Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Sammensætning og Distribution analyse af Bioaerosols Under forskellige miljøforhold

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58795
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 1
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University
* These authors contributed equally

Summary

Forståelse af miljømæssige partikler biologiske sammensætning er vigtige for studiet af dens betydelige virkninger på menneskers sundhed og sygdom spredes. Her, brugte vi tre typer af bioaerosol prøvetagningsmetoder og en biologisk analyse af luftbårne mikrober til at bedre udforske luftbårne mikrobielle samfund under forskellige miljøforhold.

Abstract

Variabel mikroorganismer partikler (PM) under forskellige miljøforhold kan have betydelige virkninger på menneskers sundhed. I denne undersøgelse, vi beskrevet en protokol for flere analyser af de biologiske kompositioner i miljømæssige PM. fem forsøg er præsenteret: (1) PM nummer overvågning ved hjælp af en laser partikel counter; (2) PM samling ved hjælp af en Cyclon aerosol sampler; (3) PM samling ved hjælp af en høj-volumen luft sampler med filtre; (4) bestemmelse mikrober samling af Andersen seks-trins sampler; og (5) påvisning af biologiske sammensætning af miljømæssige PM af bakterielle 16SrDNA og svampe ITS region sekventering. Vi udvalgte disede dage og en kvæg gård som to typiske eksempler på anvendelsen i denne protokol. I denne undersøgelse, disse to prøvetagningsmetoder, Cyclon aerosol sampler og filter sampler, viste forskellige stikprøver effektivitet. Cyclon aerosol sampler udføres meget bedre med hensyn til at indsamle bakterier, mens disse to metoder viste samme effektivitet i indsamling af svampe. Filter prøvetagere kan arbejde under lave temperaturforhold mens Cyclon aerosol prøvetagere har en prøveudtagning begrænsning for temperatur. En solid påvirker sampler, såsom en Andersen seks-trins sampler, kan bruges til at prøve bioaerosols direkte ind i substratet, hvilket øger overlevelsesraten bestemmelse af antal mikroorganismer. Men denne metode primært bygger på kultur mens mere end 99% af mikrober ikke kan være kulturperler. DNA ekstraheret fra bestemmelse bakterier indsamlet af Andersen seks-trins sampler og prøver indsamlet af Cyclon aerosol sampler og filter sampler blev opdaget af bakteriel 16S rDNA og svampe ITS region sekventering. Alle ovennævnte metoder kan har bred anvendelse inden for mange områder med, såsom miljøovervågning og luftbårne patogen detektion. Fra disse resultater, kan vi konkludere, at disse metoder kan bruges under forskellige forhold og kan hjælpe andre forskere at udforske sundhedsvirkningerne af miljømæssige bioaerosols.

Introduction

I naturlige miljøer findes forskellige former for mikroorganismer i bioaerosols, herunder svampe, bakterier, virus og andre mikroorganismer1. Luftbårne mikroorganismer, der kan udledes fra nogle menneskelige aktiviteter såsom dyrs fodring operationer i husdyrbrug, er de vigtigt indhold af atmosfærisk miljø2. Disse mikroorganismer kan ikke kun spille en vigtig rolle i atmosfærisk miljø men også har betydelige virkninger på menneskers sundhed og sygdomme spredes.

Som et vigtigt middel til spredning af sygdomme, mikrobielle aerosoler har tiltrukket sig bred opmærksomhed i hele verden. I nyere undersøgelser, blev mange menneskelige sygdomme fundet for at være forbundet med den komplekse sammensætning af miljømæssige partikler (PM) forskellige steder, som kemiske fabrikker, husdyrbrug og smoggy byer3,4. Den biologiske sammensætning af PM kan bidrage til nogle luftvejssygdomme og hjerte-kar-sygdomme i PM-eksponerede mennesker5. Forskellige kroppen regioner, såsom slimhinde, huden, mave-tarmkanalen og luftveje, kan være potentielle mål af mikrober knyttet til PM6,7. En øget risiko for lungekræft kan være forårsaget af langvarig udsættelse for PM2,58.

Luftbårne bakterier er blevet undersøgt på forskellige steder i flere lande rundt om i verden, herunder i metrostationer, veterinære hospitaler, slagterier, kompostering faciliteter, garverier, mælk behandlingsanlæg, kulminer, tandklinikker og indendørs miljøer9,10,11,12,13,14,15,16,17, generere en stort antal rapporter om biologiske aerosoler. Overfyldte steder forbundet med universiteter, husdyr gårde og storbyer under disede dage er tre særligt vigtige offentlige betingelser, skal vi undersøge forbindelserne mellem menneskers sundhed og de potentielle virkninger af PM eksponering. Desuden, i løbet af vinterdage i de nordlige byer i Kina, høj PM2.5 værdier kan påvirke menneskers sundhed. Selvom PM2.5 kan generere toksiske virkninger ved at målrette respiratorisk overflader og opløse i blod18, er det stadig ikke klart, hvorvidt og hvordan de mikrober, der er knyttet til PM2.5 potentielt kan påvirke menneskers sundhed19 ,20. Husdyrbrug er en af de vigtigste kilder til PM og mikrobielle aerosoler i luften. Det store antal af patogener, såsom influenzavirus og Brucella melitensis, der er båret af aerosoler i markerne omkring husdyrbrug er vigtige faktorer, der forårsager luftvejssygdomme i både husdyr og fjerkræ arbejdstagere.

I denne undersøgelse, vi har undersøgt flere typer af analyser af bioaerosols, herunder PM nummer overvågning, bioaerosol indsamling og biologiske sammensætning analyse. Luftprøver blev indsamlet af et Cyclon aerosol sampler, store mængder luft sampler med filtre og en Andersen seks-trins sampler. Derefter blev prøver af disse tre samplere analyseret af biologiske analyser, herunder bakteriel 16S rDNA og svampe ITS sekvensering til at bestemme deres biologiske kompositioner. Heri, viser vi repræsentative resultater fra bioaerosol prøver indsamlet under Beijing disede dage og fra bedrifter, der viser, at bioaerosols muligvis har stor indvirkning på menneskers og dyrs sundhed. Sammenligning mellem væske og filter prøvetagningsmetoder blev også undersøgt i denne undersøgelse primært baseret på data fra 16S DNA og svampe ITS sekventering.

Protocol

1. PM antallet overvågning

  1. Bruge en luftbåren laser partikel counter (Se Tabel af materialer) for at bestemme det samlede PM-nummeret. Indsamle PM luft prøvetagning porten på toppen af airborne laser partikel counter.
    Bemærk: Denne partikel counter er en automatiseringsudstyr og det kan arbejde uafhængigt, når programmet herunder prøvetagningstid, interval, samling gange, etc. har været indstillet på dens touchscreen.
    1. Udstyre instrumentet med en sensor til at overvåge temperatur og relativ luftfugtighed. Måling og registrering af temperatur og relativ luftfugtighed data samtidigt hvert 5 min.
    2. I alt, måle og registrere 6 forskellige partikel størrelsesklasser (0,3-0,5 μm, 0,5-0,7 μm, 0,7-2,5 μm, 2,5-5 μm, 5-10 μm og > 10 μm) samtidig hver 5 min. måler 4 andre partikel størrelsesklasser (0,3-0,5 μm, 0,5-1 μm, 1-3 μm og ≥ 3 μm).
    3. Indsamle Luftprøver selv prøveudtagning hul på toppen sampler og bruge modulerne test inde sampler for at måle hver PM partikelstørrelse. Derefter gemmes dataene automatisk. Alle ovenstående processer kan udføres automatisk efter de relative parametre, herunder prøvetidspunktet og tælle vifte, angives dog mini touch displayer af airborne laser partikel counter.
      Bemærk: Denne partikel counter er en automatiseringsudstyr og det har test-moduler, der tæller antallet af PM af forskellige partikel størrelsesklasser.
  2. For at vurdere eksperimentelle standardfejl, sikre at forskellige partikel størrelsesklasser tælles med mindst 15 replikationer. Sikre, at aflæsningerne er gemt i den interne hukommelse af instrumentet og senere analyseret.
    1. Sikre at analysen af primære data omfatter PM nummer koncentration, ANOVA test og procentdelen af PM i hver størrelseskategori. For eksempel, som vist i figur 1A, PM nummer koncentrationer i December (237.6 partikler/cm3) var betydeligt højere end i oktober (gennemsnit: 110.2 partikler/cm3) (ANOVA; P-Value < 0,05). Figur 1B viser, at antallet af partikler mindre end 3 μm tegnede sig for mere end 99% af det samlede antal.
    2. Brug tælleren laser partikel at overvåge PM nummer koncentrationer og gemmer data automatisk. Brug en USB flash disk til at eksportere data i computeren og udføre ANOVA test.

2. PM samling af Cyclon Aerosol samplere

  1. Udføre PM prøveudtagning i et åbent område uden nogen nærliggende større forureningskilder på ∼2 m over jorden.
    1. Registrere placeringen af prøvetagningsstedet. For eksempel, campus i Beijing Institute of Technology er følgende: 39 ° 57'51.0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
  2. Brug en Cyclon aerosol sampler for at indsamle Luftprøver. Bruge en sampler flow af 323 L/min, og en samling tid på 6 timer.
    Bemærk: Sampler strømningshastighed er fast og kan ikke ændres. Samling tid styres af manuel tid-holder, som der er kun en Start og Stop knap på denne sampler.
    1. Bruge sterilt vand til at vaske indersiden af Cyclon aerosol sampler 3 gange før samling, og brug funktionen automatisk rengøring 3 gange ved kontinuerligt at trykke knappen indsamle 3 gange.
    2. Tryk på knappen indsamle at starte prøvetagning og tryk på knappen pumpen at stoppe prøveudtagning. Sætte sampler på en hylde eller på gulvet med ingen holder den på plads.
    3. Bevare alle prøver i mørke ved-20 ° C indtil de efterfølgende analyser.

3. PM samling af filtre

  1. Udføre PM prøveudtagning i et åbent område uden nogen nærliggende større forureningskilder på ∼2 m over jorden.
    1. Registrere placeringen af prøvetagningsstedet. For eksempel, campus i Beijing Institute of Technology er som følger: 39 ° 57'51.0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
  2. Indsamle PM prøver på 20.32 × 25,4 cm2 filtre (Se Tabel af materialer) ved hjælp af en høj-volumen luft sampler (Se Tabel af materialer) med en væskehastighed på 1.000 L/min. sæt strøm sats og samling tid af relative auto-programmering.
    1. Bevare alle stikprøven filtre i mørke ved-20 ° C indtil de efterfølgende analyser.

4. biologiske sammensætning analyse

  1. For biologiske sammensætning analyse, anvender hver flydende udsnit fra Cyclon aerosol sampler eller filter prøve for DNA-ekstraktion af en multisource DNA-ekstraktion Kit (Se Tabel af materialer) ifølge producentens protokoller.
    1. For prøver fra den store mængder luft sampler med filtre, skal du bruge 1/8 af hver filter prøve for DNA-ekstraktion. Sætte filteret i en 50 mL tube med prøven vender indad og bagsiden vender mod rørvæggen. Tilføje 10 perler i de centrale steder mod side af filteret indeholder prøven.
    2. Vortex tube i 15 min. ved stuetemperatur. Der afpipetteres væske i røret i en ren 50 mL-centrifugerør at fortsætte udpakningen DNA.
  2. Uddrag DNA'ET fra prøven af processerne som følger.
    1. Centrifugeres bakterier stikprøve på 2.000 x g i 5 min, Fjern supernatanten og suspendere bakterier i 2 mL steril PBS buffer.
    2. Indsamle suspension af bakterier i et 2 mL centrifugeglas og derefter centrifugeres ved 2.000 x g for 5 min at kassere den supernatanten løsning.
    3. Tilføje 350 μl sterilt PBS buffer indeholdende de suspenderede bakterier til løsningen.
    4. Tilføje 0,8 mL af RNase A.
    5. Tilføj 150 μL af bufferen CL og 8 μL af proteinase K, og bland straks af vortex ryster i 1 minut. Efter kort centrifugering ved 1.000 x g for 30 s (ingen rester på væggen), lægge centrifugal røret i 56 ° C vand i 10 min.
    6. Tilføje 350 μL af bufferen PD, og -mix for 30 s og derefter centrifugeres i 10 min på 12.000 x g.
    7. DNA forberedelse røret anbringes i et 2 mL centrifugeglas, og Overfør blandingen foretaget i trin 4.2.6 til forberedelse tube. Derefter centrifugeres i 1 min på 12.000 x g.
    8. Kassér filtratet, sætte tilbage indholdet af forberedelse rør i den oprindelige 2 mL-centrifugerør og tilsæt 50 μL af bufferen W1. Der centrifugeres blandingen for 1 min på 12.000 x g.
    9. Kassér filtratet, sætte tilbage indholdet af forberedelse rør i den oprindelige 2 mL-centrifugerør og tilføje 700 μL af bufferen W2. Der centrifugeres blandingen i 1 min på 12.000 x g. Gentag dette trin til vask igen med 700 μL af bufferen W2.
    10. Kassere affald væsken, og sat tilbage indholdet af forberedelse rør i den oprindelige 2 mL-centrifugerør. Der centrifugeres blandingen for 1 min på 12.000 x g.
    11. Sætte indholdet af DNA forberedelse rør ind i en anden ren 1,5 mL centrifugeglas, og tilsæt 100 μL af elueringsvæsken eller deioniseret vand til midten af membranen i forberedelse tube (deioniseret vand eller elueringsvæsken er opvarmet til 65 ° C). Lad blandingen stå ved stuetemperatur i 1 minut, og der centrifugeres blandingen for 1 min på 12.000 x g.
  3. Udføre kvantitative real-time polymerase kædereaktion (Q-RT-PCR) til at kvantificere de relative mængder af bakterier og svampe på prøvetagningsfiltre.
    1. Bruge primere som følger: for bakteriel 16S rDNA, 515F (5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') og 806R (5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA på-3'); og for svampe ITS, ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA FTT GCG G-3') og ITS1 (5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3').
    2. Køre Q-RT-PCR assays på en Real-Time PCR System (Se Tabel af materialer). RT-PCR tilstand: predegeneration, 95 ° C, 10 min. degeneration, 95 ° C, 15 s; bind og udvidelse, 60 ° C, 1 min; 40 cykler fra degeneration at anneal og udvidelse.
  4. For bakterie- og svampeinfektioner Fællesskabets struktur analyse, forstærke regionen V1-V3 i den bakterielle 16S rDNA og ITS -regionen af de svampe rRNA operon ved PCR.
    1. Bruge primere som følger: for bakterier, V1-9F (5 '-FTT ATC CCC TGT GTG FTT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3 ') og V3-541R (5 '-CCA TCT kat CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-stregkode-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3′); og for svampe, ITS-3F (5'-FTT ATC CCC TGT GTG FTT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3') og ITS-4R (5'-CCA TCT kat CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-stregkode-GCT FTT CCG CTT ATT GAT ATG C-3').
    2. Sikre, at 20 μL blandingen af PCR'er inkluderet 2 μl af 2,5 mM dNTP'er, 4 μL af 5 × FastPfu Buffer, 0,8 μl af hver primer (5 μM), 0,4 μL FastPfu Polymerase, og 10 ng af DNA-template (Se Tabel af materialer).
    3. Bruge programmet PCR som følger: 94 ° C i 5 min; efterfulgt af 10 jernbanecykler 94 ° c til 30 s, 55-60 ° C i 45 s, og mindst 72 ° C til 90 s; 20 cyklusser af 94 ° C til 30 s, 55 ° C til 45 s og 72 ° C til 90 s; og en sidste udvidelse ved 72 ° C i 5 min.
  5. Udføre DNA oprensning, DNA kvantificering og pyrosequencing som beskrevet i en tidligere undersøgelse 21.

5. Bioaerosol prøvetagning og dyrkning

  1. Bruge en international standard Andersen seks-trins sampler (Se Tabel af materialer) at prøve bestemmelse luftbårne bakterier og svampe med en væskehastighed på 28,3 L/min. Brug gangen prøveudtagning af 35 min. sætte kultur plade i hver fase af sampler. Tilstrækkeligt desinficere sampler med 75% ethanol efter hver prøveudtagning.
    Bemærk: Sampler strømningshastighed er fast og samling tid styres af manuel tid-holder.
    1. Prøve seks faser med Andersen seks-trins sampler, som defineres af de aerodynamiske diameter af de luftbårne partikler, herunder fase VI (0,65-1.1 μm), fase V (1,1-2,1 μm), fase IV (2,1-3,3 μm), fase III (3.3-4.7 μm), fase II (4.7 – 7,0 μm) og fase I (≥7.0 μm).
    2. Indsamle de bakterielle partikler og depositum på kultur pladen i hver fase, der indeholder soja-kasein Digest Agar (Se Tabel af materialer). Der er en container med mange luftindtag på toppen i hver fase af sampler.
    3. Kultur samlingen luftbårne bakterier plader ved 37 ° C i 24-48 timer; derefter tælle koloni antallet af bakterier på prøve parabol for hver etape.
  2. For at forhindre, at Partiklerne indsamles af Andersen seks-trins sampler fra overlappende, rette antallet af kolonier på hvert sampler niveau ved følgende formel:
    Equation
    hvor Pr: korrigeret antallet af kolonier på hvert niveau,
    N: antal stikprøver huller af sampler på alle niveauer (400), og
    r: den faktiske optælling af kolonier.
  3. Beregn enheden af kolonier pr. m3 luft som følger:
    Equation
    hvor C: koncentration (CFU/m3),
    N1-N6: Det korrigerede antal kolonier på hvert niveau,
    T: prøvetidspunktet (min), og
    F: prøveudtagning strømningshastighed (28,3 L/min).
  4. Bruge metoderne fra trin 5.1 – 5.3 at studere bioaerosol i husdyr farm, herunder fire typer af svinestalde.
    Bemærk: Husdyr gård ligger i Changchun, Kina. Den centrale position 2 m over jorden i hver svineopdræt blev udvalgt som stikprøver placering.) Efter kultur for bakterier, behandle alle kolonier i plader som beskrevet i trin 6.1 - 6.2.

6. identifikation af bestemmelse bakterier

  1. Efter 48 h eller 72 h af dyrkning, skal du placere bakterier i et 2 mL-centrifugerør. Uddrag DNA i disse bakterier eller svampe ved hjælp af en multisource DNA-ekstraktion Kit (Se Tabel af materialer). DNA udvinding proces er beskrevet i afsnit 4.2.
  2. Bruge 200 μl DNA udvinding prøve for 16S rDNA -sekventering. Brug de samme processer som beskrevet i trin 4.2, 4.3 og 4.4 på biologiske sammensætning analyse.

Representative Results

I denne undersøgelse udført vi en vurdering af den samlede PM fordeling og en omfattende analyse af bioaerosols i en malkekvægsbedrift fra September til December. Mange miljømæssige faktorer bidrager til fordeling af aerosol partikler. Vi studerede de koncentration og størrelse fordelinger af PM i en kostalden ved hjælp af en TSI laser partikel counter. Som vist i figur 1A, var koncentrationen af aerosol partikler højest i December og lavest i oktober, som kan være forårsaget af ændringer i temperatur og luftfugtighed (tabel 1). Koncentrationen af inhalerbar aerosol partikler (0,3-3,0 µm) tegnede sig for mere end 99% af den samlede partikel koncentration (figur 1B), og partikler i dette område kunne nå de dybe luftveje, forårsager alvorlige risici for mennesker og dyr.

Biologiske sammensætning analyse af prøver kan udføres af DNA udvinding, bakterielle 16SrDNA og svampe ITS region sekventering i stedet for mikroorganisme kultur. Fra den biologiske analyse af bioaerosol prøver indsamlet ved hjælp af en Cyclon aerosol sampler eller en høj-volumen luft sampler med filtre, kan vi foreløbigt sammenligne effektiviteten af disse to metoder til indsamling af bakterier og svampe. Figur 2 viste analyseresultater af bioaerosol prøver indsamlet under Beijing tågede dage i campus i Beijing Institute of Technology i 20 December 2016. For bakterier samling viste resultaterne, at Cyclon aerosol sampler indsamlet mange flere slægter end høj-volumen luft sampler med filtre (figur 2A). For svampe samling viste disse prøvetagere lige samling effektivitetsgevinster og næsten de samme slægt mængder (figur 2B). Fra resultaterne præsenteres i fig. 2, var vi i stand til at måle de forskellige samling effektivitetsgevinster af disse to metoder for bakterier og svampe. For bakterier samling, Cyclon aerosol sampler udføres meget bedre end høj-volumen luft sampler med filtre, fordi prøverne fra de tidligere viste en højere slægten overflod (figur 2A). Svampe sekventering analyse af de to prøver fra forskellige prøveudtagningsmetoder viste imidlertid næsten identiske Fællesskabets strukturer (figur 2B).

Vi studerede luftbårne bestemmelse bakterier ved hjælp af en Andersen seks-trins sampler. Som vist i figur 3, blev koloni antal bestemmelse bakterier for fase I-VI partikler reduceret. Etape partikler (partikel størrelse > 8.2 µm) havde det højeste antal bestemmelse bakterier kolonier. Procentdelen af fase I kolonier i fire forskellige typer af svinestalde herunder faring hus, gravid soen house, opfedning hus og fravænning hus var 33%, 30%, 26% og 34%, henholdsvis. Procentdelen af fase II kolonier i fire forskellige typer af svinestalde var 20%, 22%, 19% og 20% henholdsvis. Procentdelen af fase III kolonier i fire forskellige typer af svinestalde var 18%, 18%, 18% og 19% henholdsvis. Procentdelen af fase IV kolonier i fire forskellige typer af svinestalde var 17%, 16%, 16% og 16% henholdsvis. Procentdelen af fase V kolonier i fire forskellige typer af svinestalde var 10%, 10%, 14% og 6% henholdsvis. Fase VI partikler (partikel størrelse < 1,0 µm) havde det laveste antal bestemmelse bakterier kolonier. Procentdelen af fase VI kolonier i de fire forskellige typer af svinestalde var 3%, 5%, 6% og 5%, henholdsvis.

Luftprøver blev indsamlet i fire forskellige typer af svinestalde ved hjælp af en Andersen seks-trins sampler og derefter kulturperler under passende forhold. Hele-genom-DNA i bestemmelse bakterier indsamlet fra hver partikel fase blev udvundet og opdaget af bakteriel 16S rDNA og svampe ITS region sekventering. I alt 91 slægter og 158 arter af bakterier blev identificeret i de bestemmelse bakterier i svinestalde. Bestemmelse bakterier Fællesskabets strukturer i fire forskellige typer af svinestalde, herunder faring hus, gravid soen house, opfedning hus og fravænning hus er vist i figur 4 med data fra fase I til fase VI. Indholdet af forskellige fremherskende bakteriel slægter er ikke det samme blandt forskellige svinestalde.

Figure 1
Figur 1: den koncentration og størrelse fordeling af PM i fire forskellige måneder. (A) Boxplot for PM tal under studieperioden. Hver boxplot omfatter maksimum, minimum, median, to kvartiler og unormal værdi af databasen. B den gennemsnitlige størrelse distribution kort af PM. Der var 80 køerne i hus fra September til December. Procentdel af PM (≥ 3 µm) i fire måneder (September, oktober, November og December) var 0,005, 0.005, 0,002 og 0,002 henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: biologiske analyse af bioaerosol prøver indsamlet af to samplere. (A) og (B) viser mængderne af bakterie- eller svampeinfektion slægter i bioaerosol prøver med forskellige indsamlingsmetoder. Chloroformvædet væg luft Sampler repræsenterer Cyclon aerosol sampler. Quartz-filtre repræsenterer store mængder luft sampler med filtre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: gennemsnitlig hierarkisk fordeling kort over bestemmelse bakterier i fire typer af svinestalde. De fire typer af svinestalde faring hus, gravid soen house, opfedning hus og fravænning hus. S1 til S6 repræsenterer seks partikel stadier (I-VI) indsamlet af Andersen seks-trins sampler. Faser blev defineret af de aerodynamiske diameter af de luftbårne partikler, herunder fase VI (0,65-1,1 µm), fase V (1,1-2,1 µm), fase IV (2,1-3,3 µm), fase III (3.3-4.7 µm), fase II (4.7-7,0 µm) og fase I (7,0 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: bakteriel fællesskabsstrukturer forskellige mængder i Luftprøver. Luftprøver blev indsamlet i fire forskellige typer af svinestalde ved hjælp af en Andersen seks-trins sampler og derefter kulturperler under passende forhold. Hele-genom-DNA i bestemmelse bakterier i hver partikel fase indsamlet af Andersen seks-trins sampler blev udvundet og opdaget af bakteriel 16S rDNA -sekventering. Numrene 1 til 6 i hver type af Svineopdræt udgør partikel stadier I-VI målt ved Andersen seks-trins sampler. Teksten på den højre side indeholder slægten navn for hver bakterie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne undersøgelse forudsat vi nogle repræsentative resultater, der blev indhentet under disede dage og i husdyrbrug. Resultater fra bioaerosol under Beijing disede dage udtagne lettet en bedre forståelse af de biologiske kompositioner af den biologiske sammensætning af PM uden PM stede under Beijing disede dage. Resultater fra prøver udtaget fra husdyrbrug vil også danne grundlag for miljømæssigt air quality control i svinestalde og et teoretisk fundament og teknisk støtte til sund opdræt og sikker produktion i husdyrbrug. Mange miljømæssige faktorer, såsom temperatur, luftfugtighed og vindhastighed, vil kunne bidrage til fordeling af aerosol partikler i kostalden (figur 1). Tidligere undersøgelser har afsløret, at PM i bedrifter, der hovedsagelig kommer fra foder, afføring, pels og fjer, som kan være relateret til de animalsk aktiviteter. De miljømæssige faktorer kan påvirke ikke blot dyrs aktiviteter, men også sammenlægning og diffusion af PM i et relativt lukket kostalden. Derfor opdager vi forskellige koncentrationer og størrelse distributioner af PM i fire forskellige måneder. Udover, de sanitære betingelse, fodring metode og dyr aktivitet var anderledes mellem de fire typer af svinestalde, som også kan påvirke deres Fællesskabets struktur af bestemmelse bakterier i luften (figur 4).

Men i denne undersøgelse, vi primært fokuseret på de tilgængelige metoder, som vi kunne bruge til at studere sammensætning og fordeling af bioaerosols under forskellige miljøforhold. Sammenlignet med andre mikrobielle prøver, de af luftbårne mikroorganismer har meget lave koncentrationer og er blandet med et stort antal urenheder, som f.eks uorganisk støvpartikler, som indfører visse vanskeligheder under indsamling og registrering af sådanne mikroorganismer21. Derfor, passende metoder til indsamling og registrering skal vælges for mikrobielle aerosoler. Samling af mikrobielle aerosoler prøver udføres normalt ved hjælp af nedbør metode eller specialudstyr til at indsamle mikroorganismer i faste, halvfaste eller flydende prøveudtagning medium22,23,24 . Derefter er nogle tilsvarende tekniske behandling og specifikke test og analyse efterfølgende foretaget25. Prøveudtagning medium bør holde mikroorganismer intakt at reducere fejl forbundet med detektion og analyse26. Men forskellige aerosol mikroorganisme prøvetagere har forskellige effekter på integriteten af prøver på grund af deres forskellige stikprøver principper og medier. Mennesker har udviklet mange former for bioaerosol samplere, der bruger forskellige stikprøver principper, såsom inertial impaction, filtrering modstand og elektrostatisk udfældning27.

Påvirker prøvetagere kan skubbe luftbårne PM til prøveudtagning medium til høj hastighed ved hjælp af udvinding udstyr. Der er to typer af påvirker prøvetagere: faste og flydende. Solid påvirker prøvetagere kan bruges til at prøve bioaerosols på en lav koncentration og kan være næsten uigennemtrængelig for air flow28. Aerosol partikler i forskellige størrelser kan screenes foreløbigt, og mikrober kan udtages direkte ind i substratet, hvilket øger overlevelsesraten for bestemmelse mikroorganismer10. På grund af inertial indvirkning, mikrobielle aerosoler partikler kollidere nemt på samme sted, og kolonier kan overlappe nemt efter kultur. I øjeblikket er den mest almindelige solid påvirker sampler Andersen-6 mikrobielle aerosoler sampler. I denne undersøgelse brugte vi en Andersen seks-trins sampler for at studere bestemmelse bakterier fordelt i luftbårne PM af forskellige størrelser.

Cyclon aerosol samplere bruge cykloner til spiral luft med høj hastighed i en cylinder eller kegle. Bioaerosol partikler kan adskilles fra luftstrømmen af centrifugalkraften, hvilket betyder, at mikrober kan støde ind i den indre væg af sampler og derefter indsamles af prøveudtagning buffer. Denne metode er praktisk og kan bruges til lange prøveudtagning gange i store flow og prøvetagning operationer. Denne metode kan ikke gennemføres ved lave temperaturer, fordi handlingen er afhængig af væske. Cyclon aerosol sampler anvendes i denne undersøgelse er en Cyclon chloroformvædet væg aerosol sampler, der kan udtrække og overføre luftbårne patogener og partikler fra stikprøven luft ind i en lille mængde vand i analyse29.

Filter prøvetagere kan arbejde under lave temperaturforhold og kan prøve partikler over en vis størrelse. Men de har en stor virkning på den mikrobielle aktivitet og er tilbøjelig til skade, som væsentligt vil påvirke efterfølgende undersøgelser af stikprøver aktivitet. I denne undersøgelse, blev bioaerosol prøver fra Beijing disede dage indsamlet ved hjælp af både en høj-volumen luft sampler med filtre og en Cyclon aerosol sampler. Formålet med dette eksperiment var at analyserer den biologiske sammensætning af PM uden adskillelse og dyrkning af luftbårne mikrober. Derfor, disse to metoder var egnet til denne undersøgelse. For metoden Cyclon aerosol sampler luftbårne mikroorganismer på en lav koncentration kan udtrækkes nemt til de kørende buffer og derefter kan analyseres bekvemt uden yderligere behandling, der er almindeligt anvendt til filter prøver. I denne undersøgelse, disse to prøvetagningsmetoder, Cyclon aerosol sampler og filter sampler, viste forskellige stikprøver effektivitet. Den supplerende behandling, der er almindeligt anvendt til filter prøver, såsom at komme prøven fra filteret, er en af de væsentligste forskelle mellem disse to metoder. Prøverne Derudover air blev indsamlet direkte ind i den kørende buffer af Cyclon aerosol sampler mens anden metoden indsamlet prøver på filtre. Karakteristik af forskellige slags prøveudtagningsmetode kan bidrage til denne forskellige stikprøver effektivitet. Vi kan antage, at Cyclon aerosol sampler er et bedre valg for mikroorganisme samling, og denne antagelse har brug for yderligere bekræftelse.

I denne undersøgelse, blev bakteriel 16S rDNA og svampe ITS region sekventering brugt til at udføre den biologiske analyse af bioaerosols. 16SrDNA sekventering er bestemmelse af 16S rDNA segmenter i den mikrobielle genom30. 16s rDNA findes bredt i prokaryoter med høj bevarelse og specificitet, som gør det nyttigt for identifikationen af mikrobielle arter31. Hele-genome sequencing kræver kun udpakningen genomisk DNA og efterfølgende sekvensering. Ud over at producere en stor mængde af data, denne proces også giver mulighed for en mere omfattende analyse af mikrobielle samfund struktur. Metagenomics kan desuden også bruges i dette fagområde ved at give flere oplysninger i fremtiden. Handelsman et al. først foreslået idéen om metagenome i 1998 papir på mikrober i jord32. I efterfølgende undersøgelser, begrebet metagenome blev gradvis accepteret og megen forskning blev udført på de mikrober, der er inkluderet i den menneskelige gut, hav og jord33,34,35. Med støtte fra høj overførselshastighed sekventering teknologi, metagenomics har udviklet sig hurtigt, og det spiller en stadig vigtigere rolle i studiet af patogen detektion. Traditionelle mikrobielle forskningsmetoder er hovedsageligt afhængige kultur for adskillelse og rensning. Dog mange undersøgelser kan ikke udføres fordi mere end 99% af mikrober ikke kan være kulturperler. I modsætning til traditionelle metoder, kan metagenomics tage de genetiske oplysninger for alle mikrober i miljøet som helhed uden at skulle adskille individuelle organismer36. En omfattende analyse af alle de deraf følgende mikroorganismer kan foretages direkte.

I Resumé, denne undersøgelse viste flere påvisning, prøveudtagning og analysemetoder, der kunne bruges til undersøgelser af den biologiske sammensætning af miljømæssige PM, herunder PM overvågning; PM prøveudtagning af en Andersen seks-trins sampler, store mængder luft sampler med filtre eller Cyclon aerosol sampler; og efterfølgende biologiske analyse baseret på DNA-sekventering. I praksis, kan disse metoder anvendes under forskellige miljøforhold, som mange typer af husdyrbrug. Vores protokoller og resultaterne kan hjælpe andre forskere over hele verden at udforske sundhedsvirkningerne af svampe- og bakterielle bioaerosols i miljøet.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Finansiel støtte til denne undersøgelse kom fra den National Natural Science Foundation of China (nr. 41775148). Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
airborne laser particle counter TSI Inc, MN, USA model 9306
Andersen six-stage sampler Tisch Inc, USA TE-20-600
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit Axygen, NY, USA AP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu Polymerase TransGen Inc., Beijing, China AP221-01
High-volume air sampler Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China HH02-LS120
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific, USA Applied Biosystems® 7500
Soybean-Casein Digest Agar Becton, Dickinson and company, MD, USA 211043
Tissuquartz filters Pall, NY, USA 7204
Wetted-Wall Air Sampler Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Washington 98272-1034 USA		 SASS 2300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations--a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
  2. Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
  3. Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
  4. Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
  5. Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
  6. Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
  7. Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
  8. Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
  9. Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
  10. Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
  11. Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226 (2013).
  12. Wery, N. Bioaerosols from composting facilities--a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42 (2014).
  13. Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
  14. Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
  15. Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
  16. Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
  17. Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
  18. Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
  19. Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
  20. Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
  21. Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
  22. Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
  23. Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
  24. Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
  25. Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
  26. Lednicky, J., et al. Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
  27. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
  28. Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
  29. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
  30. Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
  31. Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059 (2018).
  32. Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
  33. Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677 (2018).
  34. Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
  35. Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
  36. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).

Tags

Miljøvidenskab spørgsmålet 143 PM antallet overvågning Bioaerosol indsamling bakteriel 16S rDNA og svampe ITS region sekventering miljømæssige patogener luftbårne mikrobielle samfund forskellige miljøforhold.
Sammensætning og Distribution analyse af Bioaerosols Under forskellige miljøforhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Z., Li, J., Qian, L., Liu, L., … More

Wang, Z., Li, J., Qian, L., Liu, L., Qian, J., Lu, B., Guo, Z. Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58795, doi:10.3791/58795 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter