Artigo de método

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

DOI:

10.3791/58790

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17 de janeiro de 2019

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1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para gerar clones de células de câncer que contém uma marca de sequência MS2 em um único subtelomere. Esta abordagem, baseando-se no sistema MS2-GFP, permite a visualização de transcrições endógenas de oligospermia repetição contendo RNA (TERRA) expressado de um único dos telômeros em células vivas.

Resumo

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Telômeros são transcritas, dando origem a oligospermia repetição-contendo o tempo não-codificante RNAs (TERRA), que têm sido propostos para desempenhar um papel importante na biologia do telômero, incluindo formação de heterocromatina e homeostase do comprimento dos telômeros. Descobertas recentes revelaram que as moléculas TERRA também interagirem com regiões cromossômicas internas para regular a expressão gênica em células-tronco embrionárias (ES) do mouse. Em consonância com esta evidência, RNA fluorescência em situ hibridização RNA-análises mostraram que somente um subconjunto de TERRA transcrições localizar nas extremidades do cromossomo. Uma melhor compreensão da dinâmica das moléculas da TERRA ajudará a definir sua função e mecanismos de ação. Aqui, descrevemos um método para rotular e visualizar as transcrições TERRA single-telômero nas células cancerosas, usando o sistema MS2-GFP. Para este objetivo, apresentamos um protocolo para gerar clones estáveis, usando a linhagem de células de câncer de estômago humano AGS, contendo sequências MS2 integradas em um único subtelomere. Transcrição de TERRA do telômero MS2-tag resulta na expressão de moléculas TERRA MS2-marcados que são visualizados por microscopia de fluorescência de viver-pilha sobre co expressão de uma proteína RNA MS2-fundida a GFP (MS2-GFP). Esta abordagem permite aos pesquisadores estudar a dinâmica de moléculas TERRA single-telômero nas células cancerosas, e pode ser aplicado a outras linhas de célula.

Introdução

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O tempo não-codificante TERRA de RNA é transcrito da região subtélomérique dos cromossomos e sua transcrição prossegue em direção as extremidades do cromossoma, encerra-se no âmbito do trato repetição oligospermia1,2. Por esta razão, transcrições TERRA consistem em sequências de derivados de subtelomeric na sua extremidade 5' e encerrar com repetições teloméricas (UUAGGG em vertebrados)3. Importantes funções têm sido propostos para a TERRA, incluindo a formação de heterocromatina telômeros4,5, DNA replicação6, promovendo uma recombinação homóloga entre cromossomo termina7,8 , 9, regulamenta o telômero estrutura10e telômero comprimento homeostase2,11,12,13. Além disso, transcrições TERRA interagirem com inúmeros locais de extratelomeric para regular a expressão gênica generalizada em rato de células estaminais embrionárias (ES)14. Em consonância com estas provas, RNA fluorescência em situ da hibridação análises (RNA-FISH) têm demonstrado que somente um subconjunto de transcrições TERRA localizar ao telômeros1,2,15. Além disso, a TERRA tem sido relatado para agregados nucleares de forma localizando nos cromossomos X e Y em células de rato2,16. Estes resultados indicam que as transcrições TERRA sofrer uma dinâmica complexa dentro do núcleo. Compreensão da dinâmica das moléculas da TERRA ajudará a definir sua função e mecanismos de ação.

O sistema MS2-GFP tem sido amplamente utilizado para visualizar moléculas de RNA em células vivas de vários organismos17,18. Este sistema tem sido anteriormente usado para tag e Visualizar moléculas TERRA single-telômero em S. cerevisiae12,19. Usando este sistema, recentemente foi demonstrado que as transcrições TERRA de levedura localizar dentro do citoplasma durante a fase de mudança de post-diauxic, sugerindo que a TERRA pode exercer funções extranuclear20. Recentemente nós usamos o sistema MS2-GFP estudar transcrições TERRA single-telômero em células de câncer21. Para este objectivo, que empregou a ferramenta de edição de genoma CRISPR/Cas9 integrar MS2 sequências em um único telômero (telômero 15q, doravante Tel15q) e obtidos clones expressando MS2-tag endógena Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones). Co a expressão de uma proteína GFP-fundido MS2 RNA-obrigatórias (MS2-GFP) que reconhece e liga MS2 RNA sequências permite visualização de transcrições TERRA single-telômero na vida células21. O objetivo do protocolo ilustrado aqui é descrever em detalhe os passos necessários para a geração de clones de TERRA-MS2.

Para gerar TERRA-MS2 clones, uma gaveta MS2 é integrada dentro da região de subtélomérique do telômero 15q, a jusante do TERRA promotor região e transcrição iniciar site. A MS2 gaveta contém um gene de resistência de neomicina ladeado por sites de salmão fumado-p, e sua integração no subtelomere 15q é executada usando o sistema CRISPR/Cas922. Depois de Transfeccao de gaveta, única clona o MS2 são selecionados e subtélomérique integração da fita é verificada pelo PCR, DNA, sequenciamento e Southern blot. Clones positivos estão infectados com um vírus adenoide Cre-expressando a fim de remover o marcador de seleção na gaveta, deixando apenas as sequências MS2 e um site único lox-p no subtelomere 15q. Expressão de transcritos TERRA MS2-tag de Tel15q é verificada por RT-qPCR. Finalmente, a proteína de fusão MS2-GFP é expressa em TERRA-MS2 clones através de infecção retroviral para visualizar as transcrições MS2-TERRA por microscopia de fluorescência. Transcrições TERRA podem ser facilmente detectadas por RNA-peixe e imagem latente da viver-pilha usando específicas repetição oligospermia sondas1,2,15,23. Estas abordagens fornecem informações importantes sobre a localização da população total de moléculas TERRA em resolução de célula única. A geração de clones contendo MS2 sequências em um único subtelomere permitirá aos pesquisadores estudar a dinâmica de transcrições TERRA single-telômero em células vivas, o que ajudarão a definir a função e os mecanismos de ação da TERRA.

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Protocolo

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1. Seleção de Clones resistentes de neomicina

  1. Desenvolvem-se células AGS no meio de F-12_K do Ham (do Kaighn) suplementado com 10% de soro bovino Fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de meio) e estreptomicina (0,2 µ g / mL de meio) a 37 ° C e 5% de CO2. Transfect as células em uma confluência de 50-60% com a sgRNA/Cas9 expressando o vetor e o cassette MS2 em um 01:10 razão molar21.
    Nota: Em um experimento paralelo, verificar eficiência do transfection transfecting um vetor GFP-expressando (i.e., Cas9-GFP vetor). Pelo menos 60-70% de eficiência de transfeccao deve ser alcançado.
  2. No dia seguinte, substitua o meio de cultivo com meio contendo neomicina na concentração final de 0,7 µ g/mL (meio selectivo).
    Nota: Divisão das células e semeadura-los em meio seletivo no dia seguinte a transfeccao irá acelerar o processo de seleção. Todas as células transfectadas não morrerão imediatamente. Se transfeccao é executado em 6 pratos bem, caso em que cada poço em um 60% confluência conteria aproximadamente 0,7 x 106 células, no dia seguinte que as células podem ser divididas de um único poço para um meio selectivo contendo prato de 10 cm.
  3. Manter as células em meio seletivo para 7-10 dias, alterando o meio de cada um ou dois dias, até o clona single são visíveis.
  4. Colheita de clones de células
    1. Prepare um prato bem 96 contendo 10 µ l de tripsina 0,25% em cada poço.
      Nota: Preparar dois 96 placas bem no caso de mais de 96 clones são esperados para ser escolhido.
    2. Com o uso de um microscópio, marca a posição de cada clone visível no prato 10cm, tornando um ponto na parte inferior do prato usando um marcador. Cada ponto corresponderá a uma colônia a ser escolhido.
    3. Substitua o meio de cultivo com suficiente fosfato tamponado salino (PBS) para formar uma fina película de líquido sobre os clones e não deixar que as células a seco durante a colheita de clone.
    4. Escolha colônias simples usando uma pipeta de 10 µ l. Coloque a ponta contendo 5 µ l de tripsina à colônia e libere lentamente a tripsina que continuará a ser localizada na colônia. Permitir que a tripsina separar as células por 1 min, em seguida, raspar a colônia com a ponta e chupa-lo na ponta.
      Nota: Durante este procedimento, invertendo o prato um pouco de um lado assim diminuir o volume de PBS em torno da colônia ser escolhido vai ajudar o processo de colheita, evitando a diluição da tripsina em torno da colônia. Usar um anel de clone também pode ajudar a pegar clones único.
    5. Coloque as células da colônia em um poço da placa de 96 bem, contendo 10 µ l de tripsina 0,25%.
    6. Incubar a 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, encher o poço com 150 µ l de meio seletivo (média F - 12K do Ham (do Kaighn) suplementado com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de meio), estreptomicina (0,2 µ g / mL de meio) e contendo neomicina no uma concentração de 0,7 µ g/mL.
      Nota: Durante o tempo de incubação outros clones podem ser selecionados. É recomendável escolher clones tantos quanto possível. Os clones mais são colhidos maior será as chances de identificar os positivos.
    7. Uma vez que todos os clones são escolhidos e transferidos em placa de 96 bem, permitem que as células a crescer durante alguns dias em meio seletivo F - 12K do Ham (do Kaighn) suplementado com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de meio), estreptomicina (0,2 µ g / mL do meio) e contendo neomicina em concentrações de 0,7 µ g/mL em 37 ° C e 5% CO2, até alcançar a confluência de 90%.
  5. Separação dos clones
    1. Preparar três 96 placas bem revestidas com gelatina por adicionar 100 µ l de gelatina por alvéolo, incube durante 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, lave duas vezes com PBS. Estas placas serão usadas para a extração de DNA (placa de DNA) e para clone congelamento (placas de congelamento).
      Nota: Gelatina promoverá a fixação das células e do DNA aos poços. Em particular, o revestimento de gelatina permitirá o DNA para pôr no fundo dos poços durante a extração de DNA e lavar os procedimentos (discutidos abaixo). Durante o procedimento de divisão de clone, é aconselhável usar uma pipeta multicanal.
    2. Assim clones atingem 90% confluência, Aspire o meio de cada poço da placa de 96 bem, lave com PBS, adicionar 30 µ l de tripsina 0,25% por bem e incubar durante 5 min a 37 ° C.
      Nota: Clones crescerá em taxas diferentes, o que também dependerá do número de células escolhido por clone. Assim, esta etapa será realizada durante os dias quando os clones diferentes alcançar confluência de 90%.
    3. Adicionar 70 µ l de meio seletivo por alvéolo, perturbar aglomerados de células pipetando para cima e para baixo dentro dos poços e, em seguida, transferir 30 µ l da 100 µ l para a placa de DNA gelatinizada pré-carregadas com 120 µ l de meio seletivo por bem e 30 µ l para a sagacidade pré-carregadas gelatinizado de congelação placas meio de h 50 µ l (sem seleção).
    4. Coloque a placa de DNA na incubadora e permitir que as células a crescer a 37 ° C e 5% de CO2 até confluência de 90%.
    5. Adicione 80 µ l de gelado acabadas 2x congelamento médio (80% FBS e 20% dimetilsulfóxido (DMSO)) para cada poço da placa de congelamento, adicionar parafilm (pulverizado com 70% de etanol) em cima da placa para selar cada poço, coloque a tampa por cima e enrole a placa com folha de alumínio. Colocar as placas de congelamento a-80 ° C.
    6. Adicione 90 µ l de meio seletivo por alvéolo para a placa bem 96 original contendo os clones que foram separados e mantém-lo em cultura até PCR resultados de rastreio. Esta placa será usada como placa de backup.

2. seleção de Clones resistentes de neomicina

  1. Extração de DNA da placa de DNA bem de 96.
    1. Uma vez que os clones cultivados na placa ADN alcançar 90% confluência, lave 2 vezes com PBS e, em seguida, lyse com 50 µ l do lysis (10 mM Tris pH 7.5, 10 mM de EDTA, 10 mM de NaCl, SDS 0,5% e 1 mg/mL da protease K). Cubra o prato com parafilm, lacrar cada poço, colocar a tampa, cubra com película aderente e coloque a 37 ° C durante a noite.
    2. Adicione 100 µ l de etanol frio (Et-OH) / solução de NaCl (0,75 M de NaCl em 100% de etanol) para cada um bem e precipitar para 6 h ou durante a noite em temperatura ambiente.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
    3. Remover a solução de NaCl/Et-OH invertendo-se o prato e lavar 3 vezes com 200 µ l de etanol 70% por poço.
    4. Adicione 25 µ l de solução de RNAse A em água destilada e incubar a 37 ° C, durante 1 h.
  2. Use 3 µ l de DNA genômico para amplificação por PCR. Realize triagem de PCR dos clones selecionados usando as primeiras demão recozimento dentro do gene de resistência de neomicina e subtelomere 15q. Amplificação por PCR é realizada usando enzimas polimerase padrão e de protocolos PCR21.
    Nota: As condições PCR para MS2 primers (cartilha MS2-subtel15q-cartilha-S e MS2 como) e as primeiras demão CTR (prime CTR S e CTR primer como) são as seguintes: 98 ° C por 20 s como etapa da desnaturação e então 34 ciclos de 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, 72 ° C 15 s , utilizando a enzima polimerase em um 25 µ l reação misturar (ver Tabela de materiais). Sequências da primeira demão são indicadas na tabela 1.
  3. Executar as reações de PCR em gel de agarose e extrair faixas PCR obtidas de clones positivos usando procedimentos de extração padrão do gel (consulte Tabela de materiais para reagentes de extracção de gel).
  4. Realizar análises de sequenciamento de DNA do produto gel-extraído do PCR para confirmação da presença do MS2 sequências21.
    Nota: As análises de sequenciamento podem ser realizadas utilizando os primers utilizados para o rastreio de PCR.
  5. Borrão do Sul seleção de clones positivos de PCR
    1. Crescem os clones positivos na PCR e rastreio de sequenciamento da placa bem 96 original (a placa de backup) para 6 placas bem no meio F - 12K do Ham (do Kaighn) suplementado com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de meio), estreptomicina (0,2 µ g por mL de meio) e contendo neomicina em uma concentração de 0,7 µ g/mL em 37 ° C 5% CO2.
      Nota: Como alternativa, se alguns destes clones foram perdidos, descongelá-los de uma das placas de congelamento (ver protocolo 2.6).
    2. Uma vez que os clones estão na confluência de 90% em 6 placa bem, lavar as células com PBS e adicionar 250 µ l de tampão de Lise contendo 0,5 µ g proteinase K por bem.
    3. Raspar as células com uma espátula de célula e transfira o lisado em um tubo de 1,5 mL.
    4. Incube a 37 ° C, durante 16 h.
    5. Adicione 1 mL de etanol a 100%, agitar vigorosamente e permitir que o DNA precipitar a pelo menos 2 h ou durante a noite a-20 ° C.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
    6. Girar a 13.400 x g a 4 ° C por 10 min, desprezar o sobrenadante e lavar as pelotas com etanol a 70%. Deixe o ar de pelotas secar à temperatura ambiente. Como alternativa, use um concentrador a vácuo.
    7. Resuspenda as pelotas de DNA em 50 µ l de água destilada contendo RNAse A e incubar durante 1 h a 37 ° C.
    8. Digeri a 5-10 µ g de DNA genômico, usando enzimas de restrição NcoI e BamHI (duas digestões independentes) em volume de reação de 100 µ l, incubando-se as reações de digestão a 37 ° C durante a noite.
    9. Execute 4 µ l da digestão em gel de agarose (agarose 0,8%) para confirmação de digestão completa.
    10. Adicionar o volume de 1/10 de sódio acetato 3M solução pH 5.2 e 2 volumes de etanol 100% para as reações de digestão de restrição e incubar a pelo menos 2 h ou durante a noite a-20 ° C para precipitar o DNA.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
    11. Centrifugar a 13.400 x g a 4 ° C por 20 min, descartar os sobrenadantes e lavar as pelotas com etanol a 70%. Permitir que as bolinhas de ar seco à temperatura ambiente. Como alternativa, use um concentrador a vácuo.
    12. Resuspenda pelotas em 20 µ l de água destilada e carregar o DNA digerido em um gel de agarose 0,8%.
      Nota: Para uma melhor resolução do DNA digerido, preparar um gel de pelo menos 15 cm longo e correr durante a noite em baixa tensão (volts ̴30). A eletroforese configurado deve ser otimizada.
    13. No dia seguinte, manchar o gel com um agente de rotulagem de DNA, como o brometo de etídio em concentração final de 1 µ l/10 mL, durante 30 min à temperatura ambiente e tirar uma foto com uma régua perto o gel em um gel de instrumento de imagem.
    14. Definir a transferência do DNA para uma membrana de nylon e executar hibridização de membrana com uma sonda de sequência específica MS2 utilizando procedimentos padrão21.
    15. Descongele os clones que dão resultados positivos na PCR, DNA, sequenciamento e sul da mancha de um dos dois pratos congelamento (ver próximo passo).
  6. Descongelamento de clones
    1. Prepare um tubo de 15 mL contendo 5 mL de pré-aquecido Ham F - 12 K médio (do Kaighn) suplementado com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de meio) e estreptomicina (0,2 µ g / mL de meio) para cada clone ao ser descongelado.
    2. Remover uma das placas de congelamento de-80 ° e adicionar 100 µ l de meio completo de F12K previamente aquecido para o bem que contenham o clone positivo ao ser descongelado.
      Nota: Este procedimento deve ser realizado rapidamente e a placa bem 96 deve ser colocado em gelo seco depois de cada clone é descongelado, a fim de permitir que os outros clones permanecem congelados. Isto é particularmente importante se vários clones precisam ser descongelados do mesmo prato bem 96.
    3. Transferi as células para o tubo de 15 mL contendo 5 mL de meio e centrifugar 800 x g por 5 min à temperatura ambiente.
    4. Aspire o meio, Ressuspender as células em 500 µ l de pré-aquecido meio F12K completo e transferir cada clone de um único poço de uma placa bem 12.
  7. Eliminação do gene de resistência a neomicina a cassete MS2 integrado no subtelomere 15q.
    1. Permitir que os clones crescer a partir de uma placa bem 12 para um prato de 10cm no meio F12K completo.
      Nota: Neomicina não deve ser incluída no meio salvo indicação em contrário.
    2. Adicione o adenovírus Cre-expressando as células cultivadas em um prato de 10 cm na confluência de 70% em 10 mL de meio F12K completo.
      Nota: Usar um adenovírus expressando GFP-Cre permitirá a avaliação da eficiência de infecção, que deve abordar a 100%. O adenovírus de replicação com defeito serão perdidos após poucas passagens em cultura.
    3. 48 horas após a infecção, dividi as células em três pratos de 10 cm. Dois pratos serão usados para verificação da remoção gene neomicina pela seleção negativa, crescendo as células contendo neomicina médio (primeiro prato) e por Southern blot (segundo prato).
    4. Cultura o terceiro prato contendo o clone para congelamento de células e extração do RNA.

3. verificação da TERRA-MS2 transcrição expressão por RT-qPCR

  1. Após verificação da remoção de gene de neomicina, realize a extração de RNA total de clones de TERRA-MS2 utilizando solventes orgânicos (solução de fenol e guanidina isothiocynate)21.
    1. Ressuspender o RNA extraído de um prato de 10 cm em 100 µ l de água de pyrocarbonate (DEPC) dietílico.
    2. Execute 3 µ l de RNA em um gel de ácido (MOPS) de propanossulfónico de 3-(N-Morpholino) 1 x denaturating (1% formaldeído contendo) a fim de verificar a integridade do RNA e concentração. Também analise a concentração do RNA usando um espectrofotômetro.
    3. Tratar de 3 µ g de RNA com DNAse I usando 1 unidade de DNAse eu enzima em volume de reação final 60 µ l.
    4. Incubar a reação de 1 h a 37 ° C.
  2. Inverter a reação e qPCR análises de transcrição
    1. Adicione os seguintes componentes para um tubo de microcentrifugadora nuclease-livre: 2 µ l de uma 1 µM TERRA específica da primeira demão, 1 µ l de dNTPs mix (10 mM cada), 6 µ l de RNA tratei de DNAse (correspondente a ̴300ng do RNA). Ajuste o volume para 13 µ l com 4 µ l de água DEPC.
      Nota: Para cada RNA a analisar, um segundo tubo contendo os mesmos reagentes mas uma cartilha de referência específico, em vez de primer específico de TERRA, deve estar preparado.
    2. Aqueça a mistura a 65 ° C por 5 min e incubar no gelo pelo menos 1 min.
    3. Recolher o conteúdo dos tubos por centrifugação breve e adicionar 4 µ l da enzima 5 X RT Buffer, 1 µ l 0,1 M ditiotreitol (DTT), 1 µ l (4 unidades) de inibidor de RNAse e 1 µ l de transcriptase reversa (ver Tabela de materiais).
    4. Incubar as amostras a 42 ° C por 60 min, em seguida, usar 2 µ l da reação de RT para análises de qPCR.
  3. Prepare a mistura de reação qPCR em um volume final de 20 µ l, consistindo de 10 µ l de mistura de mestre 2 x qPCR, 2 µ l de cDNA modelo, 1 µ l de primer para a frente (10 µM), 1 µ l de primer reverso (10 µM) e 6 µ l de água.
  4. Execute qPCR reação em um thermocycler usando protocolos padrão21.

4. produção de um retrovírus expressando de MS2-GFP

  1. Para gerar o retrovírus expressando MS2-GFP, transfect células de empacotamento de Fênix confluente 80% com uma proteína de fusão MS2-GFP expressando vector retrovírus (PURO pBabe-MS2-GFP) e um gene env expressando vetor (como pCMV-VSVG), utilizando uma relação molar de 4:1 de os dois vetores.
  2. No dia seguinte, substitua o cultivo suplementado (DMEM com 10% FBS, 2 mM L-glutamina e caneta/Strep) fresco médio butirato de sódio de 10mM que contém.
  3. Incubar durante 8 h a 37 ° C, 5% de CO2, em seguida, substituir o medium com meio de cultivo fresco do qual o vírus será recolhido.
  4. Após 48 h, retire o meio de retrovírus contendo as células de Fênix. Este meio pode ser usado diretamente para a infecção de clones de TERRA-MS2, caso em que filtrar o meio através de um filtro de 0,45 µm, adicionar polybrene (concentração final de 30 µ g/mL) e adicioná-lo para as células (no caso o protocolo continua no passo 5). Alternativamente, retrovírus podem ser precipitado em um tubo falcon de 50ml adicionando o volume de 1/5th de 50% PEG-8000/900 mM solução de NaCl e incubar durante a noite a 4 ° C em uma roda de rotator.
  5. No dia seguinte, partículas de retrovírus pelota por centrifugação a 2.000 x g, durante 30 minutos, remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em meio F12K sem soro.
    Nota: As partículas de vírus podem ser resuspended em 1/100 deth do volume sobrenadante original. Testes de infecção devem ser realizada a fim de verificar o volume mínimo de retrovírus necessários para infectar eficientemente as células.

5. visualização de TERRA-MS2 transcritos em células vivas

  1. Placa TERRA-MS2 clones e células WT AGS em pratos com fundo de vidro. No dia de infecção, adicione polybrene para o meio (concentração final de 30 µ g/mL) e o retrovírus expressando MS2-GFP.
  2. Depois de 24 horas, descarte o meio contendo vírus e adicionar meio fresco sem vermelho de fenol.
  3. Analise as células em um microscópio invertido usando a configuração de microscópio apropriado. Imagem 60 X objetivo, com grande abertura numérica (1.4 X) e usando uma câmera sensível (EMCCD) ou as células com 100 X. Use um sistema de controle ambiental para manter as amostras em 37 ° C e 5% de CO2 durante a imagem latente.

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Resultados

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Figura 1 representa uma visão geral da estratégia experimental. As principais etapas do protocolo e um calendário indicativo para a geração de clones de TERRA-MS2 em células AGS são mostradas (Figura 1A). No dia 1, vários poços de uma placa bem 6 são transfectados com o MS2 gaveta e sgRNA/Cas9 expressando vetores (mostrados na Figura 1B). Duas sequência...

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Discussão

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Neste artigo, apresentamos um método para gerar clones de célula de câncer humano contendo sequências MS2 integradas dentro subtelomere 15q. Usando estes clones, as moléculas TERRA MS2-tag transcritas do subtelomere 15q são detectadas por microscopia de fluorescência pela expressão co de uma proteína de fusão MS2-GFP. Esta abordagem permite aos pesquisadores estudar a dinâmica da TERRA, expressado de um único dos telômeros em vida células21. Neste protocolo, TERRA-MS2 clones são selecionados na li...

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Divulgações

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Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somos gratos ao pessoal da instalação de imagem avançada do CIBIO para a Universidade de Trento e a facilidade de microscopia de luz de BioOptics na F. Max Perutz laboratórios (MFPL) em Viena. A pesquisa que conduz a estes resultados tem recebeu financiamento da Stiftung Mahlke-Anderson e o sétimo programa-quadro da União Europeia para a investigação, desenvolvimento tecnológico e demonstração no âmbito do acordo de concessão não 609431 CE. CE é apoiado por uma bolsa de Rita Levi Montalcini do Ministério da Educação Universidade e pesquisa (MIUR) italiano.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células AGS-Presente de Christian Baron (Université de Montré al).
Mistura de Nozes F12K 1XGIBCO21127022Meio de Cultura para células AGS
L-Glutamina CORNINGMT25005CIComponente do meio de cultura celular
Solução de estreptomicina penicilinaCORNING30-002-CIComponente do meio de cultura
Soro fetal bovinoSigma AldrichF2442Componente do meio de cultura celular
DMEM 1XGIBCO21068028meio de cultura para célula fênix
CaCl2Sigma AldrichC1016usado na transfecção de células fênix
HEPESSigma AldrichH3375usado na transfecção de células fênix (solução HBS)
KClSigma AldrichP9333usado na transfecção de células fênix (solução HBS)
DextroseSigma AldrichD9434usado na transfecção de células fênix (solução HBS)
NaClSigma AldrichS7653usado na transfecção de células fênix (solução HBS) e precipitação de retrovírus
Na2HPO4Sigma AldrichS3264usado na transfecção de células fênix (solução HBS)
SOLUÇÃO DE TRIPSINA EDTA 1XCORNING59430Cusado em divisão celular
DPBS 1XGIBCO14190250Solução salina tamponada com fosfato
DMSODulbecco Sigma AldrichD8418Componente do meio de congelamento celular (80% FBB e 20% DMSO)
G-418 DissulfatoPara o meioG4185seleção de medicamento para 
Solução de gelatina BiorreagenteSigma AldrichG1393cotaing de placa de DNA de 96 poços e placa de congelamento
Tris-baseFisher BioReagents10376743Componente do tampão de lise celular para extração de DNA genômico
EDTASigma AldrichE6758Componente do tampão de lise celular para extração de DNA genômico
SDSSigma Aldrich71729Componente do tampão de lise celular para extração de DNA genômico
Proteinase KThermo FisherAM2546Componente do tampão de lise celular para extração de DNA genômico
RNAse AThermo Fisher12091021Degradação do RNA durante a extração de DNA
AgaroseSigma AldrichA5304Preparação de gel de DNA
Atlas ClearSightBioatlasBH40501Reagente de coloração usado para detectar amostras de DNA e RNA em etanol de gel de agarose
BioReagentes Fisher BP28184precipitação de DNA
Acetato de Sódio Sigma Aldrich71196Usado para precipitação de DNA a uma concentração de 3M pH5.2
Wizard SV Gel e sistema de limpeza de PCRPromegaA9282Extração de fragmentos de PCR do gel de agarose durante a triagem de PCR de clones positivos para neomicina
TrizolAMBION15596018Solvente orgânico usado para extração de RNA
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836degradação do DNA genômico do RNA 
dNTPs mixInvitrogen10297018usado em reações RT e PCR
DTTInvitrogen707265MLusado em reações
RT dietil pirocarbonatoSigma AldrichD5758usado para inativar RNAs em água (diluição 1:1000)
RibolockThermo FisherEO0381inibidor de RNase
MOPSSigma AldrichM9381preparação de gel de RNA
ParaformaldeídoMicroscopia Eletrônica Sciences15710preparação de gel de RNA desnaturante (1% PFA em 1x MOPS)
Sobrescrito III Transcriptase reversaInvitrogen18080-093Reação de retrotranscrição
Pfu DNA polimerase (recombinante)Thermo ScientificEP0501Reação de PCR
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR BIOSYSTEMSPB 20.14reação qPCR
Cre-GFP adenovírushttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTusado para infectar clones TERRA-MS2 a fim de remover o gene neomycn
Butirato de sódioSigma AldrichB5887usado para promover a produção de partículas de retrovírus em células de fênix
PEG8000Sigma Aldrich89510Precipitação de partículas de retrovírus
35µ-Dish Glass BottomIbidi81158usado em análises de imagens de células vivas de clones TERRA-MS2
celular

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548(2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114(2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220(2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268(2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910(2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379(2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714(2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

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