Artigo de método

Análise para inorgânico polifosfato em bactérias

DOI:

10.3791/58818

⸱

21 de janeiro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

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Nós descrevemos um método simples para a rápida quantificação dos polifosfatos inorgânicos em diversas bactérias, incluindo espécies de micobactérias, Gram-positivas e Gram-negativas.

Resumo

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Polifosfatos inorgânicos (pólipo) é um polímero biológico encontrado nas células de todos os domínios da vida e é necessário para a virulência e resposta ao estresse em muitas bactérias. Há uma variedade de métodos para quantificação de pólipo em materiais biológicos, muitos dos quais são trabalhosos ou insensível, limitando sua utilidade. Apresentamos aqui um método simplificado para quantificação de pólipo em bactérias, usando uma extração de coluna de membrana de silicone otimizada para processamento rápido de várias amostras, digestão do pólipo com o pólipo específicas exopolyphosphatase ScPPX e a detecção do fosfato livre resultante com um ensaio colorimétrico sensível à base de ácido ascórbico. Este procedimento é simples, barato e permite a quantificação confiável pólipo em diversas espécies bacterianas. Apresentamos a quantificação de pólipo representativa de bactéria Gram-negativa (Escherichia coli), bactéria Gram-positivas de ácido lático (Lactobacillus reuteri) e as espécies de micobactérias (Mycobacterium smegmatis). Nós também incluímos um protocolo simples para a purificação de afinidade niquelar de quantidades de mg de ScPPX, que não está atualmente disponível comercialmente.

Introdução

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Polifosfatos inorgânicos (pólipo) é um biopolímero linear de unidades phosphoanhydride-lig fosfato que é encontrado em todos os domínios da vida1,2,3. Em diversas bactérias, pólipo é essencial para a resposta ao estresse, motilidade, formação de biofilmes, controlo do ciclo celular, resistência aos antibióticos e virulência4,5,6,7,8 ,9,10,11. Estudos de metabolismo de pólipo em bactérias, portanto, têm o potencial de produzir insights fundamentais sobre a capacidade das bactérias que causam a doença e prosperam em ambientes diversos. Em muitos casos, no entanto, os métodos disponíveis para quantificação de pólipo em células bacterianas são um fator limitante nestes estudos.

Existem vários métodos atualmente usados para medir os níveis de pólipo em materiais biológicos. Esses métodos normalmente envolvem duas etapas distintas: extração de pólipo e quantificar o pólipo presentes nesses extratos. O método padrão ouro atual, desenvolvido para a levedura Saccharomyces cerevisiae por Bru e colegas12, extractos de pólipo juntamente com DNA e RNA usando fenol e clorofórmio, seguido de precipitação do álcool etílico, tratamento com desoxirribonuclease (DNase) e ribonuclease (RNase) e a digestão do pólipo purificada resultante com S. cerevisiae pólipo-degradante enzima exopolyphosphatase (ScPPX)13 ao rendimento livre de fosfato, que é em seguida quantificado usando um ensaio colorimétrico baseado em verde malaquita. Este procedimento é altamente quantitativo mas trabalhoso, limitando o número de amostras que podem ser processados em uma única experiência e não é otimizado para amostras bacterianas. Outros relataram extraindo pólipo de uma variedade de células e tecidos usando esferas de sílica ("glassmilk") ou sílica membrana colunas6,14,15,16,17, 18. Esses métodos não eficientemente extrair cadeia curta pólipo (menos de 60 unidades de fosfato)12,14,15, embora isso seja menos preocupante para as bactérias, que são pensados geralmente para sintetizar principalmente Pólipo de cadeia longa3. Antigos métodos de extração de pólipo usando ácidos fortes19,20 são não mais amplamente utilizados, desde que o pólipo é instável sob condições ácidas12.

Há também uma variedade de métodos relatados para quantificação de pólipo. Entre as mais comuns é ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), um corante fluorescente mais normalmente usado para manchar o DNA. Complexos de DAPI-pólipo tem maxima de excitação e emissão de fluorescência diferentes de DAPI-DNA complexos21,22, mas há considerável interferência de outros componentes celulares, incluindo o RNA, nucleotídeos e inositol fosfatos de12,15,16,23, reduzindo a especificidade e a sensibilidade das medições de pólipo feito usando este método. Alternativamente, o pólipo e difosfato de adenosina (ADP) podem ser convertidas em adenosina trifosfato (ATP) usando purificada Escherichia coli quinase pólipo (PPK) e o ATP resultante quantificados usando luciferase14,17 ,18. Isto permite a detecção de pequenas quantidades de pólipo, mas requer duas etapas de reação enzimática e luciferina e ADP muito puro, que são reagentes caros. ScPPX especificamente digere pólipo em fosfato livre6,12,13,,24, que pode ser detectada usando métodos mais simples, mas ScPPX é inibido por DNA e RNA12, tratamento de DNase e RNase necessária de pólipo contendo extratos. PPK nem ScPPX estão disponíveis comercialmente, e purificação de PPK é relativamente complexo25,26.

Pólipo no lisados celulares ou extratos também pode ser visualizado em gel de poliacrilamida por DAPI negativo coloração27,28,29,30, um método que permite a avaliação do comprimento da corrente, mas é baixo rendimento e mal quantitativa.

Agora, nós relatamos um ensaio rápido, barato e de rendimento médio pólipo que permite rápida quantificação de pólipo níveis em diversas espécies bacterianas. Este método começa por lise de células bacterianas a 95 ° C, em 4 M guanidina isotiocianato (GITC)14 para inactivar fosfatases celulares, seguidos de uma extração de coluna de membrana de sílica otimizada para processamento rápido de amostras múltiplas. O extrato contendo pólipo resultante é então digerido com um grande excesso de ScPPX, eliminando a necessidade de tratamento de DNase e RNase. Nós incluímos um protocolo para a purificação de afinidade de níquel simples de quantidades de mg de ScPPX. Finalmente, fosfato livre derivado de pólipo é quantificado com um ensaio colorimétrico simples, sensível, à base de ácido ascórbico24 e normalizado a proteína celular total. Este método simplifica a medição de pólipo em células bacterianas, e vamos mostrar seu uso com espécies representativas de bactérias Gram-negativas, bactérias gram-positivas e micobactérias.

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Protocolo

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1. purificação do fermento Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Transforme a tensão de superexpressão de proteínas Escherichia coli BL21(DE3)31 com plasmídeo pScPPX26 por eletroporação32 ou transformação química33.
  2. Inocular 1 L de caldo lisogenia (LB) contendo 100 µ g ampicilina de-1 de mL em um frasco de 2 L unbaffled com uma única colônia de BL21(DE3) contendo pScPPX2 e incubar durante a noite a 37 ° C, sem agitação, uma absorção em 600 nm (600) de aproximadamente 0.3, como medido em um espectrofotômetro.
  3. Começar a cultura tremendo (180 rpm) e incube por 30 min a 37 ° C, durante o qual as células se expandirão para um A600 de 0,4 - 0,5.
  4. Adicione o isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 1 mM e uma ampicilina adicional em 100 µ g-1 de mL e, em seguida, incubar por 4 h a 37 ° C com agitação a 180 rpm.
    Nota: Este protocolo superexpressão gera uma grande quantidade de ScPPX solúvel. No entanto, ScPPX superexpressão é muito indulgente, e uma variedade de outros protocolos comuns de superexpressão de proteínas têm sido utilizados para purificar com sucesso ScPPX.
  5. Transferir as células para uma garrafa de centrífuga de 1L e colhê-las por centrifugação por 20 min a 5000 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante e transferir o centrifugado para um tubo cónico de 50 mL.
    Nota: Podem ser armazenadas indefinidamente pelotas de célula de resíduos a-80 ° C.
  6. Descongelar a pelota no gelo e, em seguida, resuspenda-lo em 9 mL de 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl e imidazol 5 mM (pH 8) para um volume total de cerca de 10 mL.
  7. Adicionar 50 unidades mL-1 de uma endonuclease degradante de RNA e DNA, 2 mM MgCl2e lisozima de-1 (concentrações finais) 1mg mL (ver Tabela de materiais) e incube por 30 min no gelo.
    Nota: ScPPX vincula os ácidos nucleicos (dados não mostrados), para tratamento de nuclease é essencial durante a purificação.
  8. Usando um sonicador com um microtip (ver Tabela de materiais), lyse as pilhas por 2 ciclos de sonication no gelo em 50% de energia, pulsando 5 s no e 5 s, com um descanso de 2min entre ciclos.
    Nota: Use proteção auditiva adequada durante sonication. Da mesma forma para o caso com superexpressão, uma variedade de métodos de lise celular são aceitáveis para a purificação de ScPPX.
  9. Remover os resíduos insolúveis por centrifugação o lisado por 20 min a 20.000 x g a 4 ° C. Filtre o sobrenadante resultante (aproximadamente 10 mL) através de um filtro de seringa de acetato de celulose de tamanho dos poros 0,8 µm.
  10. Carregar o lisado para um níquel-cobrado 5ml quelantes coluna (ver Tabela de materiais) usando uma seringa grande ou uma bomba peristáltica.
  11. Lave a coluna com 50 mL de imidazole de 5mm HEPES, 0,5 M de NaCl, de 50 mM (pH 8).
  12. Lave a coluna com 50 mL de imidazole de 20mm HEPES, 0,5 M de NaCl, de 50 mM (pH 8).
  13. Eluir ScPPX com 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl e imidazol 0,5 M (pH 8), coleta 15 frações de 1 mL. Testar essas frações de eluição para teor de proteínas com a proteína de Bradford ensaio34 (ver Tabela de materiais) e executar um gel de SDS-PAGE35 para confirmar quais frações contêm ScPPX purificado (peso molecular = 45 kDa).
  14. As frações contendo ScPPX pura do pool e ajustar a concentração da proteína em pool de aproximadamente 2 mg mL-1 com 50 mM HEPES e 0,5 M de NaCl. Altas concentrações de proteína podem precipitar na próxima etapa.
  15. Troca o ScPPX purificado no buffer de armazenamento (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM KCl, glicerol 10% [v/v]) pela diálise. Coloque em pool ScPPX frações de um comprimento selado de 12.000-14.000 Da peso molecular corte diálise membrana tubos (ver Tabela de materiais) e suspender em 1 L de buffer de armazenamento, com agitação contínua a 4 ° C pelo menos 4 h. Repita este passo com fresco buffer de armazenamento para um total de 3 alterações de reserva.
  16. Transferi a proteína purificada, dializada para um tubo de centrifugação ou tubos e centrifugar por 20 min a 20.000 x g a 4 ° C para remover quaisquer agregados insolúveis. Transferi com cuidado o sobrenadante para um tubo cônico limpo 15 mL.
  17. Ajustar a concentração da ScPPX purificado para 1 mg mL-1 , com buffer de armazenamento, adicionar 0,1% (p/v) albumina de soro bovina indemne de protease (BSA; concentração final) e a loja por até 6 meses a 4 ° C.
    Nota: ScPPX perde mais de 90% da sua actividade quando é congelado13.

2. a colheita de amostras para a extração de polifosfato

  1. Cresce bactérias nas condições de interesse para a determinação do teor de pólipo. Para este protocolo, cresce Lactobacillus reuteri36 durante a noite a 37 ° C sem tremer na enzima málico indução (MEI) médio37 sem cisteína (MEI-C).
  2. Colheita de células suficientes por centrifugação em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL ao total de 50 a 100 µ g de proteína celular (consulte a etapa 3 abaixo). Para Escherichia coli, este é 1 mL de uma cultura de fase de log em um A600 de 0,2 - 0,4. Para L. reuteri, isto é 1 mL de uma cultura durante a noite. Ajuste como necessário para outras espécies de interesse.
  3. Remova completamente o sobrenadante de Pelotas a célula.
  4. Resuspenda as pelotas de célula em 250 µ l de tampão de Lise GITC (isotiocianato de guanidina de 4 M, 50 mM Tris-HCl, pH 7) e lyse de incubação a 95 ° C por 10 min. lysates loja a-80 ° C.
    Nota: Coadunar-se com o tempo de Lise, desde a incubação prolongada a alta temperatura pode resultar em degradação do pólipo por hidrólise38. Lisados podem ser armazenados indefinidamente a-80 ° C.
    Cuidado: Isotiocianato de guanidina é um sal de caotrópicas e deve ser manipulado com luvas e eliminado como resíduos perigosos.

3. medir o teor de proteína de lisados celulares

  1. Prepare padrões de BSA contendo 0, 0,1, 0,2 e 0,4 mg mL-1 de BSA em tampão de Lise GITC.
    Nota: É importante fazer os padrões de BSA em GITC, desde GITC influencia o desenvolvimento de cor do ensaio Bradford. Padrões de BSA podem ser armazenados indefinidamente a-20 ° C.
  2. Alíquota 5 µ l de lisados celulares descongelado, bem misturado e de padrões de BSA para separar poços de uma placa de 96 poços claros.
  3. Adicione 195 µ l de reagente de Bradford34 a cada poço e medir a absorvância a 595 nm (595) em um leitor de placas (ver Tabela de materiais).
  4. Calcular a quantidade de proteína em cada poço por comparação com a curva padrão de BSA, usando a fórmula y = mx + b, onde y é um595, x é µ g de BSA, m é a inclinação da curva de calibração a e b é a interseção y da curva padrão. Multiplique o valor resultante por 0.05 para determinar o total mg de proteína em cada amostra.

4. extrair polifosfato

  1. Adicione 250 µ l de etanol a 95% para cada amostra GITC-lysed e vórtice para misturar.
  2. Aplique essa mistura para uma coluna de rotação de membrana de sílica e centrifugar por 30 s a 16.100 x g.
  3. Descartar o escoamento e, em seguida, adicionar 750 µ l de 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de NaCl, 5 mM EDTA, 50% de etanol e centrifugar por 30 s a 16.100 x g.
  4. Descarte o escoamento e centrifugar por 2min a 16.100 x g.
  5. Coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga limpos 1,5 mL e adicionar 150 µ l de 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. Incubar a temperatura ambiente por 5 min e, em seguida, eluir pólipo por centrifugação por 2 min a 8.000 x g.
    Nota: Se desejar, os eluídos podem ser armazenados a-20 º C pelo menos 1 semana.

5. digestão polifosfato

  1. Prepare normas contendo 0, 5, 50 ou fosfato de potássio 200 µM em 50 mM Tris-HCl (pH 8).
    Nota: As normas de fosfato de potássio podem ser armazenadas indefinidamente em temperatura ambiente.
  2. Alíquota 100 µ l de cada padrão de fosfato e de extrair amostras de pólipo em separado poços de uma placa de 96 poços claros.
  3. Preparar uma mistura de mestre contendo (por amostra): 30 µ l de 5 x ScPPX reação buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, acetato de amónio de 250 mM, pH 7,5)13, 19 µ l de H2O e 1 µ l de ScPPX purificado (1 mg mL-1).
  4. Adicione 50 µ l do mix mestre para cada poço da placa de 96 poços. Incube por 15 min a 37 ° C.
    Nota: Se desejar, as amostras de pólipo digerida podem ser armazenadas a-20 ° C indefinidamente.

6. detecção de fosfato livre24

  1. Preparar a solução de deteção base dissolvendo 0,185 g de tartarato de potássio antimónio em 200 mL de água, adicionar 150 mL de 4 H N2então4, em seguida, adicionando 1,49 g de heptamolibdato de amónio. Mexa para dissolver e então trazer até um volume final de 456 mL. Filtre a solução para remover partículas e armazenar protegido da luz a 4 ° C por até 1 mês.
  2. Prepare uma solução de ácido ascórbico de 1m. Armazenar protegido da luz a 4 ° C por até 1 mês.
  3. Prepare um estoque de trabalho fresca da solução de deteção cada dia misturando 9,12 mL da solução de deteção base com 0,88 mL de ácido ascórbico de 1m. Permitir que a solução de deteção vir à temperatura ambiente antes do uso.
  4. Adicionar 50 µ l de solução de deteção para cada amostra e padrão da placa de 96 poços e incubar a temperatura ambiente por cerca de 2 minutos permitir o desenvolvimento de cor.
  5. Medir a absorvância a 882 nm com um leitor de placas e calcular a concentração de fosfato de cada amostra em comparação com a curva padrão de fosfato de potássio.
    Atenção: A solução de deteção contém sais tóxicos e ácidos fortes. Use luvas e tratar a solução em excesso como resíduos tóxicos.

7. calcular o conteúdo celular do polifosfato

  1. Converta as concentrações de fosfato determinadas na etapa 6.5 para nanomoles de pólipo-derivado de fosfato em cada célula inteira lisado de acordo com a seguinte fórmula:
    Pólipo nmol = 1,5 x (fosfato µM / 10)
    Nota: O método baseado na curva padrão no passo 6 determina a concentração de fosfato (em µM) em cada amostra de pólipo 100 µ l aliquotadas na etapa 5.2. Para converter esta concentração em um número de nmol, 100 µ l é dividido por 106 para dar um volume em L, multiplicado pela concentração (µmol L-1) e, em seguida, multiplicado por 1.000 (o número de nmol em um µmol). Isso reduz a dividir a concentração por 10. O volume total do extrato preparado no passo 4 é 150 µ l, portanto, é necessário multiplicar o valor resultante por 1,5 para calcular o nmol de fosfato presente no extracto de todo.
  2. Normalize o conteúdo celular do pólipo a proteína celular total dividindo nmol pólipo pela proteína total em cada amostra determinada na etapa 3,4 mg. Níveis de pólipo são expressas em termos de concentração de individual fosfato livre derivado de pólipo.
    Nota: Em alguns casos, a quantidade de fosfato derivado de pólipo presente em uma amostra pode cair fora do intervalo linear da curva padrão de fosfato (passo 6.5). Se os níveis de pólipo são muito elevados, o eluato contendo pólipo excesso da etapa 4.6 pode ser diluídos 01:10 ou 1: 100, conforme necessário e então medido novamente, conforme descrito nas etapas 5 a 7.

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Resultados

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As principais etapas do protocolo são feito de forma simplificada na Figura 1o diagrama elabore.

Para demonstrar o uso do presente protocolo com bactérias Gram-negativas, selvagem-tipo e. coli MG165539 foi crescido a fase log de mid LB médio rico a 37 ° C, com agitação (200 rpm), em seguida lavadas e incubadas durante um adicional 2 h em morpholinopropanesulfonate-ta...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descrito aqui simplifica e acelera a quantificação dos níveis de pólipo em diversas bactérias, com um conjunto típico de 24 amostras tomar cerca de 1,5 h para processar totalmente. Isto permite a rápida seleção de amostras e análise de bibliotecas mutantes e simplifica experimentos cinéticos medindo o acúmulo de pólipo ao longo do tempo. Demonstrámos que o protocolo funciona de forma eficaz aos representantes de três filos diferentes: proteobacteria, firmicutes e actinobacteria, que são famosos por sua resist...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este projecto foi apoiado por Universidade de Alabama em Birmingham, departamento de microbiologia inicialização fundos e NIH grant R35GM124590 (MJG) e NIH grant R01AI121364 (FW).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plasmídeo pScPPX2Addgene112877disponível para instituições acadêmicas e outras instituições sem fins lucrativos
LB caldoFisher ScientificBP1427-2E. coli meio de crescimento
ampicilinaFisher ScientificBP176025
isopropilo β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)Gold BiotechnologyI2481C
Tampão HEPESGold BiotechnologyH-400-1
hidróxido de potássio (KOH)Fisher ScientificP250500para ajustar o pH de soluções tamponada com HEPES
cloreto de sódio (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazolFisher ScientificO3196500
lisozimaFisher ScientificAAJ6070106
cloreto de magnésio (MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) é um substituto aceitável
Modelo 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120outros métodos de lise celular (por exemplo, French Press) também podem ser eficazes
5 mL HiTrap quelante coluna HPGE Life Sciences17040901qualquer coluna de cromatografia de afinidade de níquel ou resina pode ser substituída
sulfato de níquel (II) hexahidratadoFisher ScientificAC415611000para carregar a coluna HiTrap
0,8 µ Filtros de seringa de acetato de celulose de tamanho de poro FisherScientific09-302-168
Reagente BradfordBio-Rad5000205
Tris bufferFisher ScientificBP1525
Spectrum  Spectra/Por 4 RC Tubo de membrana de diálise 12.000 a 14.000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667Boutras membranas de diálise com MWCO < 30.000 Da também devem funcionar
ácido clorídrico (HCl)Fisher ScientificA144-212para ajustar o pH de soluções tamponada com Tris
cloreto de potássio (KCl)Fisher ScientificP217500
glicerolFisher ScientificBP2294
10x MOPS mistura de meio TeknovaM2101E. coli meio de
crescimentoglicose Fisher ScientificD161
fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
fosfato de potássio dibásico (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
Fisher ScientificDF0886-17-0
triptonaFisher ScientificBP1421-500
sulfato de magnésio heptahidratadoFisher ScientificM63-50
sulfato de manganês monohidratadoFisher ScientificM113-500
guanidina isotiocianatoFisher ScientificBP221-250
albumina de soro bovino (livre de protease)Fisher ScientificBP9703100
placas de fundo plano transparente de 96 poçosSigma-AldrichM0812-100EAqualquer placa transparente de 96 poços funcionará
Tecan M1000 Leitor de placas infinitasTecan, Inc.não aplicávelqualquer leitor de placas capaz de medir a absorbância a 595 e 882 nm funcionará
etanolFisher Scientific04-355-451
colunas de rotação de membrana de sílicaEpoch Life Science1910-050/250
ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Fisher ScientificBP120500
tubos de microfífugas de 1,5 mLFisher ScientificNC9580154
acetato de amônioFisher ScientificA637-500
tartarato de potássio de antimônioFisher ScientificAAA1088922
4 N ácido sulfúrico (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
heptamolibdato de amônioFisher ScientificAAA1376630
ácido ascórbicoFisher AC401471000
por Extrato de levedura desidratada Científica

Referências

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