Análise para inorgânico polifosfato em bactérias

Polifosfatos inorgânicos (pólipo) é um biopolímero linear de unidades phosphoanhydride-lig fosfato que é encontrado em todos os domínios da vida^1,2,3. Em diversas bactérias, pólipo é essencial para a resposta ao estresse, motilidade, formação de biofilmes, controlo do ciclo celular, resistência aos antibióticos e virulência^{4,5,6,7,8 ,9,10,11}. Estudos de metabolismo de pólipo em bactérias, portanto, têm o potencial de produzir insights fundamentais sobre a capacidade das bactérias que causam a doença e prosperam em ambientes diversos. Em muitos casos, no entanto, os métodos disponíveis para quantificação de pólipo em células bacterianas são um fator limitante nestes estudos.

Existem vários métodos atualmente usados para medir os níveis de pólipo em materiais biológicos. Esses métodos normalmente envolvem duas etapas distintas: extração de pólipo e quantificar o pólipo presentes nesses extratos. O método padrão ouro atual, desenvolvido para a levedura Saccharomyces cerevisiae por Bru e colegas¹², extractos de pólipo juntamente com DNA e RNA usando fenol e clorofórmio, seguido de precipitação do álcool etílico, tratamento com desoxirribonuclease (DNase) e ribonuclease (RNase) e a digestão do pólipo purificada resultante com S. cerevisiae pólipo-degradante enzima exopolyphosphatase (ScPPX)¹³ ao rendimento livre de fosfato, que é em seguida quantificado usando um ensaio colorimétrico baseado em verde malaquita. Este procedimento é altamente quantitativo mas trabalhoso, limitando o número de amostras que podem ser processados em uma única experiência e não é otimizado para amostras bacterianas. Outros relataram extraindo pólipo de uma variedade de células e tecidos usando esferas de sílica ("glassmilk") ou sílica membrana colunas^{6,14,15,16,17, 18}. Esses métodos não eficientemente extrair cadeia curta pólipo (menos de 60 unidades de fosfato)^12,14,15, embora isso seja menos preocupante para as bactérias, que são pensados geralmente para sintetizar principalmente Pólipo de cadeia longa³. Antigos métodos de extração de pólipo usando ácidos fortes^19,20 são não mais amplamente utilizados, desde que o pólipo é instável sob condições ácidas¹².

Há também uma variedade de métodos relatados para quantificação de pólipo. Entre as mais comuns é ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), um corante fluorescente mais normalmente usado para manchar o DNA. Complexos de DAPI-pólipo tem maxima de excitação e emissão de fluorescência diferentes de DAPI-DNA complexos^21,22, mas há considerável interferência de outros componentes celulares, incluindo o RNA, nucleotídeos e inositol fosfatos de^12,15,16,23, reduzindo a especificidade e a sensibilidade das medições de pólipo feito usando este método. Alternativamente, o pólipo e difosfato de adenosina (ADP) podem ser convertidas em adenosina trifosfato (ATP) usando purificada Escherichia coli quinase pólipo (PPK) e o ATP resultante quantificados usando luciferase^{14,17 ,18}. Isto permite a detecção de pequenas quantidades de pólipo, mas requer duas etapas de reação enzimática e luciferina e ADP muito puro, que são reagentes caros. ScPPX especificamente digere pólipo em fosfato livre^6,12,13,,²⁴, que pode ser detectada usando métodos mais simples, mas ScPPX é inibido por DNA e RNA¹², tratamento de DNase e RNase necessária de pólipo contendo extratos. PPK nem ScPPX estão disponíveis comercialmente, e purificação de PPK é relativamente complexo^25,26.

Pólipo no lisados celulares ou extratos também pode ser visualizado em gel de poliacrilamida por DAPI negativo coloração^27,28,29,30, um método que permite a avaliação do comprimento da corrente, mas é baixo rendimento e mal quantitativa.

Agora, nós relatamos um ensaio rápido, barato e de rendimento médio pólipo que permite rápida quantificação de pólipo níveis em diversas espécies bacterianas. Este método começa por lise de células bacterianas a 95 ° C, em 4 M guanidina isotiocianato (GITC)¹⁴ para inactivar fosfatases celulares, seguidos de uma extração de coluna de membrana de sílica otimizada para processamento rápido de amostras múltiplas. O extrato contendo pólipo resultante é então digerido com um grande excesso de ScPPX, eliminando a necessidade de tratamento de DNase e RNase. Nós incluímos um protocolo para a purificação de afinidade de níquel simples de quantidades de mg de ScPPX. Finalmente, fosfato livre derivado de pólipo é quantificado com um ensaio colorimétrico simples, sensível, à base de ácido ascórbico²⁴ e normalizado a proteína celular total. Este método simplifica a medição de pólipo em células bacterianas, e vamos mostrar seu uso com espécies representativas de bactérias Gram-negativas, bactérias gram-positivas e micobactérias.

1. purificação do fermento Exopolyphosphatase (ScPPX)

1. Transforme a tensão de superexpressão de proteínas Escherichia coli BL21(DE3)³¹ com plasmídeo pScPPX2⁶ por eletroporação³² ou transformação química³³.
2. Inocular 1 L de caldo lisogenia (LB) contendo 100 µ g ampicilina de^-1 de mL em um frasco de 2 L unbaffled com uma única colônia de BL21(DE3) contendo pScPPX2 e incubar durante a noite a 37 ° C, sem agitação, uma absorção em 600 nm (₆₀₀) de aproximadamente 0.3, como medido em um espectrofotômetro.
3. Começar a cultura tremendo (180 rpm) e incube por 30 min a 37 ° C, durante o qual as células se expandirão para um A₆₀₀ de 0,4 - 0,5.
4. Adicione o isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 1 mM e uma ampicilina adicional em 100 µ g^-1 de mL e, em seguida, incubar por 4 h a 37 ° C com agitação a 180 rpm.
   Nota: Este protocolo superexpressão gera uma grande quantidade de ScPPX solúvel. No entanto, ScPPX superexpressão é muito indulgente, e uma variedade de outros protocolos comuns de superexpressão de proteínas têm sido utilizados para purificar com sucesso ScPPX.
5. Transferir as células para uma garrafa de centrífuga de 1L e colhê-las por centrifugação por 20 min a 5000 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante e transferir o centrifugado para um tubo cónico de 50 mL.
   Nota: Podem ser armazenadas indefinidamente pelotas de célula de resíduos a-80 ° C.
6. Descongelar a pelota no gelo e, em seguida, resuspenda-lo em 9 mL de 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl e imidazol 5 mM (pH 8) para um volume total de cerca de 10 mL.
7. Adicionar 50 unidades mL^-1 de uma endonuclease degradante de RNA e DNA, 2 mM MgCl₂e lisozima de^-1 (concentrações finais) 1mg mL (ver Tabela de materiais) e incube por 30 min no gelo.
   Nota: ScPPX vincula os ácidos nucleicos (dados não mostrados), para tratamento de nuclease é essencial durante a purificação.
8. Usando um sonicador com um microtip (ver Tabela de materiais), lyse as pilhas por 2 ciclos de sonication no gelo em 50% de energia, pulsando 5 s no e 5 s, com um descanso de 2min entre ciclos.
   Nota: Use proteção auditiva adequada durante sonication. Da mesma forma para o caso com superexpressão, uma variedade de métodos de lise celular são aceitáveis para a purificação de ScPPX.
9. Remover os resíduos insolúveis por centrifugação o lisado por 20 min a 20.000 x g a 4 ° C. Filtre o sobrenadante resultante (aproximadamente 10 mL) através de um filtro de seringa de acetato de celulose de tamanho dos poros 0,8 µm.
10. Carregar o lisado para um níquel-cobrado 5ml quelantes coluna (ver Tabela de materiais) usando uma seringa grande ou uma bomba peristáltica.
11. Lave a coluna com 50 mL de imidazole de 5mm HEPES, 0,5 M de NaCl, de 50 mM (pH 8).
12. Lave a coluna com 50 mL de imidazole de 20mm HEPES, 0,5 M de NaCl, de 50 mM (pH 8).
13. Eluir ScPPX com 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl e imidazol 0,5 M (pH 8), coleta 15 frações de 1 mL. Testar essas frações de eluição para teor de proteínas com a proteína de Bradford ensaio³⁴ (ver Tabela de materiais) e executar um gel de SDS-PAGE³⁵ para confirmar quais frações contêm ScPPX purificado (peso molecular = 45 kDa).
14. As frações contendo ScPPX pura do pool e ajustar a concentração da proteína em pool de aproximadamente 2 mg mL^-1 com 50 mM HEPES e 0,5 M de NaCl. Altas concentrações de proteína podem precipitar na próxima etapa.
15. Troca o ScPPX purificado no buffer de armazenamento (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM KCl, glicerol 10% [v/v]) pela diálise. Coloque em pool ScPPX frações de um comprimento selado de 12.000-14.000 Da peso molecular corte diálise membrana tubos (ver Tabela de materiais) e suspender em 1 L de buffer de armazenamento, com agitação contínua a 4 ° C pelo menos 4 h. Repita este passo com fresco buffer de armazenamento para um total de 3 alterações de reserva.
16. Transferi a proteína purificada, dializada para um tubo de centrifugação ou tubos e centrifugar por 20 min a 20.000 x g a 4 ° C para remover quaisquer agregados insolúveis. Transferi com cuidado o sobrenadante para um tubo cônico limpo 15 mL.
17. Ajustar a concentração da ScPPX purificado para 1 mg mL^-1 , com buffer de armazenamento, adicionar 0,1% (p/v) albumina de soro bovina indemne de protease (BSA; concentração final) e a loja por até 6 meses a 4 ° C.
    Nota: ScPPX perde mais de 90% da sua actividade quando é congelado¹³.

2. a colheita de amostras para a extração de polifosfato

1. Cresce bactérias nas condições de interesse para a determinação do teor de pólipo. Para este protocolo, cresce Lactobacillus reuteri³⁶ durante a noite a 37 ° C sem tremer na enzima málico indução (MEI) médio³⁷ sem cisteína (MEI-C).
2. Colheita de células suficientes por centrifugação em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL ao total de 50 a 100 µ g de proteína celular (consulte a etapa 3 abaixo). Para Escherichia coli, este é 1 mL de uma cultura de fase de log em um A₆₀₀ de 0,2 - 0,4. Para L. reuteri, isto é 1 mL de uma cultura durante a noite. Ajuste como necessário para outras espécies de interesse.
3. Remova completamente o sobrenadante de Pelotas a célula.
4. Resuspenda as pelotas de célula em 250 µ l de tampão de Lise GITC (isotiocianato de guanidina de 4 M, 50 mM Tris-HCl, pH 7) e lyse de incubação a 95 ° C por 10 min. lysates loja a-80 ° C.
   Nota: Coadunar-se com o tempo de Lise, desde a incubação prolongada a alta temperatura pode resultar em degradação do pólipo por hidrólise³⁸. Lisados podem ser armazenados indefinidamente a-80 ° C.
   Cuidado: Isotiocianato de guanidina é um sal de caotrópicas e deve ser manipulado com luvas e eliminado como resíduos perigosos.

3. medir o teor de proteína de lisados celulares

1. Prepare padrões de BSA contendo 0, 0,1, 0,2 e 0,4 mg mL^-1 de BSA em tampão de Lise GITC.
   Nota: É importante fazer os padrões de BSA em GITC, desde GITC influencia o desenvolvimento de cor do ensaio Bradford. Padrões de BSA podem ser armazenados indefinidamente a-20 ° C.
2. Alíquota 5 µ l de lisados celulares descongelado, bem misturado e de padrões de BSA para separar poços de uma placa de 96 poços claros.
3. Adicione 195 µ l de reagente de Bradford³⁴ a cada poço e medir a absorvância a 595 nm (₅₉₅) em um leitor de placas (ver Tabela de materiais).
4. Calcular a quantidade de proteína em cada poço por comparação com a curva padrão de BSA, usando a fórmula y = mx + b, onde y é um₅₉₅, x é µ g de BSA, m é a inclinação da curva de calibração a e b é a interseção y da curva padrão. Multiplique o valor resultante por 0.05 para determinar o total mg de proteína em cada amostra.

4. extrair polifosfato

1. Adicione 250 µ l de etanol a 95% para cada amostra GITC-lysed e vórtice para misturar.
2. Aplique essa mistura para uma coluna de rotação de membrana de sílica e centrifugar por 30 s a 16.100 x g.
3. Descartar o escoamento e, em seguida, adicionar 750 µ l de 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de NaCl, 5 mM EDTA, 50% de etanol e centrifugar por 30 s a 16.100 x g.
4. Descarte o escoamento e centrifugar por 2min a 16.100 x g.
5. Coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga limpos 1,5 mL e adicionar 150 µ l de 50 mM Tris-HCl (pH 8).
6. Incubar a temperatura ambiente por 5 min e, em seguida, eluir pólipo por centrifugação por 2 min a 8.000 x g.
   Nota: Se desejar, os eluídos podem ser armazenados a-20 º C pelo menos 1 semana.

5. digestão polifosfato

1. Prepare normas contendo 0, 5, 50 ou fosfato de potássio 200 µM em 50 mM Tris-HCl (pH 8).
   Nota: As normas de fosfato de potássio podem ser armazenadas indefinidamente em temperatura ambiente.
2. Alíquota 100 µ l de cada padrão de fosfato e de extrair amostras de pólipo em separado poços de uma placa de 96 poços claros.
3. Preparar uma mistura de mestre contendo (por amostra): 30 µ l de 5 x ScPPX reação buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, acetato de amónio de 250 mM, pH 7,5)¹³, 19 µ l de H₂O e 1 µ l de ScPPX purificado (1 mg mL^-1).
4. Adicione 50 µ l do mix mestre para cada poço da placa de 96 poços. Incube por 15 min a 37 ° C.
   Nota: Se desejar, as amostras de pólipo digerida podem ser armazenadas a-20 ° C indefinidamente.

6. detecção de fosfato livre²⁴

1. Preparar a solução de deteção base dissolvendo 0,185 g de tartarato de potássio antimónio em 200 mL de água, adicionar 150 mL de 4 H N₂então₄, em seguida, adicionando 1,49 g de heptamolibdato de amónio. Mexa para dissolver e então trazer até um volume final de 456 mL. Filtre a solução para remover partículas e armazenar protegido da luz a 4 ° C por até 1 mês.
2. Prepare uma solução de ácido ascórbico de 1m. Armazenar protegido da luz a 4 ° C por até 1 mês.
3. Prepare um estoque de trabalho fresca da solução de deteção cada dia misturando 9,12 mL da solução de deteção base com 0,88 mL de ácido ascórbico de 1m. Permitir que a solução de deteção vir à temperatura ambiente antes do uso.
4. Adicionar 50 µ l de solução de deteção para cada amostra e padrão da placa de 96 poços e incubar a temperatura ambiente por cerca de 2 minutos permitir o desenvolvimento de cor.
5. Medir a absorvância a 882 nm com um leitor de placas e calcular a concentração de fosfato de cada amostra em comparação com a curva padrão de fosfato de potássio.
   Atenção: A solução de deteção contém sais tóxicos e ácidos fortes. Use luvas e tratar a solução em excesso como resíduos tóxicos.

7. calcular o conteúdo celular do polifosfato

1. Converta as concentrações de fosfato determinadas na etapa 6.5 para nanomoles de pólipo-derivado de fosfato em cada célula inteira lisado de acordo com a seguinte fórmula:
   Pólipo nmol = 1,5 x (fosfato µM / 10)
   Nota: O método baseado na curva padrão no passo 6 determina a concentração de fosfato (em µM) em cada amostra de pólipo 100 µ l aliquotadas na etapa 5.2. Para converter esta concentração em um número de nmol, 100 µ l é dividido por 10⁶ para dar um volume em L, multiplicado pela concentração (µmol L^-1) e, em seguida, multiplicado por 1.000 (o número de nmol em um µmol). Isso reduz a dividir a concentração por 10. O volume total do extrato preparado no passo 4 é 150 µ l, portanto, é necessário multiplicar o valor resultante por 1,5 para calcular o nmol de fosfato presente no extracto de todo.
2. Normalize o conteúdo celular do pólipo a proteína celular total dividindo nmol pólipo pela proteína total em cada amostra determinada na etapa 3,4 mg. Níveis de pólipo são expressas em termos de concentração de individual fosfato livre derivado de pólipo.
   Nota: Em alguns casos, a quantidade de fosfato derivado de pólipo presente em uma amostra pode cair fora do intervalo linear da curva padrão de fosfato (passo 6.5). Se os níveis de pólipo são muito elevados, o eluato contendo pólipo excesso da etapa 4.6 pode ser diluídos 01:10 ou 1: 100, conforme necessário e então medido novamente, conforme descrito nas etapas 5 a 7.

As principais etapas do protocolo são feito de forma simplificada na Figura 1o diagrama elabore.

Para demonstrar o uso do presente protocolo com bactérias Gram-negativas, selvagem-tipo e. coli MG165539 foi crescido a fase log de mid LB médio rico a 37 ° C, com agitação (200 rpm), em seguida lavadas e incubadas durante um adicional 2 h em morpholinopropanesulfonate-tampão (MOPS) mínimo médio40 contendo 4 g L-1 glicose e 0,1 mM K2HPO4, uma condição conhecida por induzir a produção de pólipo14,29. Como mostrado na Figura 2A, não detectamos nenhum pólipo no selvagem-tipo e. coli crescidas em LB e 192 ± 14 (média ± desvio-padrão [SD]) nmol pólipo mg-1 proteína total em MOPS, consistentes com os anteriores relatórios14,29 . Como esperado, um ∆ppk mutante6, que carece de pólipo quinase41, produzido sem pólipo em qualquer meio, um ∆ppx mutante6, que carece de exopolyphosphatase42, produziu aproximadamente a mesma quantidade de Pólipo como o selvagem-tipo e um ∆polarizado mutante29, que está com defeito no transporte de fosfato, produziram significativamente menos pólipo do que o selvagem-tipo14,29,43.

Para demonstrar o uso do presente protocolo com bactérias gram-positivas, selvagem-tipo L. reuteri ATCC PTA 647536 e um mutante nulo isogénicas ppk1 falta da quinase do pólipo, construída usando oligo-dirigido recombineering44, foram crescido durante a noite em MEI-C a 37 ° C sem tremer. Como mostrado na Figura 2B, a selvagem-tipo acumulada 51 ± 6 nmol pólipo mg-1 proteínas totais sob estas condições, enquanto o mutante ppk1 contém menos de metade desta quantidade. L. reuteri contém uma segunda quinase de pólipo, codificada pelo ppk2 gene45, que presumivelmente contas para o pólipo apresentam o mutante nulo ppk1 .

Para demonstrar o uso do presente protocolo com micobactérias, Mycobacterium smegmatis estirpe SMR546 foi cultivada a fase log de mid em Hartmans-de Bont (HdB) médio47, em seguida, enxaguado e cinco vezes diluído em HdB ou HdB com 2% de etanol. Essas culturas foram então incubadas durante a noite a 37 ° C, com agitação (180 rpm). Como mostrado na Figura 2, na ausência de etanol, M. smegmatis acumulado 141 ± 52 nmol pólipo mg-1 proteína total, enquanto o tratamento de etanol resultou em um aumento triplo para 437 ± 102 nmol pólipo mg-1 proteína total. Este resultado era esperado, uma vez que o etanol tem sido relatado anteriormente para elevar os níveis de pólipo em M. smegmatis48.

Figura 1: diagrama do processo de extração e a mensuração de polifosfato. São ilustradas as etapas essenciais do protocolo de quantificação de pólipo. Célula bacteriana pelotas lysed a 95 ° C, em GITC (isotiocianato de guanidina). Pequenas alíquotas dos lysates são doseadas para conteúdo de proteína usando o ensaio de Bradford. Pólipo é extraído usando colunas de membrana de silicone e depois digerido com ScPPX. O fosfato livre resultante é quantificado usando o ensaio de ácido ascórbico. Fosfato total derivado de pólipo é normalizado para proteínas totais para cada amostra. Um595 = absorvância a 595 nm; Um882 = absorvância a 882 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: representante resulta com diversas bactérias. (A) ∆ selvagem-tipo e isogénicas de e. coli MG1655ppk, ∆ppxe ∆polarizado mutantes foram cultivados a 37 ° C, com agitação (200 rpm) para uma600 = 0,2 - 0,4 em rico meio LB (círculos pretos) e depois transferido para meio mínimo (MOPS contendo 4 g L-1 glicose e 0,1 mM K2HPO4) por 2 h (círculos brancos; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC PTA 6475 (círculos) e um mutante nulo isogénicas ppk1 (triângulos) foram cultivadas durante a noite a 37 ° C, no meio de MEI-C sem tremer (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 foi cultivada a 37 ° C, com agitação (180 rpm) para uma600 = 1 médio/HdB com (quadrados fechados) ou sem (quadrados aberta) 2% de etanol (n = 3, ± SD). Níveis de pólipo são expressas em termos de concentração de individual fosfato livre derivado de pólipo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.