Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Resumo

Aqui nós apresentamos um romance método para a determinação de afinidades de ligação em equilíbrio e em solução com alta sensibilidade em larga escala. Isto melhora a análise quantitativa de ligação de DNA-fator de transcrição. O método baseia-se em medições de anisotropia de fluorescência automatizada em um sistema de liberação controlada.

Resumo

Quantificação precisa do fator da transcrição (TF)-interações DNA é essencial para a compreensão da regulação da expressão génica. Uma vez que as abordagens existentes sofrem limitações significativas, temos desenvolvido um novo método para a determinação de afinidades de ligação TF-DNA com alta sensibilidade em larga escala. O ensaio baseia-se no princípio de anisotropia (FA) da fluorescência estabelecida mas introduz melhorias técnicas importantes. Primeiro, podemos medir uma curva de titulação do competidor FA completa em um único poço incorporando TF e uma referência fluorescente etiquetada DNA em uma matriz do gel do agarose porosa. Sem rótulo oligómero de DNA é carregado em cima como um concorrente e, através da difusão, forma um gradiente espácio-temporais. O gradiente de FA resultante é então leia usando uma configuração de microscópio de epifluorescência personalizado. Esta configuração melhorada aumenta a sensibilidade de detecção de sinal de FA, permitindo uma ligação fraca e forte para confiantemente ser quantificadas, mesmo para moléculas com peso moleculares similares. Desta forma, podemos medir uma curva de titulação por alvéolo de uma placa multi bem, e através de um procedimento de montagem, podemos extrair a constante de dissociação absoluta (K_D) e a concentração da proteína ativa. Testando todas as variantes do único ponto de mutação de um determinado consenso sequência de vinculação, nós pode pesquisa a paisagem de especificidade de associação inteira de um TF, normalmente em um único prato. As matrizes de peso posição resultante (PWMs) superam os derivados de outros métodos na previsão na vivo ocupação TF. Aqui, apresentamos um guia detalhado para a implementação de quadril-FA em um microscópio fluorescente automatizado convencional e o pipeline de análise de dados.

Introdução

Dado o papel central dos fatores de transcrição (TFs) na regulação gênica, determinar suas preferências de ligação de forma quantitativa é de suma importância. Estudos seminais por von Hippel introduziram a noção de que regulamentar TFs rapidamente reconhecem o DNA, tal que sua ligação é bem descrita pelo equilíbrio termodinâmico, enquanto os eventos a jusante da RNA polimerase ao promotor de recrutamento são controlados por mais lenta cinética¹. Na vivo vinculação estudos recentes sugerem que esta imagem é provavelmente mais complexa^2,3; no entanto, estes pressupostos gerais servem como boas aproximações e apoiaram muitas abordagens computacionais para encontrar elementos cis-regulatórios e prever a expressão de sequências^4,5,6. Enquanto vinculação de equilíbrio, portanto, tem sido empregada com sucesso como um conceito, métodos atuais para determinar interações TF-DNA centrar-se na vinculação de especificidade e normalmente não diretamente medida afinidades de ligação em equilíbrio. A medição sistemática de vinculação TF-DNA representa um considerável desafio técnico, e os métodos existentes têm várias limitações diferentes.

Imunoprecipitação da cromatina, seguida por sequenciamento (ChIP-seq)⁷, a mais prevalente na vivo técnica, de profundidade não permite a medição de afinidades de ligação ou a localização exacta de binding sites dentro de fragmentos genômicos. Vários em vitro métodos, incluindo footprinting⁸DNase, mobilidade electrophoretic turno (EMSA)⁹, superfície plasmon ressonância (SPR)¹⁰e microescala thermophoresis¹¹ são capazes de medir as afinidades de ligação, Mas eles são relativamente baixa taxa de transferência. Por outro lado, técnicas de alta taxa de transferência, incluindo proteína ligação microarrays¹², HT-SELEX^13,14e bacterianas um híbrido (B1H)¹⁵ não são capazes de medir as afinidades de ligação e normalmente produzir excessivamente específica vinculação sequências, que é principalmente devido a seleção rigorosa ou lavar as etapas necessárias. Os desenvolvimentos mais recentes incluem o sequenciamento profundo baseado HiTS-FLIP¹⁶, SELEX-seq¹⁷, baseada em microfluídica MITOMI¹⁸ e o sorriso-Seq¹⁹, que permitem a extração de afinidades de ligação absoluta; no entanto, eles dependem de medir intensidades de fluorescência de rotulado TF e DNA. Fluorescência sinais, portanto, tornar-se limitar às concentrações de baixa proteína e na determinação de valores baixos de K_D (< ~ 10 nM). Além disso, a ligação de TF-DNA em um desses métodos ocorre em superfícies finas, levantando questões com vinculação inespecíficas e/ou fundo de autofluorescência, o que torna difícil quantificar com precisão a ligação fraca.

Para lidar com essas limitações, nós desenvolvemos um novo método para determinar as paisagens de afinidade do TF-DNA em equilíbrio e em solução, que chamamos de alto desempenho da fluorescência anisotropia (HiP-FA)²⁰. A técnica é baseada na fluorescência estabelecida anisotropia (FA) ensaio²¹ mas modificada para medir constantes de ligação com alta sensibilidade e em grande escala usando um microscópio automatizado personalizado e configuração de análise.

O ensaio de FA monitora a interação da espécie fluorescente etiquetada (como um oligómero de DNA) para um parceiro de ligação, neste caso, um TF, medindo-se a rotação molecular da molécula rotulada. A ligação para o TF, sua velocidade de rotação diminui devido à maior raio hidrodinâmico e o peso molecular do complexo acoplado, que resulta em maior FA. A medida exata de ligação muito forte (K_D < ~ 1 nM) requer o uso de baixas concentrações de referência rotulada, DNA (c < ~ 1 nM). Isto é difícil de alcançar com um instrumento comercial tais como um leitor de microplacas padrão. Além disso, uma diferença de tamanho grande (10-100 vezes) entre os complexos acoplados e desacoplados é geralmente necessária, proibindo a medição das interações entre domínios de ligação de TF e curtos oligómeros de DNA, que são tipicamente de peso moleculares similares mais ou menos . Finalmente, uma curva de titulação completa normalmente requer a preparação e a medição de vários poços que contém uma série de concentração para a espécie titulada.

Para solucionar esses problemas, nós usamos uma armadilha de microscopia widefield, modificada para alcançar a sensibilidade elevada da deteção e permitir medições de FA em z-posições diferentes de um único poço. Isso nos permite monitorar as interações de ligação entre as espécies de semelhante peso molecular e com alta afinidade. Uma taxa de transferência é conseguida medindo FA de formatos de placa multi bem e realizar uma série de titulação inteira em um único bem, usando um sistema de entrega de controlada (Figura 1um). Além disso, empregando um ensaio competitivo, extraímos as constantes de ligação, não só mas também a concentração de proteína ativa. Esta é uma característica importante do ensaio, uma vez que apenas uma parte das moléculas expressas TF são ativo devido ao enrolamento de proteínas ou degradação. A instalação experimental baseia-se em um microscópio de epifluorescência comercial equipado com estágios de XY - e Z-piezo. Nós atualizado o sistema com a excitação do laser externo e, em seguida, detectado que os dois emitida componentes de polarização linear sobre o chip de uma câmera EM-CCD com eficiência quântica alta para detecção de luz (Figura 1b e 1C). O sistema usa um objectivo de alta abertura numérica (NA) acoplado a um sensor ultra sensível e, portanto, proporciona medições altamente sensíveis de FA. Gravando-se z-pilhas de fluorescência, vinculação interações pode ser medido ao longo do eixo z óptico quando usando uma matriz heterogêneo para os reagentes. Todas essas modificações podem ser facilmente implementadas em um sistema existente e são cost-effective.

Nós empregamos um ensaio competitivo em que a afinidade de ligação de um oligómero de DNA sem rótulo é medida em comparação com o DNA fluorescente etiquetado, que serve como uma referência. TF e referência DNA são incorporados em concentrações fixas em uma matriz de gel de agarose porosa (poros tamanho ~ 1 µm) que constitui um ambiente não-interagindo para a ligação. A referência de DNA é rotulado com Cy5. Este corante provou para ser well-suited para medições de FA devido ao seu tempo de vida de fluorescência relativamente longo (~ 1ns) e emissão de fluorescência no far-red do espectro visível (fundo de baixa autofluorescência). A concentração de TF é em excesso molar sobre DNA Cy5-referência, garantindo que todo DNA de referência está ligado à proteína. Uma solução do concorrente sem rótulo DNA é então depositada na superfície do gel e difunde-se no interior da matriz porosa, estabelecendo um gradiente de concentração c (z, t) muda ao longo do z-posição do plano focal e tempo t (Figura 1, Figura 2a-2C). O TF vinculado ao DNA Cy5-referência, portanto, é localmente exposto a diferentes concentrações do concorrente DNA que concorre para vinculação, levando a uma FA dinamicamente mudando de Cy5-referência DNA FA_REF(z, t) (Figura 2b e 2C).

Para determinar a c(z,t) de concentração de concorrente, medimos em separado wells (poços de calibração) a FA dinamicamente a mudança do sinal do Nilo Azul (NB) FA_NB(z, t) (Figura 2um e 3). Esta tintura intercala no ADN e desse modo atua como um sensor de ADN para o concorrente de DNA. Com este sistema de entrega controlado, dezenas a centenas de diferentes afinidades de ligação de DNA-proteína podem ser medidas dentro de um prato bem multi (formato de placa de 96 ou 384 poços). Medição é então realizada sequencialmente até completo deslocamento da referência rotulado DNA do TF. Determinamos a especificidade de ligação para um dado fator medindo as afinidades de todas as mutações de base única de 3 N da sequência consenso de comprimento N. Quadril-FA requer pequenas quantidades de proteínas (~ pmoles por curva de titulação) e mostra baixa variabilidade na determinação de K_Ds [coeficiente de variação (CV) < 20%], permitindo que as medidas em uma escala relativamente grande. O método pode ser realizado manualmente ou totalmente automatizado usando um sistema robótico, resultando em CVs ainda menores (Figura 4, painel superior). Constantes de dissociação são medidos com exatidão elevada até 0,5 nM. Por afinidades extremamente altas (K_D < 500 pM), nós usamos uma padrão competitiva titulação (Figura 5) devido as imprecisões na medição de concentrações de DNA concorrente em níveis baixos (< 100 nM).

Quadril-FA pode ser implementado em quase qualquer padrão, invertido, epifluorescência microscópio fluorescente, desde que a disponibilidade de um automatizado XY-estágio e um estágio de eixo z de piezo. Componentes ópticos foram construídos em torno de uma instalação automatizada widefield equipada com um objetivo de longa distância. Na prática, o ensaio pode ser adaptado aos objectivos com outras características (em trabalho específico, a distância e abertura numérica). No entanto, isto requer a otimização dos parâmetros (distâncias entre a z-fatias, a porosidade e a altura do gel do agarose, etc.). O uso de outros tipos de lasers ou câmera também é possível. Uma descrição detalhada de todo o procedimento experimental e análise de dados é dada abaixo, na seção de protocolo.

Protocolo

1. microscopia de polarização

1. Para a iluminação de laser widefield, concentre-se uma linha de nm 638 de um laser de diodo contínuo (40 mW) sobre a abertura de fibra óptica multimodo para limpeza do feixe. Monte um polarizador linear na saída da fibra para definir a polarização da luz laser.
2. Bloquear o componente da excitação da luz emitida com um espelho dicroico (interrupção de 640 nm) e um filtro passa-banda (bandpass 700/75).
3. Deixe o sinal de fluorescência passar através de um divisor de feixe polarizador, que divide a luz emitida em seus componentes polarizados perpendiculares e paralelas. Em seguida, focar o feixe não-refletida (componente paralelo) e o feixe reflectido (componente perpendicular) com uma lente acromática de 200 milímetros de comprimento focal o chip de uma câmera do CCD-EM back-iluminado (Figura 1b e 1C). Use um espelho para ajustar a direção do feixe perpendicular em direção da lente.

2. projeto e testes de referência fluorescente etiquetado oligómero de DNA

1. Determinar a sequência de núcleo da referência do DNA: o método é baseado em um ensaio competitivo que mede a constante de dissociação (K_D2) entre um fator de transcrição e oligómero de DNA sem rótulo concorrente que concorre para a ligação com um fluorescente etiquetado DNA cuja afinidade para o TF atua como um referências (K_D1). A sequência de consenso Obtida de outras fontes como footprinting do DNase ou bacteriana 1-híbrido pode servir como ponto de partida^5,15.
   Nota: como regra geral, uma referência adequada DNA tem um 3 a 7-fold diminuição na afinidade de ligação para o TF em comparação com a sequência de consenso.
2. Medir por HiP-FA o K s_D1de 2-3 mutações única tentativas da sequência consenso derivado na etapa anterior. Tente mutar posições na sequência de consenso que não são muito específicas para evitar a perda completa de vinculação.
   Nota: É importante que a sequência de referência é vinculada pelo fator de transcrição de interesse (nós usamos neste protocolo Gt gigante), mas não muito forte, para que os concorrentes mais fracos podem outcompete-lo em concentrações elevadas.
3. Estender o motivo de núcleo (8-12 pares de base, geralmente) para um comprimento de 16 pares de bases ou mais adicionando simetricamente flanqueando a sequência em ambos os lados (adicionar cadeias laterais para ligação adequada). Se necessário (por mais tempo aguardando domínios, por exemplo), usar sequências mais tempo (até ~ 50 pares de base de comprimento foram testados com o ensaio de quadril-FA).
   Cuidado: Tenha cuidado para não adicionar as bases que são esperadas para criar locais obrigatórios de gravidez ectópica. Utilize ferramentas computacionais que prever locais obrigatórios do PWMs disponíveis para facilitar o processo (por exemplo, PySite,²²).
4. Como referência rotulada DNA, oligómeros de ordem que são fluorescente etiquetados na Avançar ou reverter a vertente na extremidade 3' ou 5'. Use, por exemplo Cy5, Bodipy-650 ou qualquer outro corante apropriado em uma concentração de 10 µM (estoque de 10 x 100 µM) em água e diluir em etapas como descrito no passo 3.1.
5. Preparar 500 mL de tampão de ligação 1x adicionando 33 mM de tampão de fosfato de potássio (pH = 7,0), 90 mM de NaCl e 0,01% de detergente não-iônico em água destilada. Também prepare 3 x buffer de vinculação, que contém os mesmos componentes, exceto em concentrações triplo. Se usando 3x do tampão de ligação como solução para o tampão de ligação 1x, preparar volumes > 500 mL; caso contrário, prepare 250 mL.
   Nota: Esta composição foi otimizada para estabilidade do fator de transcrição e para evitar a dimerização de glutationa S-transferase (GST).
6. Medida com a configuração de microscopia descrito na etapa 1 a FA de 200 µ l de tampão de ligação contendo 0.8 nM com o rótulo de referência DNA na presença de uma quantidade diferente de TF em uma placa de 96 poços de microscopia (5-6 poços com diferentes concentrações de TF) vidro inferior a Determine a concentração de TF para usar. Realizar uma série de titulação com quantidade crescente de TF e escolher para o ensaio a concentração para o qual a curva atinge um platô, indicando a ligação completa do oligómero de referência DNA.
   Nota: A concentração ideal de TF depende dos valores das constantes de dissociação de TF-DNA. Em geral, baixa K_Ds requerem concentrações inferiores.

3. oligomer recozimento

1. Para recozer os oligómeros de DNA da referência rotulado DNA (sequência determinada no passo anterior), misture 7 µ l de 10 mM tingir-etiquetados em frente single-stranded DNA solução e 7 µ l de uma concentração de 10 mM do seu complemento reversa sem rótulo em 186 µ l de água.
2. Para as sequências de DNA do concorrente, misture 20 µ l de soluções de 100mm (na água, fornecida pelo fabricante) do ADN para a frente com 20 µ l de 100 mM do correspondente inversa single-stranded DNA para cada sequência concorrente individual a ser medido.
3. Execute o recozimento separadamente em um padrão cycler PCR a aquecer as soluções a 70 ° C por 3 min e diminuindo a temperatura para RT em uma taxa de 0,1 K/s. Se a máquina PCR utilizada não suporta gradientes de temperatura em que a taxa, simplesmente fazer a incubação do gradual com a diminuição de temperatura (foram testados 99 ciclos de 3 s com-0,40 K por ciclo).

4. gel preparação

Nota: A seção a seguir explica a preparação de dois diferentes tipos de géis: 1) os poços de titulação contêm géis com proteína e são usados para determinar o K_Ds para as sequências de DNA respectivo concorrente, e 2) os poços de calibração fazem uso de NB para Determine a concentração de DNA em cada altura de ponto e aquisição de tempo determinado. O foco é sobre a preparação do experimento em uma placa de 96 poços, mas os volumes correspondentes para um formato de placa 384 também são indicados.

1. Dissolva 0,5% w/v agarose de baixo ponto de fusão no buffer de vinculação fervendo em um forno de microondas de laboratório. Após dissolução completa, ajuste o volume novamente com DDQ₂O para compensar a evaporação possível.
   Nota: Para sua conveniência, preparar um estoque de 10-20 alíquotas de 10 mL dos géis e derreta-os em 75° C, quando eles são necessários. Estoques de gel podem ser armazenados em RT
   Cuidado: Tenha cuidado para evitar o superaquecimento da solução de gel no microondas. Curto tempo de aquecimento intervalos com agitação entre são preferíveis.
2. Para preparar a titulação e calibração poços, primeiro derreta dois 10 mL gel de estoque partes alíquota a 75 ° C, sob agitação.
   1. Use 240 µ l (incluindo 20% de sobrecarga) para cada concorrente (n = número de sequências de concorrente).
   2. Use o mesmo volume de gel para o poço de calibração NB para garantir uma temperatura igual e viscosidade de ambos os géis.
   3. Então definir a temperatura de 35 ° C e esperar que a temperatura equilibrar.
3. Para os poços de titulação, adicionar 1,4 nM (concentração final) hibridizado referência DNA (obtido na etapa 3), proteína TF (concentração final C_TF = 20-60 nM, conforme determinado na etapa 2.6), TDT (0,2 mM) e ligação de buffer em um volume total de n x 200 µ l ou n x 13 µ l em um 96 - ou 384 poços da placa formato, respectivamente (mais sobrecarga). Mistura completamente por inversão/agitação (fazer não vórtice).
4. Lentamente, adicione 200 µ l por alvéolo em formato de placa de 96 poços (13 µ l/poço para 386 poços) da solução de gel preparado na etapa anterior para os poços de titulação a placa bem.
5. Para os poços de calibração, primeiro adicione 5 nM NB ao gel derretido fora dos poços (totais volume dependendo do formato de placa bem usada e o número de calibração poços; normalmente 5-6 por placa bem é suficiente).
6. Pipetar 200 µ l (13 µ l para formato de placa 384) de NB que contenha gel lentamente dentro dos poços de titulação da placa bem e certifique-se de evitar bolhas de ar.
   Nota: O uso de Pipetas eletrônicas ou robótica aumenta significativamente a reprodutibilidade.
7. Deixe o gel solidificar por 10 min em RT e outro 10 min a 4 ° C (remover condensação do vidro depois se necessário). Certifique-se de realizar todos esses passos sobre uma superfície horizontal perfeitamente para evitar superfícies não-homogênea de gel.
   Nota: Os géis contendo proteína são geralmente estáveis durante pelo menos várias horas a 4 ° C.

5. adicionar a solução de DNA do concorrente

Nota: As seguintes soluções devem ser preparadas antes de iniciar a titulação e são adicionadas no topo dos poços de calibração e titulação simultaneamente.

1. Adicione que o recozido rotulado referência DNA e proteína em 3x do tampão de ligação em 3 vezes umas concentrações mais elevadas do que as alíquotas de estoque de gel.
   1. Mix 20 µ l da solução obtida com 40 µ l de cada recozido solução concorrente do ADN obtida na etapa 3.
   2. Para cada poço de calibração, misture 20 µ l de tampão de ligação contendo solução de 15mm NB com 40 µ l do concorrente recozido DNA (qualquer sequência do mesmo comprimento é adequada) de 3x.
      Nota: Para as placas de 384-bem, use 21 µ l em vez de 60 µ l no total.
2. Opcionalmente, verifique a homogeneidade dos níveis altura em diferentes poços da placa de gel de espectroscopicamente medindo-se a absorvância a 380 nm, utilizando um leitor multi bem (os valores de absorvância são proporcionais às alturas gel).
3. Adicione 50 µ l (7 µ l para formato de placa 384) das soluções de DNA misto concorrente (recozido na etapa 3) em cima do gel. Tente adicionar todas as soluções de concorrente tão simultaneamente quanto possível usando pipetas multicanais eletrônicas ou uma cabeça de pipetagem de 96 canais, se disponível. Após a adição das soluções concorrente, colocar a placa no palco microscópio e começar as medições imediatamente (etapa 7).

6. aquisição de imagem

1. Sequencialmente, adquirir vezes série de z-pilhas (por exemplo, usar 12 aviões e 100-300 ms de tempo de iluminação). Evite tomar imagens muito próximo à superfície bem (< ~1.4 µm com as placas utilizadas pertencem) para excluir qualquer viés de polarização.
2. Execute 10-25 ciclos de medições até completa desvinculação do DNA referência rotulado do TF. O ponto de extremidade normalmente é atingido após 1-2 h, dependendo da cinética de ligação e difusividade do concorrente DNA.

7. extração de FA(z,t) de dados brutos

1. Uma vez que um prato bem tem sido fotografado, calcule a partir das imagens de fluorescência bruto os valores de pixel média de componentes de intensidade de regiões de interesse para o paralelo (I₌) e perpendicular (I₊) polarizadas (Figura 1c). Isso pode ser feito automaticamente, usando o software de quadril-FA²³.
   Nota: O software de quadril-FA, um manual de instruções e um conjunto de dados de teste podem ser baixado²³. Como alternativa, use qualquer outro software personalizados para extrair₌ e₊ e realizar a análise a jusante das curvas de titulação, conforme descrito em detalhes abaixo.
2. Calcule FA para cada poço. Para cada poço, o script calcula FA(z,t) em cada z-posição e ponto de tempo t , de acordo com:
   Equação 1:
   Onde G é o instrumento de G-fator que corrige para qualquer viés em direção ao canal perpendicular.
3. Determine o fator G da instalação do microscopia medindo a FA de todas as soluções contendo um corante fluorescente de anisotropia conhecido. Extrair os componentes de dois polarização do sinal e então usar a equação 1 para obter G, sabendo que a FA da solução (G = 1,15 nesta configuração).

8. calibração curva para determinação da concentração de DNA concorrente de FA_NB

1. Recoze a 120 µ l de cada oligómero de referência direta e inversa (concentração de ações de 100 mM; qualquer sequência aleatória com o mesmo comprimento como o concorrente sequência pode ser usado) e misture com 120 µ l de tampão de ligação contendo NB de 3x (15 nM).
2. Prepare uma série de diluição com diluições de 1:2 em tampão de ligação 1x com 6 diluições no total. Mix 50 µ l destas diluições com 200 µ l de gel de agarose (T > 35 ° C) de baixo ponto de fusão de 0,5% em tampão de ligação contendo 5 1x nM de NB em triplica.
3. Adicionar 200 µ l de cada uma das 6 soluções preparadas na etapa anterior em uma placa de 96 poços e armazenar a placa por 1 h a 4 ° C para garantir a completa gelificação, então 1h no RT. medida a FA_NB das soluções usando a configuração de quadril-FA.
4. Extraia o FA_NB (z, t) de acordo com a etapa anterior e ajustar os dados usando uma equação de Hill:
   Equação 2:
   Onde C_DNA é a concentração do oligómero de DNA; k a concentração dos oligómeros de DNA no qual metade dos sites de ligação estão ocupados; FA_máximo é uma constante de normalização; e n é o coeficiente de Hill. k, FA_máx e n são definidos como parâmetros gratuito durante o procedimento de montagem.
5. Introduza os três parâmetros obtidos a partir do procedimento de encaixe no software HiP-FA (no painel do canto inferior esquerdo).
6. Repeti a determinação da curva de calibração a cada três meses, ou depois de fazer alterações na configuração da microscopia.

9. determinação das concentrações de DNA de concorrente

1. Use o software de quadril-FA para extrair c (z, t) de medições FA_NB(z, t) (Figura 3). Primeiro obter a curva de calibração, conforme descrito na seção anterior e inserir os parâmetros de instalação do software (consulte o manual para detalhes).
2. Use o programa para extrapolar automaticamente c(z,t) para c < 100 nM (Veja o manual para detalhes) usando equação 3 (Figura 3b), que descreve a difusão unidimensional do concorrente DNA dentro da matriz do gel de agarose, assumindo livre difusão.
   Equação 3:
   Onde C₀ é a concentração inicial do concorrente DNA; ERF é a função de erro; z é a posição; D é o coeficiente de difusão do concorrente DNA; e t₀ é a data inicial das medições. Os enciclopédia parâmetros usados são C₀ e z /.

10. convencional titulação do competidor com quadril-FA para ligação de DNA muito forte

1. Serialmente diluir os oligómeros de DNA diferente do concorrente nas linhas de uma placa de 96 poços (ou placa de 384) nas concentrações de: 0, 1.25, 3.5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900 e 4000 nM. Adicionar a referência Cy5-rotulado DNA (1 nM) e TF (20-50 nM) em uma concentração constante, com um volume total de 200 µ l por alvéolo em tampão de ligação (Figura 5a). Espere 40 min, até é atingido o equilíbrio termodinâmico e adquirir (com a configuração de quadril-FA) z-pilhas para cada poço (aquisição de imagens diversas por alvéolo reduz a variabilidade calculando os valores calculados da FA).
2. Construir as curvas de titulação de vinculação de equilíbrio e encaixá-los com a equação 4 (Figura 5b). O s K_Ddeterminado por titulação do competidor convencional são idênticos aos obtidos por HIP-FA usando um gel de agarose matriz²⁰.

11. encaixe o procedimento das curvas de titulação do FA

1. Exibidos no software HiP-FA, as curvas de titulação reconstruído para as sequências individuais concorrente FA(z,t) = f[c(z,t)] e verifique visualmente a qualidade de dados (consulte o manual para detalhes). Se necessário, refine os parâmetros utilizados para a determinação das concentrações de DNA do competidor na etapa 10.
2. Ajuste cada curva de titulação individual automaticamente usando a equação 4, que dá uma solução analítica para a titulação do competidor ensaios²⁴.
   Equação 4:
   Com:
   
   
   
   Cadê o R_T a concentração de proteína; L_T é o sem rótulo e L_ST é a concentração de DNA etiquetada; K_D2 é a constante de dissociação a determinar; R_T é a concentração de proteína ativa; e A e B são parâmetros de normalização.
   
   Primeiro, determine K_D1, que serve como uma referência para a determinação dos diferentes valores de K_D2 . É K_D1 pode ser facilmente determinado com o ensaio, escolhendo a sequência de DNA de corante-referência como a sequência do DNA concorrente sem rótulo (ver manual).
3. Digite o valor obtido de K_D1 no software e computar os valores de K_D2 para todos o concorrente DNA na placa.
   Nota: Os parâmetros livre do procedimento de montagem são K_D2, R_T, A e B.
4. Exporte a constante de dissociação K_D2 e a concentração de proteína ativa R_T para todos os poços de titulação individual da placa clicando no botão "Exportar" no software.

12. PWM construção, especificidade da interação da proteína-ADN e contagens de Pseudo

Crie logotipos a sequência para os PWMs diferentes usando a ferramenta on-line WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi), conforme descrito anteriormente,²⁰.

Resultados

Nós aplicamos HiP-FA ao TFs da segmentação gene rede^25,,²⁶, que gera o padrão de corpo ântero-posterior de embriões da drosófila, principalmente através de regulamento transcriptional. Esta rede, escolhemos o bZIP domínio TF gigante (Gt) para uma análise detalhada (Figura 4). Como factores de transcrição completos são difíceis de expressar e produzir principalmente as mesmas preferências de ligação como sua vinculação de DNA domínios (DBD)¹³, usamos o DBD fundido a GST e expressa a construção em e. coli GST proteínas de fusão para entrega os mesmos resultados que DBDs sozinho²⁰.

A sequência de consenso do Gt (umTTACGTAAC) representa a sequência de ligação mais forte que determinamos como descrito acima. Então investigamos a influência sobre a energia de ligação de todas as mutações de ponto único possíveis dentro da Gt 10-mer sequência do consenso (um total de 30), ladeado por bases adicionais nas extremidades 5' e 3'. Nós medimos duas repetições cujas amostras de gel foram produzidas usando a automação e uma replicação adicional produzido manualmente para comparação. O K_Ds variou de 0,6 a > 2000 nM para sequências de mutação isoladamente, e também confirmamos a completa falta de ligação a uma sequência de "não vinculativa" (dados não mostrados).

Especificidades de ligação TF-DNA são tipicamente modeladas usando uma matriz de peso de posição (PWM), em que um resultado é atribuído a cada nucleotídeo possível em cada posição no tema da vinculação. O PWM assume que cada posição contribui para vinculação força independente e na maioria dos casos constitui um modelo suficiente para TF vinculação preferências²⁷. Geramos PWMs revistos, com base em nossas medições de afinidade a seguir estabelecido procedimentos^28,29 e comparou-os a dois PWMs anteriormente relatados na literatura. O primeiro é baseado em contagens de frequência do nucleotide de ligação locais identificados pelo DNA do footprinting^4,5, e o segundo PWM foi obtido pela seleção de (B1H) um híbrido bacteriana. ¹⁵

A alta similaridade dos PWMs para as três repetições (Figura 4, painel superior), incluindo para a amostra preparada manualmente (replicação 3), demonstra a grande reprodutibilidade do método HiP-FA. Enquanto os PWMs obtidos por HiP-FA são globais semelhante as PWMs obtidos com outros métodos (Figura 4, painel inferior), há desvios significativos: na posição 2 (seta preta), o início do motivo bZIP do núcleo, mutações T > (G, C, A) levar a total perda da ligação no motivo de obtidos por HiP-FA, que é consistente com o tema B1H mas não com obtido com footprinting do DNase, em que a ligação continua a ser relativamente forte para bases (G, A). Por outro lado, na posição 7 (seta cinza), a mutação T > C leva a muita ligação mais forte do que era esperado baseia os PWMs previamente medidos.

Outros desvios são mais sutis, mas não menos importante. Em geral, o quadril-FA PWM é menos específico do que os outros dois, refletindo o fato de que muitas mutações do consenso ainda resultam em moderadamente forte ligação. Isto pode ser quantificado usando as informações de conteúdo (IC). O IC é de 11,5 bits para a matriz de quadril-FA (média de três repetições), em comparação com IC = 13,4 bits e bits 16,8 para o footprinting do DNase e matrizes B1H, respectivamente. Geralmente (embora não universalmente), o PWMs obtidos por HiP-FA são menos específicos do que os obtidos por outros métodos, baseados em 26 TFs investigaram²⁰.

Figura 1:representações esquemáticas do quadril-FA ensaio e instalação experimental. (um) sistema de entrega de gel para concorrente titulada DNA em poços único. (b) instalação de microscopia HIP-FA. Personalizado widefield automatizado microscópio com detecção de fluorescência polarizada luz em uma câmera CCD EM. imagem de fluorescência (c) Raw com as duas regiões de interesse, usado para determinar o paralelo (vermelho) e a perpendicular (verde) polarizado componentes. (d) layout típicos de uma placa de 96 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : FA raw dados e curvas de titulação reconstruído. (a) trajetória de FA(z,t) típica para uma calibração contendo bem NB. (b, c) Trajetórias de tempo FA(z,t) para dois poços de titulação, vinculação a um forte (b) e mais moderado concorrente de ligação (c) DNA de medição. (d, e) Correspondente reconstruída medições de titulação de FA e equipado curvas para o forte (d) e moderada (e) vinculação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Determinação da concentração de c de DNA o concorrente (z, t) usando o Nilo Azul (NB). (a) curva de calibração FA-concentração para 16 oligómeros de DNA de pares de bases. Em uma série de titulação convencional, NB é incorporado em gel de agarose, juntamente com diferentes concentrações de DNA de concorrente. A afinidade de NB de DNA é independente de sequência²⁰; Portanto, as curvas de calibração a mesma podem ser usadas para a determinação de c (z, t) para diferentes sequências de DNA do mesmo comprimento. (b) concorrente tempo difusão de ADN a uma altura de arbitrário z determinada usando cinco poços de calibração. Para cada ciclo de medição, os FAs médias de quatro poços contendo NB são exibidos como pontos brancos. As curvas são montadas utilizando a equação 3 (linha branca, poços individuais numa cor) e o c (z, t) em baixas concentrações (C < ~ 100 nM) é determinado pela curva de encaixe extrapolada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Vinculação especificidades da família de domínio bZIP TF gigante (Gt). QUADRIL-FA PWMs de três repetições: dois preparados usando automação e um preparado manualmente (painel superior) são comparados com PWMs gerados por footprinting do DNase e o método de seleção de (B1H) um híbrido bacteriano (painel inferior). Em geral, os motivos de vinculação do quadril-FA de acordo com dados anteriores mas também mostram diferenças significativas, como destacado com setas de pretas e cinza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Titulação do competidor convencional com quadril-FA. (a) design da placa mostra 8 diferentes concorrente DNA serialmente diluída em tampão de ligação em uma única linha de uma placa de 96 poços. Um mapa de calor FA é mostrado para pontos fortes diferentes vinculação arbitrária. (b) do competidor titulação de três concorrente DNAs vinculativa para o TF Bcd com diferentes afinidades. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Quadril-FA é um abrangente novo método para a determinação das paisagens de preferência de vinculação de interações TF-DNA. Ele mede afinidades de ligação de mutacional DNA motivo variantes diretamente, evitando qualquer pressuposto subjacente que preferências de ligação são refletidas na frequência de ocorrência de nucleotídeo em um conjunto de ligantes acima-limite. Medição ocorre na solução sem imobilização e interferência mecânica ou química, com a reação de ligação, aproximar as condições de equilíbrio tão perto quanto possível. O sistema de entrega controlado permite a medição de uma curva de titulação completa dentro de um único bem e aumenta a produtividade e a confiabilidade, poupando a proteína. Usar um objectivo com uma abertura numérica elevada e EM-CCD câmera com uma eficiência de coleta de luz alta permite a detecção de luz fluorescente altamente sensível. Daí, com esta configuração, o pequeno FA muda tão baixo como 10-15 mP pode ser detectado com precisão; na prática, isto significa que qualquer reação de ligação para que o aumento da massa depois de vinculação é mínima (tão baixo quanto uma relação massa 2) é facilmente detectado. Isto não é geralmente o caso com sistemas comerciais como leitores de microplacas. Devido a sua alta sensibilidade, quadril-FA amplia o alcance das constantes de dissociação que possa ser fiavelmente mensurada na escala picomolar. Energias de ligação são determinadas com precisão ao longo de várias ordens de magnitude.

Para avaliar a qualidade das revista PWMs, realizamos dois tipos de análise²⁰. Nós testamos, por cinco fatores da rede do gene de segmentação, bem como diferentes PWMs podem prever perfis de ChIP-seq experimentais nas regiões genômicas de 21 genes de segmentação. Como um segundo teste, usamos uma sequência-para-expressão modelo⁴ que prevê padrões de expressão de potenciadores de segmentação em função da concentração de preferência e proteína de ligação do TFs participante. Em ambos os exercícios, verificou-se que o menos específico HiP-FA PWMs executar significativamente melhor do que o mais específico do footprinting e B1H PWMs²⁰.

Ao contrário dos métodos de novo , quadril-FA requer algum conhecimento prévio de preferência de um determinado TF ligação. No entanto, sequências de consenso são conhecidas por muitos TFs, e muitos métodos existentes podem fornecê-los de^14,13,15. Se necessário, a sequência de ligação ideal verdade encontram-se iterativamente.

Nós usamos oligómeros de referência de DNA marcados fluorescentemente com Cy5 e Bodipy-650. Estes corantes provaram desempenho para medições de FA desde a anisotropia da acoplados e desacoplado rotulados-referência DNA eram o maior entre os diferentes corantes testados. Isso garante um alcance dinâmico máximo para os valores de FA. Geralmente, qualquer tintura fluorescente com um tempo de vida de fluorescência ≥ 1 ns é susceptível de ser apropriado, mas precisa ser testado primeiro. Se possível, é aconselhável usar corantes fluoresce na faixa de infravermelho próximo para minimizar a proteína autofluorescência.

O passo mais crítico do processo experimental é a pipetagem do gel para as placas bem. Boa reprodutibilidade requer os gel de volumes a ser mais uniforme possível. Mudanças na altura do gel são traduzidas em alterações de difusividade para o competitivo oligómero de DNA e assim, em mudanças aparentes de afinidade ao avaliar os dados. Esta é a principal fonte de variação em um técnico replicar. A utilização de uma técnicas eletrônicas de pipeta ou automação melhora a reprodutibilidade. Bolhas de ar dentro do gel podem ser evitadas pipetando lento e cuidadoso. Também é importante adicionar as todas as soluções de concorrente em cima dos poços de titulação com como pouco atraso possível. Para melhor reprodutibilidade, todo o processo pode ser automatizado usando um robô pipetagem com incubadoras de calor. Uma parte crítica de transferência o protocolo para automação é a otimização necessária da temperatura da incubadora e os tempos de incubação. Certifique-se de encontrar um equilíbrio ideal entre a viscosidade do gel (i. e., nem muito frio) e a estabilidade das proteínas (ou seja, não muito quente). Isso depende tanto da velocidade distribuidora dos géis em poços e estabilidade da proteína usada.

Quadril-FA faz uso de um sistema de liberação controlado para os oligómeros de DNA do concorrente. Para construir as curvas de titulações, é necessário determinar a concentração DNA concorrente c(z,t) para cada dado z-posição dentro da matriz do gel e tempo ponto t. Este é outro passo crítico, uma vez que a determinação do K_Ds depende diretamente c(z,t). Poços de calibração contendo o corante NB como um sensor para a concentração de DNA são usados para este propósito (Figura 1d, Figura 2um). Normalmente, o 3-5 poços de calibração contendo NB por placa são suficientes. Antes de avaliar qualquer HiP-FA experimento, uma curva de calibração de NB deve ser construída para o set-up, realizando uma série de titulação convencional de NB dissolvido no gel do agarose com um concorrente, o DNA de qualquer sequência em diferentes concentrações (Figura 3 um), conforme explicado em detalhes na etapa 8. No caso de ligação muito forte (K_D < 500 pM), a extrapolação utilizada para a determinação de baixas concentrações de concorrente DNA torna-se limitar, já que é menos precisa do que uma medida direta. No entanto, para TFs com tão baixa K_Ds, configuração do quadril-FA pode ser usada para executar uma titulação convencional do competidor em tampão de ligação sem o uso de uma matriz de gel de agarose (Figura 5). Por exemplo, uma titulação completa com 12 diferentes concentrações de DNA concorrente pode ser executada em uma única linha de uma placa de 96 poços.

O sistema de entrega controlado também requer rápida cinética de ligação TF-DNA e proteínas estáveis, desde a difusão embora o gel de agarose é dinâmico (embora lento). Ambas as propriedades podem ser testadas diretamente com a configuração do quadril-FA por seguinte, ao longo do tempo, a FA do TFs de interesse quando vinculado a seus respectivos fluorescente etiquetado referência DNA. Nós medida K_ON e K_OFF taxas para os fatores investigados e encontrou-os a estar na ordem de milissegundos a segundos²⁰, em conformidade com outros estudos³⁰. Isto é suficientemente rápido para garantir que as medições ocorrem no estado de equilíbrio. No caso de outras reações de ligação com cinética mais lenta, a difusividade do concorrente pode ser ajustada, reduzindo a sua concentração ou reduzindo o tamanho dos poros de gel. No caso do TFs testado, que todos têm rápido T_OFF (~ segundos), um tempo de medição total de cerca de 1-2 h é suficiente para garantir o equilíbrio termodinâmico em cada medição.

Outro possível problema relacionado com a proteína é a formação de agregados de proteínas que podem alterar as medições de FA. O uso de outras condições de reserva contendo aditivos diferentes (como tensioactivos) pode evitar a formação de agregados, se necessário.

Temos trabalhado sob a hipótese de linearidade do PWM; no entanto, quadril-FA pode ser escalado para incluir todas as mutações possíveis di-nucleotídeo da sequência de consenso. Finalmente, quadril-FA pode ser adaptado para outros tipos de interações de ligação de medir. O pré-requisito é ter disponível uma molécula de referência adequada vinculado pela proteína que pode ser fluorescente etiquetada. Com o sistema de entrega controlado, um gradiente de concentração pode ser gerado por qualquer tipo de ligante; Portanto, interações proteína-proteína e droga-proteína podem ser medidas com throughput e da mesma forma de alta fidelidade.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Oligômeros de DNA de 16 / 18 pb com etiqueta Cy5	Eurofins		Síntese personalizada
Oligômeros de DNA de 16 / 18 pb	Eurofins		Síntese personalizada
Nile Blue A	Sigma	N5632-25G
Sensoplate plus microplaca 96 ou 384 poços, PS	Greiner	655891	175 µ m fundo de vidro grosso
384 Poço Sensoplate, Greiner preto		788896
Agarose, baixa temperatura de gelificação	Sigma	A9414-50G
Cloreto de sódio	Merck	1.06404.1000
Tween-20	Sigma	P1379-1L
Hidrogenofosfato dipotássico trihidratado	Merck	1.05099.1000
Fosfato de di-hidrogênio de potássio	Merck	1.04873.1000
Elemento Q-POD	Merck Millipore	ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter	Merck Millipore	MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Sistema de Purificação de Água	Merck Millipore	ZRXQ003WW
Quantum TIX	Merck Millipore	QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol	Sigma	43815-1G
Mastercycler gradiente	Eppendorf	Z316083
Tubo SafeSeal 1,5 mL	Sarstedt	72.706.200
Tubo 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Copo Multiply-Pro 0,2 mL PP	Sarstedt	72.737.002
CONFIGURAÇÃO DE MICROSCOPIA:
Microscópio de campo amplo automatizado	LEICA	DMI6000
Objetiva de longa distância	LEICA	HCX PL FLUOAR L 60x/0,60 N.A. Laser
de 638 nm	Omicron	PHOxX 638-40, 40mW
Câmera EM-CCD retroiluminada	Andor	iXon DV897
Espelho dicróico	AHF	640nm cut-off
Filtro passa-banda	AHF	ET passa-banda 700/75
Polarizador linear	Thorlabs	LPVISC050-MP2
Divisor de feixe polarizador	Thorlabs	BS010
Lente acromática	Thorlabs	Distância
Fibra óptica multimodo	Optronis	FVP600660710
SISTEMA ROBÓTICO:
Nosso sistema robótico inclui estações de trabalho Biomek NXP com cabeçote de 96 canais e pipetadores Span-8, conectados a um servo-shuttle, são usados para todas as etapas de transferência de líquidos. Além disso, o sistema é equipado com agitadores orbitais e um leitor de microplacas (Paradigm, dispositivo molecular) atendido pela pinça Span-8	Beckman Coulter	Biomek NXP
SOFTWARE:Linguagem de
programação	National Instruments	Labview 9.0
Script para o software HiP-FA disponível em			https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA