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Artigo de método

Avaliando virulência e patogênese da infecção por Aeromonas em um modelo de Caenorhabditis elegans

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DOI:

10.3791/58768

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20 de dezembro de 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Internal Medicine, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos três experimentos diferentes para estudar Aeromonas infecção em c. elegans. Usando estes métodos convenientes, é fácil avaliar a toxicidade entre e dentro de espécies de Aeromonas .

Resumo

O patógeno humano Aeromonas tem demonstrado clinicamente para causar gastroenterite, infecções de ferida, septicemia e infecções do trato urinário. Doenças humanas mais foram relatadas para ser associado com quatro espécies de bactérias: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniie Aeromonas caviae. O organismo modelo Caenorhabditis elegans é um bacterivore que fornece um modelo de infecção excelente por que estudar a patogênese bacteriana de Aeromonas. Aqui, apresentamos três experimentos diferentes para estudar Aeromonas infecção usando um modelo de c. elegans , incluindo ensaios de necrose muscular, toxicidade líquida e sobrevivência. Os resultados dos três métodos de determinar a virulência de Aeromonas foram consistentes. A. dhakensis foi mostrado para ser o mais tóxico entre as 4 espécies de Aeromonas principais causando infecções clínicas. Esses métodos são mostrados para ser uma maneira conveniente para avaliar a toxicidade entre e dentro de espécies de Aeromonas e contribuir para a nossa compreensão da patogênese da infecção por Aeromonas .

Introdução

O patógeno humano, Aeromonas, tem demonstrado clinicamente causar gastroenterite, infecções de ferida, septicemia e infecções de aparelho urinário1,2. Doenças humanas mais associadas foram relatadas para ser associado com quatro espécies bacterianas: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniie Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. entre as doenças infecciosas Aeromonas , infecções de tecidos moles podem causar grave morbidade e mortalidade em seres humanos. De nota, necrose muscular é a forma mais grave da infecção de tecidos moles6. Observação da sobrevivência e necrose muscular de Caenorhabditis elegans após a infecção são um método conveniente especular a toxicidade de Aeromonas.

Cientistas já desenvolveram numerosos organismos modelo para estudar a infecções bacterianas. Em estudos anteriores, nematoides, zebrafishes e ratos foram usados como modelos animais para estudar a patogênese e a virulência de Aeromonas6,7,8. Cada modelo animal tem suas ' vantagens e aplicações. O organismo modelo, Caenorhabditis elegans, é um nematódeo bacterivorous bactérias que aportes como foodnaturally. C. elegansdesenvolveu um complexo sistema imune inato contra infecção bacteriana ao longo de sua evolução. Sob o estresse da infecção bacteriana, c. elegans tem provado para ser um modelo de infecção excelente para estudar a patogênese bacteriana de Aeromonas6,7,9 e outros patógenos como o fungo10 e enterohemorrágicas Escherichia coli O157: H711. No entanto, não há ainda nenhuma publicação que enfoca a metodologia em usando o c. elegans como modelo para o estudo da virulência de Aeromonas.

Aqui, apresentamos três experimentos diferentes para estudar Aeromonas infecção usando c. elegans como modelo animal: ensaios para a sobrevivência, toxicidade líquida e necrose muscular. Esses métodos são uma maneira conveniente para avaliar a toxicidade entre e dentro de espécies de Aeromonas e melhorar a compreensão da patogênese de Aeromonas.

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Protocolo

1. preparação do meio de cultura

Nota: Consulte a tabela 1 para preparação da solução.

  1. Para preparar o M9 médio12, dissolva 1,5 g de KH2PO4, 5,66 g de Na2HPO4e 2,5 g de NaCl em 500 mL de água desionizada. Autoclave a 121 ° C por 20 min. espere até a temperatura de refrigeração e em seguida, adicionar 0,5 mL de 1 M MgSO4 antes da primeira utilização.
  2. Para preparar o nematódeo crescimento médio (NGM)12, dissolva 3 g de NaCl, peptona bacteriana 2,5 g e ágar 20 g em 1 L de água desionizada. Autoclave a 121 ° C por 20 min. espere até a 55 ° C, em banho de água de refrigeração e em seguida, adicione 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de 1m MgSO4, 1ml de colesterol de 5% em etanol e 25 mL de tampão fosfato. Redemoinho para misturar bem.
  3. Despeje cerca de 5 mL NGM em cada placa de Petri de 6cm. Evite a produção de bolhas na superfície da placa. Deixar as placas em temperatura ambiente por 1 noite e pacote para salvar a 4 ° C. Trazer de volta à temperatura ambiente antes do uso.
  4. Para preparar NGM enriquecido (ENGM), dissolva 3 g NaCl, bacteriana peptona 5g, extrato de levedura 1 g e 30 g ágar-ágar em 1L de água desionizada. Autoclave a 121 ° C por 20 min. espere até a 55 ° C, em banho de água de refrigeração e adicionar 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de 1m MgSO4, 1ml de colesterol de 5% em etanol e 25 mL de tampão fosfato. Redemoinho para misturar bem.
  5. Despeje cerca de 10 mL ENGM em cada placa de Petri de 9 cm. Evite a produção de bolhas na superfície da placa. Deixar as placas em temperatura ambiente por 1 noite e pacote para salvar a 4 ° C. Trazer a temperatura ambiente antes do uso.
  6. Para preparar o S médio12, misture o citrato de potássio 40 mL S Basal, 0,4 mL 1m, rastreamento de 0,4 mL metais solução, 0,12 mL de 1 M CaCl2, 0,12 mL de 1m MgSO4, 40 µ l de colesterol de 5% em etanol e 1 mL de 8mm FudR antes do uso.

2. sincronização de c. elegans6,9,12

  1. Lavagem de cerca de 2.000 vermes no estágio adulto gravid com 10 mL de água desionizada estéril em um tubo de 15 mL. Lave as bactérias 3 x, mantendo as minhocas no fundo do tubo.
  2. Centrifugar a amostra para 1 min a 500 x g a puxar para baixo os vermes. Remover o sobrenadante e manter os vermes em 3,5 mL de água desionizada.
  3. Adicione 1 mL de NaOCl (10 – 15%) e 0,5 mL 5 M KOH dentro do tubo. Mistura uniformente agitando para < 6 min para lisar os corpos de verme.
  4. Depois que os ovos são liberados do vermes, adicione 10 mL de água desionizada para parar a Lise. Centrífuga para 1 min a 1.200 x g para puxar para baixo os ovos e retire o máximo possível de sobrenadante. Lavar com 15 mL M9 médio pelo menos 3x.
    Nota: Consulte a etapa 1.1 para a composição do meio de M9.
  5. Manter os ovos em média 1 mL M9. Transporte de ovos para um prato de 3,5 cm para incubação a 20 ° C por uma noite (cerca de 12 a 18 h).
    Nota: Após a incubação, os ovos eclodirão para verme larva que é chamado como primeira fase de larva (L1).
  6. Pipetar para fora 10 µ l de vermes L1 M9 médio. Contar o número de verme e calcular que a concentração de L1 worms na M9 médio.
  7. Sementes no máximo 10.000 incubadas vermes de fase L1 com uma pipeta num prato de ENGM 9cm espalhar com Escherichia coli OP50.
    1. Nesta etapa, propagação de 0,5 mL durante a noite culto OP50 de Escherichia coli com caldo Luria-Bertani (LB) na placa ENGM de 9 cm. Incubar a placa a 37 ° C para 16 – 18 h
      Nota: Para evitar a contaminação, a etapa de propagação deve ser executada em uma capa de fluxo laminar.
    2. Arrefecer à temperatura ambiente antes da semeadura L1 vermes. Sementes no máximo 10.000 incubadas vermes de fase L1 na placa com e. coli OP50 ENGM.
  8. Incube os vermes a 20 ° C por 44 h ou até que eles crescem para a fase de larva (L4) 4th .
    Nota: Consulte a etapa 1.3 para a composição do meio ENGM. Uma minhoca tem um ponto branco em forma de meia lua no meio do lado do corpo, na fase de L4.
  9. Use o L4 sincronizado palco vermes em ensaios a seguir. Use o tipo selvagem que N2 vermes no ensaio de sobrevivência de c. elegans com Aeromonas dhakensis e o ensaio de toxicidade líquido c. elegans com Aeromonas dhakensis. Usar RW1596 vermes (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) no ensaio de necrose muscular de c. elegans com Aeromonas dhakensis.

3. ensaio de sobrevivência c. elegans com Aeromonas6,9

  1. No dia da propagação de worms de L1 no ENGM espalhando com Escherichia coli OP50, escolha uma única colônia de cada uma das quatro cepas de Aeromonas ou Escherichia coli OP50 e cultura com caldo LB 2 mL respectivamente em 37 ° C, durante 16 h.
    Nota: Para evitar contaminação, esta etapa deve ser executada em uma capa de fluxo laminar. Aqui, as seguintes estirpes bacterianas foram usadas: OP50 de Escherichia coli , a fonte de alimentação normal de C. elegans. A. dhakensis AAK1, o primeiro totalmente sequenciado patogénicos clínica dhakensis a. isolar. A. hydrophila A2-9307121 da . caviae , a. veronii A2-007 e A2-066 são isolados clínicos representativa do Nacional Cheng Kung University Hospital.
  2. Medir a absorvância de600 OD do caldo bacteriano e ajustar o caldo bacteriano para OD600 = 2.0 com caldo LB.
  3. Local e espalhar 30 µ l de caldo bacteriano cada placa NGM de 6 cm. Cultura as placas à temperatura ambiente durante a noite.
    Nota: Consulte a etapa 1.2 para a composição do meio NGM.
  4. No dia que os vermes L1 crescem para a fase de L4, aleatoriamente escolher e transferir 50 vermes para uma placa NGM com cada uma das quatro cepas de Aeromonas ou Escherichia coli OP50.
  5. Incube as placas NGM a 20 ° C até que esteja terminado o ensaio.
  6. Transferi todos os vermes vivos para uma placa NGM recém preparada com bactérias e contar os números da vivem, morto, e sensor worms todos os dias até o último worm está morto.
    Nota: Transferir vermes em uma chapa de NGM preparada fresca todos os dias para a manutenção da infecção, mesmo se usando minhocas estéril (por exemploBPL-4, ou com FudR).
  7. Traça as curvas de sobrevivência baseadas o cálculo diário de dados.

4. ensaio de toxicidade líquido c. elegans com Aeromonas7

Nota: Para evitar contaminação, as etapas devem ser executadas em uma capa de fluxo laminar.

  1. O dia após a semeadura os vermes de L1 na placa ENGM espalhar com Escherichia coli OP50, escolher uma única colônia de cada uma das quatro cepas de Aeromonas e e. coli OP50 e cultura com 5 mL caldo LB cada a 37 ° C durante 16 h.
    Nota: No protocolo, as seguintes estirpes de bactérias foram usadas: OP50 de Escherichia coli , a fonte de alimentação normal de C. elegans. A. dhakensis AAK1, o primeiro totalmente sequenciado patogénicos clínica dhakensis a. isolar. A. hydrophila A2-9307121 da . caviae , a. veronii A2-007 e A2-066 são isolados clínicos representativa do Nacional Cheng Kung University Hospital.
  2. Medir a absorvância de600 OD do caldo de bactérias.
  3. Centrifugue o caldo bacteriano em 3.500 x g durante 15 min remover o caldo LB. Resuspenda as bactérias e ajustar o caldo bacteriano para OD600 = 3.0 com média de S. Adicione 195 µ l de caldo bacteriano no meio de S para pelo menos 8 poços de uma placa de 96 poços.
    Nota: Consulte a etapa 1.6 para a composição do meio de S.
  4. Lave os vermes L4 na placa ENGM com Escherichia coli OP5 usando M9 médio. Ajustar a solução worm a uma concentração de 5 vermes por µ l e adicionar 5 µ l da solução de verme a cada poço da placa de 96 poços. Certifique-se de que existem aproximadamente 25 vermes por bem.
  5. Incubar a placa de 96 poços, um agitador a 200 rpm a 25 ° C.
  6. Contar o número de vermes vivos e vermes mortos após 24, 48 e 72 h. calcular as taxas de sobrevivência de cada poço com a seguinte fórmula: (vermes vermes ao vivo/Total) × 100%.
  7. Desenhe um gráfico de plotagem de dispersão com o cálculo de dados diários.

5. ensaio de necrose muscular c. elegans com Aeromonas6

Nota: Para evitar contaminação, estas etapas devem ser executadas em uma capa de fluxo laminar.

  1. No dia que os vermes L1 são semeados sobre o ENGM espalhar com Escherichia coli OP50, escolha uma única colônia de cada uma das quatro cepas de Aeromonas e e. coli OP50 e cultura com 2ml LB caldo cada a 37 ° C durante 16 h.
    Nota: Aqui, utilizaram-se os seguintes estirpes de bactérias: Escherichia coli OP50, a fonte de alimentação normal de C. elegans. A. dhakensis AAK1, o primeiro totalmente sequenciado patogénicos clínica dhakensis a. isolar. A. hydrophila A2-9307121 da . caviae , a. veronii A2-007 e A2-066 são isolados clínicos representativa do Nacional Cheng Kung University Hospital.
  2. Medir a absorvância de600 OD do caldo de bactérias e ajustar o caldo de bactérias para OD600 = 2.0 com caldo LB. Local e espalhar 30 µ l de caldo bacteriano em placas de 6 cm NGM. Cultura as placas à temperatura ambiente durante a noite.
  3. No dia os vermes L1 crescem para a fase de L4, transferência 50 vermes para cada placa NGM com cada uma das quatro cepas de Aeromonas ou Escherichia coli OP50. Incubar as placas NGM a 20 ° C. Transferência de vermes cada 24h para placas NGM recentemente preparadas com bactérias.
  4. Com imagens de músculo usando um microscópio de fluorescência.
    1. Escolha aleatoriamente 10 minhocas em um gel de agarose 2% médio e M9 em um slide. Paralise os vermes usando 2 µ l de azida de sódio 1% médio e M9 em agarose para menos de 5 min antes de tomar imagens.
    2. Coloque uma lamínula e capturar as imagens de músculo usando um verde proteína fluorescente (GFP) filtrar em um microscópio fluorescente com a câmera do dispositivo de carga acoplada. Capturar as imagens de músculo em 24, 48 e 72 h pós fase de L4.
  5. Realizar análise e figura preparação de imagem com uma software de processamento de imagem.
    Nota: As definições das pontuações e os níveis de dano do músculo são mostradas na Figura 3, para o qual os critérios são listados a seguir: 3 pontos por falta fibras musculares; 2 pontos para fibras de músculo rompidos ou quebrados; 1 ponto para dobrado fibras musculares; 0 pontos para fibras de músculo saudáveis.

6. estatísticas análises

  1. Todos os experimentos, independentemente realize um mínimo de três vezes.
  2. Use o método de Kaplan-Meier para avaliar os ensaios de sobrevivência de c. elegans e use o teste log-rank ao analisar as diferenças de sobrevivência. Conjunto de significância estatística em 0,05.
  3. Use o teste t de Student para analisar os resultados estatísticos dos ensaios de toxicidade líquido elegans do c. para os dois grupos diferentes. Use o teste de ANOVA One-Way em analisar as diferenças entre três ou mais valores para uma variável independente. Conjunto de significância estatística em 0,05.

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Resultados

Seguindo os protocolos descritos acima, é fácil diferenciar entre as toxicidades das quatro cepas de Aeromonas . O ensaio de sobrevivência de c. elegans é mostrado na Figura 1. Foram as taxas de sobrevivência de c. elegans infectados com espécies de Aeromonas , mostrados na ordem de cima para baixo: a. caviae, a. veronii, a. hydrophila e a. dhakensis. Embora haja diversidade em termos de toxicidade entre e...

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Discussão

C. elegans é um nematódeo bacterivorous que naturalmente bactérias aportes como alimento e desenvolveu uma complicado imunidade inata às bactérias durante o seu processo evolutivo. Dois dos principais órgãos manter e apoiar a imunidade são a epiderme e o intestino9,13. A epiderme e bandas do músculo de c. elegans assemelham-se as estruturas de tecidos moles em mamíferos e humanos6. Por causa destas características, c....

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos o apoio da instalação de núcleo de c. elegans em Taiwan e para o diagnóstico de Microbiologia e antimicrobiana resistência laboratório de Nacional Cheng Kung University Hospital para fornecer a Aeromonas Isola. Reconhecemos também o centro de genética de Caenorhabditis (CGC) e o WormBase. Agradecemos também a Savana Moore para editar o manuscrito.

Este estudo foi parcialmente suportado por concessões do Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan (mais 105-2628-B-006-017-MY3) e o Hospital da Universidade Nacional Cheng Kung (NCKUH-10705001) a paixao Chen.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Incubadora ShakerYIH DERLM-570RIncubadora de bactérias
K2HPO4J.T.BakerMP021519455Preparação do meio de cultura 
KH2PO4J.T.Baker3246-05Preparação do meio de cultura 
Na2HPO4J.T.BakerMP021914405Preparação do meio de cultura 
NaClSIGMA31434Preparação do meio de cultura 
MgSO4SIGMAM7506Preparação do meio de cultura 
ágarDifco214530Preparação de meio de cultura 
CaCl2SIGMAC1016Preparação do meio de cultura 
colesterolSIGMAC8503Meio de cultura preparado 
etanolSIGMA32205Preparação do meio de cultura 
KOHSIGMAP5958Preparação do meio de cultura 
Placa de Petri de 6 cmALPHA PLUS46preparação de placa de ágar
Placa de 96 poçosFALCON353072ensaio líquido
peptona bacterianaAffymetrix/USBAAJ20048P2Preparação do meio de cultura 
extrato de leveduraSIGMA92144Meio de cultura de preparação 
ácido cítrico• H2OSIGMAC1909Preparação do meio de cultura 
citrato de tri-potássio• H2OSIGMA104956Preparação do meio de cultura 
FudR SIGMA1271008Preparação do meio de cultura 
EDTA dissódicoSIGMAE1644Preparação do meio de cultura 
FeSO4• 7 H2OSIGMA215422Preparação do meio de cultura 
MnCl2• 4 H2OSIGMA221279Preparação do meio de cultura 
ZnSO4• 7 H2OSIGMA204986Preparação do meio de cultura 
CuSO4• 5 H2OSIGMAC8027Preparação do meio de cultura 
triptonaSIGMA16922Preparação do meio de cultura 
Sistema de microscópioNikon Eclipase Ti invertida Imagem microscópica
Câmera CCD CientíficaQImaging Retiga-2000R Fast 1394 Imagem microscópica

Referências

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