют важное значение для управления, поскольку уровни GA чувствительны к условиям окружающей среды как свет продолжительность и интенсивность света14,,1516 ,17. Основным ограничением этого типа анализа является, что для изображения за счет увеличения шума, присущие ratiometric изображений требуется высокое соотношение сигнал шум. Таким образом, nlsGPS1 изображений не будет полезным для тканей и органов, которые не поддаются ratiometric микроскопии флуоресцирования с использованием голубой и желтый флуоресцентные белки — например, глубокие ткани, где плохо обнаруживаются флуоресцентные белки. С другой стороны ratiometric отсчетов предпочтительней часто intensiometric показаний, поскольку внутренний контроль является полезным правилом, артефакты, вытекающие из изменений в биосенсор выражение, стабильности, яркость или обнаруживаемости в данной ячейке, ткани , или условие. Например, ладу биосенсор томографии и анализа изображений также были использованы для изучения различных лигандов в различных тканях5,6,18,19,20,. Визуализации экспериментов и анализа изображений, сообщили здесь могут быть изменены с учетом новых изображений методов, таких как свет лист микроскопии, что может принести новые идеи в, например, более глубокие ткани типов корня.

Первого поколения nlsGPS1 биодатчик является высокоспецифичные датчик, который обеспечивает высоким разрешением карта GA градиентов, которые также могут сообщать о внутриклеточной увеличение после лечения экзогенных GA GA. Один из текущих ограничений nlsGPS1 является, что датчик не быстро обратимых и, таким образом, доклады не на стационарном уровнях га, но, вероятно, на последних GA ПДК в решении интерес. Точное текучести для датчика является также не известно и это, в сочетании с низкой обратимости, исключает возможность обнаружения эндогенного напевала га, которые, возможно, происходит в течение нескольких минут до нескольких часов в некоторые типы тканей. Важно также отметить, что nlsGPS1 имеет высокое сродство для GA4 (Kd = 24 Нм) по сравнению с другими формами GA (GA3 Kd= 240 Нм, GA1Kd = 110 Нм) при визуализации другие биоактивные газовые 7. будущих поколений биодатчиков GA могут быть спроектированы для повышения обратимость при сохранении высоким сродством или выставлять различные особенности различных прекурсоров, биоактивных, или catabolite газа. 

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа получила финансирование от Европейского Совета исследований (ERC) под исследовательской и инновационной программы Европейского союза по Horizon 2020 (Грант соглашение n ° 759282).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107735
Gibberellin A4 (GA4) Sigma G7276 dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach) Fisher S/5040 HSRA 064
Hydrogen cloride HCl Sigma 31434
Micropore tape 3M 1530-1
ibidi sticky-slide Ibidi 81128 Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide Ibidi 80168 Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides Ibidi 10812
Elbow Luer Connectors Ibidi 10802
silicone tubing Ibidi 108401
Luer Lock Connector Ibidi 10826
programmable syringe pump World Precision Instruments AL-1000
Vacuum grease Sigma 18405
Murashige and Skoog Basal Salts Duchefa M0221
Agar plant, 1 kg Melford P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick Fisher Scientific 12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm Fisher Scientific 12363138
Luer-slip Syringe 20 mL Fisher Scientific 10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape Fisher Scientific 12787597
Potassium Hydroxide, 500 g Sigma Aldrich 221473-500G-D
Absolute Ethanol Fisher Scientific 10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel Scientific Laboratory Supplies INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel Fisher Scientific 12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6 Ibidi 10829
Leica SP8 Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780 Confocal laser microscope 2
Imaris Bitplane 3D visualization and Analysis software
Fiji image analysis software
OriginPro Origin Lab Statistical Analysis Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
  2. Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
  3. Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
  4. Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
  5. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
  6. Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
  7. Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
  8. Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
  9. Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
  10. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
  11. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  12. Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
  13. Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
  14. Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
  15. De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
  16. Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
  17. Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
  18. Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  19. Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
  20. Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).

Tags

Биология развития проблема 143 растения биохимии биологических наук наук о жизни (Общие) гиббереллин фитогормона Spatiotemporal развития растений клетки роста биосенсор Лада
Визуализации клеточных гиббереллин уровни, используя энергию резонанса Фёрстер NlsGPS1 передачи биосенсора (ЛАДА)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rizza, A., Walia, A., Tang, B.,… More

Rizza, A., Walia, A., Tang, B., Jones, A. M. Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor. J. Vis. Exp. (143), e58739, doi:10.3791/58739 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter