SEM análise é um método eficaz para auxiliar na identificação de espécies ou discriminação fenotípica. Este protocolo descreve os métodos para examinar detalhes morfológicos específicos dos três tipos de representante dos organismos e seria amplamente aplicável para examinar características de muitos organismos e tipos de tecido.
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Artigo de método
Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microscopia eletrônica (SEM) é uma técnica amplamente disponível que foi aplicada para estudar espécimes biológicos variando entre proteínas individuais para as células, tecidos, organelas e organismos nem todo. Este protocolo centra-se em dois métodos de secagem químicos, hexamethyldisilazane (HMDS) e álcool t-butílico (TBA) e sua aplicação para geração de imagens de organismos procariotas e eucariotas, usando SEM. Neste artigo, descrevemos como corrigir, lavar, desidratar, secar, montar, salpicar o casaco e três tipos de organismos de imagem: cianobactérias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. e um desconhecido SP.), dois Ciliophora do género Monomorphina (M. aenigmatica e M. pseudopyrum) e a mosca da fruta (Drosophila melanogaster). O propósito do presente protocolo é descrever um método rápido, barato e simples para obter informações detalhadas sobre a estrutura, tamanho e características de superfície das amostras que podem ser amplamente aplicadas a uma grande variedade de organismos, para morfológica avaliação. Conclusão bem-sucedida do presente protocolo permitirá que os outros a usar SEM Visualizar amostras aplicando essas técnicas a seu sistema.
Introdução
Um microscópio eletrônico de varredura (MEV) utiliza um feixe focalizado de elétrons de alta energia para gerar uma imagem de elétrons secundários que mostra a morfologia e topografia de uma amostra de1. SEM pode ser usado para determinar diretamente o tamanho físico de uma amostra, a estrutura de superfície e a forma tridimensional e oferece maior resolução e maior profundidade de campo em comparação com microscopia de luz. Outra forma de (EM) microscopia eletrônica de varredura, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) usa focalizado de elétrons que passam através da amostra, gerando imagens com detalhes finos da estrutura interna. Enquant....
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Protocolo
1. preparação e fixação
- Prepare cianobactérias.
- Crescem as culturas unialgal em mídia de F/224,25 a uma temperatura de 28 ° C em um 14:10 h luz ciclo escuro. Transferência de cultura suficiente para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL tal que, após permitir 15 min resolver, a pelota bacteriana é cerca de 0,05 mL em tamanho. Remova a mídia e substituir com 1,5 mL de fixador (1,25% glutaraldeído, tampão de fosfato 0,1 M pH 7,0), gentilmente inverter várias vezes e incubar durante a noite a 4 ° C.
- Transferi as células fixas com uma pipeta de vidro para um equipamento de filtração....
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Resultados
Cianobactérias são um grupo de procariontes de organismos que são críticas para o global de carbono, oxigênio e nitrogênio ciclos28,29. Da cerca de 6000 espécies de cianobactérias30, mais tem uma bainha mucilaginoso que cobrem e conectar as células juntas e com outras estruturas de31, que junto com a forma, pode ser resolvido, microscopicamente,32. Tamanho da .......
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Discussão
Aqui descrevemos um protocolo usando SEM para obter informações detalhadas sobre características morfológicas externas dos três tipos de organismos que outros podem aplicar para examinar características de muitos tipos de organismos ou de tecidos. Dentro de cada etapa do protocolo, são os pontos potenciais de erro que possa surgir e são discutidas em detalhes abaixo.
Enquanto os volumes de fixador e lavagens dadas aqui são específicos, em geral, o fixador e lavagens devem ser 5-10x o volume da.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma concessão para a MLS e um prêmio de estudioso de verão para MAK do escritório de pesquisa e pós-graduação na Universidade de Michigan Central. Cianobactérias foram fornecidas pelo Zimba e laboratório de plâncton, parte do centro de estudos costeiros, Texas A & M University em Corpus Christi. Ciliophora foram fornecidas pelo laboratório de Triemer, Michigan State University.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ouro– paládio | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Adesivo condutor de prata 503 | Ciências de Microscopia Eletrônica | 12686-15 | |
| Membranas Gravadas a Trilha de Nucleporos Whatman; diâmetro 25 mm, tamanho do poro 8 μ m, membranas de policarbonato | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched; diâmetro 25 mm, tamanho do poro 0,8 μ m, policarbonato, preto | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diâmetro 25 mm, tamanho do poro 0,2 μ m, prato | Sigma | WHA110606 | |
| Fisher Scientific | 08-732-100 | ||
| pontas de montagem de alumínio (12 mm) | Pontas | 75210 | |
| (25 mm) | Guias adesivas Electronics Microscopy Sciences | 75186 | |
| Electron Microscopy Sciences | 76760 | ||
| abas adesivas de carbono condutoras | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Coleção de Cultura de Algas na Universidade do Texas em Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | Nenhum número de catálogo dado - veja link |
| AF6 media | Bigelow - Centro Nacional de Algas Marinhas e Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | Nenhum número de catálogo fornecido - veja o link |
| Meio de água do solo | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Éter terc-octilfenílico de polietilenoglicol (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Revestidor de pulverização catódica | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | Não Número de catálogo dado - veja link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2& gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE | A empresa não parece mais vender este modelo |
Referências
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
- Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
- Egerton, R. F.
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Reimpressões e permissões
