Multiplexação focada a estimulação de ultra-som com microscopia de fluorescência

Resumo

Estimulação de ultra-som pulsado da baixo-intensidade (U.S.P) é uma modalidade para a estimulação mecânica não-invasiva de células endógenas ou projetadas com alta resolução espacial e temporal. Este artigo descreve como implementar U.S.P para um microscópio de fluorescência-epi e como minimizar a incompatibilidade de impedância acústica ao longo do caminho de ultra-som para evitar artefatos mecânicos indesejáveis.

Resumo

Centrando-se pulsos de ultra-som de baixa intensidade que penetram os tecidos moles, U.S.P representa uma tecnologia promissora biomédica remotamente e com segurança manipular disparo neural, secreção hormonal e células reprogramadas geneticamente. No entanto, a tradução desta tecnologia para aplicações médicas atualmente é dificultada pela falta de mecanismos biofísicos pelo qual sentido de tecidos como alvo e responder a U.S.P. Uma abordagem adequada para identificar esses mecanismos seria usar biossensores ópticos em combinação com U.S.P para determinar subjacentes vias de sinalização. No entanto, implementar U.S.P a um microscópio de fluorescência pode introduzir artefatos mecânicos indesejáveis devido à presença de interfaces físicas que reflectem, absorvem e refratam ondas acústicas. Este artigo apresenta um procedimento passo a passo para incorporar U.S.P para microscópios comercialmente disponíveis na vertical epi-fluorescência, minimizando a influência das interfaces físicas ao longo do trajeto acústico. Um procedimento simples é descrito para operar um transdutor de ultrassom de elemento único e trazer a zona focal do transdutor para o ponto focal objectivo. O uso de U.S.P é ilustrado com um exemplo de transientes de cálcio U.S.P-induzida em células de glioblastoma humano culta medidas utilizando imagens de cálcio.

Introdução

Muitas doenças requerem alguma forma de intervenção médica invasiva. Estes procedimentos são muitas vezes caro, arriscado, requerem períodos de recuperação e, portanto, adicionar um fardo para sistemas de saúde. Modalidades terapêuticas não-invasivos têm potencial para fornecer alternativas mais seguras e mais baratas para procedimentos cirúrgicos convencionais. No entanto, as abordagens atuais não-invasiva como farmacoterapia ou transcraniana estimulação magnética frequentemente são limitadas pelo trade-offs entre a penetração do tecido, spatiotemporal resolução e efeitos indesejados fora do alvo. Neste contexto, um ultrasound focalizado constitui uma tecnologia prom....

Protocolo

1. cultivo de células em película de poliéster acusticamente transparente

1. Perfure um tamanho do furo de 12 mm no fundo de um prato de cultura padrão 35mm usando uma broca imprensa vertical. Mova a broca lentamente e use óculos de protecção. Retire os pedaços de plástico ligada ao fundo do prato usando uma lâmina para criar uma superfície lisa do lado externo (Figura 2).
2. Aplique uma camada fina de fuzileiro naval-grau epóxi ou cola na superfície externa do fundo do prato.
3. Coloque uma película de poliéster (2,5 µm de espessura) contra a superfície externa do fundo do prato e pressione firmemente para certificar....

Resultados

A Figura 5 é um exemplo de experimento U.S.P multiplexado com imagem de cálcio. Células de glioblastoma (A-172) foram cultivadas em película de poliéster EMPM revestido em meio de cultura padrão (suplementado com 10% de soro e 1% de antibióticos) e incubadas com o repórter fluorescente sensíveis ao cálcio Fluo-4 AM. As células foram fotografadas usando uma lente de imersão 10 X e iluminado com uma fonte de luz branca LED e luz de fluorescência foi coletado us.......

Discussão

A principal vantagem do ultrasound focalizado é sua capacidade de forma não-invasiva entregar a energia mecânica e/ou térmica para amostras biológicas com alta precisão espácio-temporais. Outras técnicas destinadas a estimular mecanicamente as células geralmente empregam invasiva sondas físico (por exemplo, célula-cutucando) ou requer a interação dos feixes de laser de alta energia com objectos estranhos (por exemplo, Pinça óptica). Aquecimento magnético pode aquecer locais geográficos específicos dentr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
microscópio vertical com grande volume de trabalho	Thorlabs	CERNA
microscópio vertical com grande volume de trabalho	Scientifica	SliceScope
	Thorlabs	n/a
hidrofone de agulha	ONDA Corporation	Série HNP/C/R/A/T + AH/G pré-amplificador
hidrofone	de agulha Precisão Hidrofone	Acústica n/a
	ONDA Corporation	Hidrofone de
	Precision Acoustics	n/a
osciloscópio	Keysight Technology	DSOX2004A (4 canais 70MHz)
Amplificador	RF Keysight Technology	33500B (20MHz monocanal)
	Indústrias de Navegação Eletrônica (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
Amplificador de potência RF	Eletrônica e Inovação (E& I)
transdutor de ultrassom	de imersão Transdutores de imersão focados	Olympus
de ultrassom de imersão Instrumento	Benthowave	Transdutor HiFu Série
Transdutor de ultrassom de imersão	Transdutores piezocerâmicos ou HiFu
de ultrassom de imersão	Ultrassônico-S-lab	Transdutores HiFu feitos sob encomenda
Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Mylar de alta densidade filme 2,5 mícrons	Chemplex	CAT.NO:107

Componentes optomecânicos de fibra óptica fibra óptica série HFO Gerador de funções de potência transdutor BII-76 Acústica de precisão Transdutor