Name: Análise para inorgânico polifosfato em bactérias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprenda a quantificar polifosfato inorgânico em bactérias de forma rápida, sensível e econômica. Este método simplificado aplica-se a espécies Gram-negativas, Gram-positivas e micobacterianas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este projecto foi apoiado por Universidade de Alabama em Birmingham, departamento de microbiologia inicialização fundos e NIH grant R35GM124590 (MJG) e NIH grant R01AI121364 (FW).

1. purificação do fermento Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>Transforme a tensão de superexpressão de proteínas Escherichia coli BL21(DE3)31 com plasmídeo pScPPX26 por eletroporação32 ou transformação química33.</li>
	<li>Inocular 1 L de caldo lisogenia (LB) contendo 100 µ g ampicilina de-1 de mL em um frasco de 2 L unbaffled com uma única colônia de BL21(DE3) contendo pScPPX2 e incubar durante a noite a 37 ° C, sem agitação, uma absorção em 600 nm (600) de aproximadamente 0.3, como medido em um espectrofotômetro.</li>
	<li>Começar a cultura tremendo (180 rpm) e incube por 30 min a 37 ° C, durante o qual as células se expandirão para um A600 de 0,4 - 0,5.</li>
	<li>Adicione o isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 1 mM e uma ampicilina adicional em 100 µ g-1 de mL e, em seguida, incubar por 4 h a 37 ° C com agitação a 180 rpm. Nota: Este protocolo superexpressão gera uma grande quantidade de ScPPX solúvel. No entanto, ScPPX superexpressão é muito indulgente, e uma variedade de outros protocolos comuns de superexpressão de proteínas têm sido utilizados para purificar com sucesso ScPPX.</li>
	<li>Transferir as células para uma garrafa de centrífuga de 1L e colhê-las por centrifugação por 20 min a 5000 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante e transferir o centrifugado para um tubo cónico de 50 mL. Nota: Podem ser armazenadas indefinidamente pelotas de célula de resíduos a-80 ° C.</li>
	<li>Descongelar a pelota no gelo e, em seguida, resuspenda-lo em 9 mL de 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl e imidazol 5 mM (pH 8) para um volume total de cerca de 10 mL.</li>
	<li>Adicionar 50 unidades mL-1 de uma endonuclease degradante de RNA e DNA, 2 mM MgCl2e lisozima de-1 (concentrações finais) 1mg mL (ver Tabela de materiais) e incube por 30 min no gelo. Nota: ScPPX vincula os ácidos nucleicos (dados não mostrados), para tratamento de nuclease é essencial durante a purificação.</li>
	<li>Usando um sonicador com um microtip (ver Tabela de materiais), lyse as pilhas por 2 ciclos de sonication no gelo em 50% de energia, pulsando 5 s no e 5 s, com um descanso de 2min entre ciclos. Nota: Use proteção auditiva adequada durante sonication. Da mesma forma para o caso com superexpressão, uma variedade de métodos de lise celular são aceitáveis para a purificação de ScPPX.</li>
	<li>Remover os resíduos insolúveis por centrifugação o lisado por 20 min a 20.000 x g a 4 ° C. Filtre o sobrenadante resultante (aproximadamente 10 mL) através de um filtro de seringa de acetato de celulose de tamanho dos poros 0,8 µm.</li>
	<li>Carregar o lisado para um níquel-cobrado 5ml quelantes coluna (ver Tabela de materiais) usando uma seringa grande ou uma bomba peristáltica.</li>
	<li>Lave a coluna com 50 mL de imidazole de 5mm HEPES, 0,5 M de NaCl, de 50 mM (pH 8).</li>
	<li>Lave a coluna com 50 mL de imidazole de 20mm HEPES, 0,5 M de NaCl, de 50 mM (pH 8).</li>
	<li>Eluir ScPPX com 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl e imidazol 0,5 M (pH 8), coleta 15 frações de 1 mL. Testar essas frações de eluição para teor de proteínas com a proteína de Bradford ensaio34 (ver Tabela de materiais) e executar um gel de SDS-PAGE35 para confirmar quais frações contêm ScPPX purificado (peso molecular = 45 kDa).</li>
	<li>As frações contendo ScPPX pura do pool e ajustar a concentração da proteína em pool de aproximadamente 2 mg mL-1 com 50 mM HEPES e 0,5 M de NaCl. Altas concentrações de proteína podem precipitar na próxima etapa.</li>
	<li>Troca o ScPPX purificado no buffer de armazenamento (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM KCl, glicerol 10% [v/v]) pela diálise. Coloque em pool ScPPX frações de um comprimento selado de 12.000-14.000 Da peso molecular corte diálise membrana tubos (ver Tabela de materiais) e suspender em 1 L de buffer de armazenamento, com agitação contínua a 4 ° C pelo menos 4 h. Repita este passo com fresco buffer de armazenamento para um total de 3 alterações de reserva.</li>
	<li>Transferi a proteína purificada, dializada para um tubo de centrifugação ou tubos e centrifugar por 20 min a 20.000 x g a 4 ° C para remover quaisquer agregados insolúveis. Transferi com cuidado o sobrenadante para um tubo cônico limpo 15 mL.</li>
	<li>Ajustar a concentração da ScPPX purificado para 1 mg mL-1 , com buffer de armazenamento, adicionar 0,1% (p/v) albumina de soro bovina indemne de protease (BSA; concentração final) e a loja por até 6 meses a 4 ° C. Nota: ScPPX perde mais de 90% da sua actividade quando é congelado13.</li>
</ol>2. a colheita de amostras para a extração de polifosfato
<ol><li>Cresce bactérias nas condições de interesse para a determinação do teor de pólipo. Para este protocolo, cresce Lactobacillus reuteri36 durante a noite a 37 ° C sem tremer na enzima málico indução (MEI) médio37 sem cisteína (MEI-C).</li>
	<li>Colheita de células suficientes por centrifugação em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL ao total de 50 a 100 µ g de proteína celular (consulte a etapa 3 abaixo). Para Escherichia coli, este é 1 mL de uma cultura de fase de log em um A600 de 0,2 - 0,4. Para L. reuteri, isto é 1 mL de uma cultura durante a noite. Ajuste como necessário para outras espécies de interesse.</li>
	<li>Remova completamente o sobrenadante de Pelotas a célula.</li>
	<li>Resuspenda as pelotas de célula em 250 µ l de tampão de Lise GITC (isotiocianato de guanidina de 4 M, 50 mM Tris-HCl, pH 7) e lyse de incubação a 95 ° C por 10 min. lysates loja a-80 ° C. Nota: Coadunar-se com o tempo de Lise, desde a incubação prolongada a alta temperatura pode resultar em degradação do pólipo por hidrólise38. Lisados podem ser armazenados indefinidamente a-80 ° C. Cuidado: Isotiocianato de guanidina é um sal de caotrópicas e deve ser manipulado com luvas e eliminado como resíduos perigosos.</li>
</ol>3. medir o teor de proteína de lisados celulares
<ol><li>Prepare padrões de BSA contendo 0, 0,1, 0,2 e 0,4 mg mL-1 de BSA em tampão de Lise GITC. Nota: É importante fazer os padrões de BSA em GITC, desde GITC influencia o desenvolvimento de cor do ensaio Bradford. Padrões de BSA podem ser armazenados indefinidamente a-20 ° C.</li>
	<li>Alíquota 5 µ l de lisados celulares descongelado, bem misturado e de padrões de BSA para separar poços de uma placa de 96 poços claros.</li>
	<li>Adicione 195 µ l de reagente de Bradford34 a cada poço e medir a absorvância a 595 nm (595) em um leitor de placas (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Calcular a quantidade de proteína em cada poço por comparação com a curva padrão de BSA, usando a fórmula y = mx + b, onde y é um595, x é µ g de BSA, m é a inclinação da curva de calibração a e b é a interseção y da curva padrão. Multiplique o valor resultante por 0.05 para determinar o total mg de proteína em cada amostra.</li>
</ol>4. extrair polifosfato
<ol><li>Adicione 250 µ l de etanol a 95% para cada amostra GITC-lysed e vórtice para misturar.</li>
	<li>Aplique essa mistura para uma coluna de rotação de membrana de sílica e centrifugar por 30 s a 16.100 x g.</li>
	<li>Descartar o escoamento e, em seguida, adicionar 750 µ l de 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de NaCl, 5 mM EDTA, 50% de etanol e centrifugar por 30 s a 16.100 x g.</li>
	<li>Descarte o escoamento e centrifugar por 2min a 16.100 x g.</li>
	<li>Coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga limpos 1,5 mL e adicionar 150 µ l de 50 mM Tris-HCl (pH 8).</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente por 5 min e, em seguida, eluir pólipo por centrifugação por 2 min a 8.000 x g. Nota: Se desejar, os eluídos podem ser armazenados a-20 º C pelo menos 1 semana.</li>
</ol>5. digestão polifosfato
<ol><li>Prepare normas contendo 0, 5, 50 ou fosfato de potássio 200 µM em 50 mM Tris-HCl (pH 8). Nota: As normas de fosfato de potássio podem ser armazenadas indefinidamente em temperatura ambiente.</li>
	<li>Alíquota 100 µ l de cada padrão de fosfato e de extrair amostras de pólipo em separado poços de uma placa de 96 poços claros.</li>
	<li>Preparar uma mistura de mestre contendo (por amostra): 30 µ l de 5 x ScPPX reação buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, acetato de amónio de 250 mM, pH 7,5)13, 19 µ l de H2O e 1 µ l de ScPPX purificado (1 mg mL-1).</li>
	<li>Adicione 50 µ l do mix mestre para cada poço da placa de 96 poços. Incube por 15 min a 37 ° C. Nota: Se desejar, as amostras de pólipo digerida podem ser armazenadas a-20 ° C indefinidamente.</li>
</ol>6. detecção de fosfato livre24
<ol><li>Preparar a solução de deteção base dissolvendo 0,185 g de tartarato de potássio antimónio em 200 mL de água, adicionar 150 mL de 4 H N2então4, em seguida, adicionando 1,49 g de heptamolibdato de amónio. Mexa para dissolver e então trazer até um volume final de 456 mL. Filtre a solução para remover partículas e armazenar protegido da luz a 4 ° C por até 1 mês.</li>
	<li>Prepare uma solução de ácido ascórbico de 1m. Armazenar protegido da luz a 4 ° C por até 1 mês.</li>
	<li>Prepare um estoque de trabalho fresca da solução de deteção cada dia misturando 9,12 mL da solução de deteção base com 0,88 mL de ácido ascórbico de 1m. Permitir que a solução de deteção vir à temperatura ambiente antes do uso.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de solução de deteção para cada amostra e padrão da placa de 96 poços e incubar a temperatura ambiente por cerca de 2 minutos permitir o desenvolvimento de cor.</li>
	<li>Medir a absorvância a 882 nm com um leitor de placas e calcular a concentração de fosfato de cada amostra em comparação com a curva padrão de fosfato de potássio. Atenção: A solução de deteção contém sais tóxicos e ácidos fortes. Use luvas e tratar a solução em excesso como resíduos tóxicos.</li>
</ol>7. calcular o conteúdo celular do polifosfato
<ol><li>Converta as concentrações de fosfato determinadas na etapa 6.5 para nanomoles de pólipo-derivado de fosfato em cada célula inteira lisado de acordo com a seguinte fórmula: Pólipo nmol = 1,5 x (fosfato µM / 10) Nota: O método baseado na curva padrão no passo 6 determina a concentração de fosfato (em µM) em cada amostra de pólipo 100 µ l aliquotadas na etapa 5.2. Para converter esta concentração em um número de nmol, 100 µ l é dividido por 106 para dar um volume em L, multiplicado pela concentração (µmol L-1) e, em seguida, multiplicado por 1.000 (o número de nmol em um µmol). Isso reduz a dividir a concentração por 10. O volume total do extrato preparado no passo 4 é 150 µ l, portanto, é necessário multiplicar o valor resultante por 1,5 para calcular o nmol de fosfato presente no extracto de todo.</li>
	<li>Normalize o conteúdo celular do pólipo a proteína celular total dividindo nmol pólipo pela proteína total em cada amostra determinada na etapa 3,4 mg. Níveis de pólipo são expressas em termos de concentração de individual fosfato livre derivado de pólipo. Nota: Em alguns casos, a quantidade de fosfato derivado de pólipo presente em uma amostra pode cair fora do intervalo linear da curva padrão de fosfato (passo 6.5). Se os níveis de pólipo são muito elevados, o eluato contendo pólipo excesso da etapa 4.6 pode ser diluídos 01:10 ou 1: 100, conforme necessário e então medido novamente, conforme descrito nas etapas 5 a 7.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo descrito aqui simplifica e acelera a quantificação dos níveis de pólipo em diversas bactérias, com um conjunto típico de 24 amostras tomar cerca de 1,5 h para processar totalmente. Isto permite a rápida seleção de amostras e análise de bibliotecas mutantes e simplifica experimentos cinéticos medindo o acúmulo de pólipo ao longo do tempo. Demonstrámos que o protocolo funciona de forma eficaz aos representantes de três filos diferentes: proteobacteria, firmicutes e actinobacteria, que são famosos por sua resist...

Polifosfatos inorgânicos (pólipo) é um biopolímero linear de unidades phosphoanhydride-lig fosfato que é encontrado em todos os domínios da vida1,2,3. Em diversas bactérias, pólipo é essencial para a resposta ao estresse, motilidade, formação de biofilmes, controlo do ciclo celular, resistência aos antibióticos e virulência4,5,6,7,8 ,9,10,11. Estudos de metabolismo de pólipo em bactérias, portanto, têm o potencial de produzir insights fundamentais sobre a capacidade das bactérias que causam a doença e prosperam em ambientes diversos. Em muitos casos, no entanto, os métodos disponíveis para quantificação de pólipo em células bacterianas são um fator limitante nestes estudos.
Existem vários métodos atualmente usados para medir os níveis de pólipo em materiais biológicos. Esses métodos normalmente envolvem duas etapas distintas: extração de pólipo e quantificar o pólipo presentes nesses extratos. O método padrão ouro atual, desenvolvido para a levedura Saccharomyces cerevisiae por Bru e colegas12, extractos de pólipo juntamente com DNA e RNA usando fenol e clorofórmio, seguido de precipitação do álcool etílico, tratamento com desoxirribonuclease (DNase) e ribonuclease (RNase) e a digestão do pólipo purificada resultante com S. cerevisiae pólipo-degradante enzima exopolyphosphatase (ScPPX)13 ao rendimento livre de fosfato, que é em seguida quantificado usando um ensaio colorimétrico baseado em verde malaquita. Este procedimento é altamente quantitativo mas trabalhoso, limitando o número de amostras que podem ser processados em uma única experiência e não é otimizado para amostras bacterianas. Outros relataram extraindo pólipo de uma variedade de células e tecidos usando esferas de sílica ("glassmilk") ou sílica membrana colunas6,14,15,16,17, 18. Esses métodos não eficientemente extrair cadeia curta pólipo (menos de 60 unidades de fosfato)12,14,15, embora isso seja menos preocupante para as bactérias, que são pensados geralmente para sintetizar principalmente Pólipo de cadeia longa3. Antigos métodos de extração de pólipo usando ácidos fortes19,20 são não mais amplamente utilizados, desde que o pólipo é instável sob condições ácidas12.
Há também uma variedade de métodos relatados para quantificação de pólipo. Entre as mais comuns é ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), um corante fluorescente mais normalmente usado para manchar o DNA. Complexos de DAPI-pólipo tem maxima de excitação e emissão de fluorescência diferentes de DAPI-DNA complexos21,22, mas há considerável interferência de outros componentes celulares, incluindo o RNA, nucleotídeos e inositol fosfatos de12,15,16,23, reduzindo a especificidade e a sensibilidade das medições de pólipo feito usando este método. Alternativamente, o pólipo e difosfato de adenosina (ADP) podem ser convertidas em adenosina trifosfato (ATP) usando purificada Escherichia coli quinase pólipo (PPK) e o ATP resultante quantificados usando luciferase14,17 ,18. Isto permite a detecção de pequenas quantidades de pólipo, mas requer duas etapas de reação enzimática e luciferina e ADP muito puro, que são reagentes caros. ScPPX especificamente digere pólipo em fosfato livre6,12,13,,24, que pode ser detectada usando métodos mais simples, mas ScPPX é inibido por DNA e RNA12, tratamento de DNase e RNase necessária de pólipo contendo extratos. PPK nem ScPPX estão disponíveis comercialmente, e purificação de PPK é relativamente complexo25,26.
Pólipo no lisados celulares ou extratos também pode ser visualizado em gel de poliacrilamida por DAPI negativo coloração27,28,29,30, um método que permite a avaliação do comprimento da corrente, mas é baixo rendimento e mal quantitativa.
Agora, nós relatamos um ensaio rápido, barato e de rendimento médio pólipo que permite rápida quantificação de pólipo níveis em diversas espécies bacterianas. Este método começa por lise de células bacterianas a 95 ° C, em 4 M guanidina isotiocianato (GITC)14 para inactivar fosfatases celulares, seguidos de uma extração de coluna de membrana de sílica otimizada para processamento rápido de amostras múltiplas. O extrato contendo pólipo resultante é então digerido com um grande excesso de ScPPX, eliminando a necessidade de tratamento de DNase e RNase. Nós incluímos um protocolo para a purificação de afinidade de níquel simples de quantidades de mg de ScPPX. Finalmente, fosfato livre derivado de pólipo é quantificado com um ensaio colorimétrico simples, sensível, à base de ácido ascórbico24 e normalizado a proteína celular total. Este método simplifica a medição de pólipo em células bacterianas, e vamos mostrar seu uso com espécies representativas de bactérias Gram-negativas, bactérias gram-positivas e micobactérias.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Millipore Sigma</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo pScPPX2</td><td>Addgene</td><td>112877</td><td>disponível para instituições acadêmicas e outras instituições sem fins lucrativos</td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-2</td><td>E. coli meio de crescimento</td></tr><tr><td>ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176025</td><td></td></tr><tr><td>isopropilo &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td></td></tr><tr><td>Tampão HEPES</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-400-1</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de potássio (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250500</td><td>para ajustar o pH de soluções tamponada com HEPES</td></tr><tr><td>cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196500</td><td></td></tr><tr><td>lisozima</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6070106</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Universal Nuclease</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88700</td><td>Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) é um substituto aceitável</td></tr><tr><td>Modelo 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-120</td><td>outros métodos de lise celular (por exemplo, French Press) também podem ser eficazes</td></tr><tr><td>5 mL HiTrap quelante coluna HP</td><td>GE Life Sciences</td><td>17040901</td><td>qualquer coluna de cromatografia de afinidade de níquel ou resina pode ser substituída</td></tr> por <tr><td>sulfato de níquel (II) hexahidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC415611000</td><td>para carregar a coluna HiTrap</td></tr><tr><td>0,8 &micro; Filtros de seringa de acetato de celulose de tamanho de poro Fisher</td><td>Scientific</td><td>09-302-168</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum&nbsp; Spectra/Por 4 RC Tubo de membrana de diálise 12.000 a 14.000 Dalton MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667B</td><td>outras membranas de diálise com MWCO < 30.000 Da também devem funcionar</td></tr><tr><td>ácido clorídrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>para ajustar o pH de soluções tamponada com Tris</td></tr><tr><td>cloreto de potássio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217500</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2294</td><td></td></tr><tr><td>10x MOPS mistura de meio Teknova</td><td></td><td>M2101</td><td>E. coli meio de</td></tr><tr><td>crescimento</td><td>glicose Fisher Scientific</td><td>D161</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potássio dibásico (K2HPO4)</td> Extrato de levedura desidratada <td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0</td><td></td></tr><tr><td>triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-50</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de manganês monohidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>M113-500</td><td></td></tr><tr><td>guanidina isotiocianato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP221-250</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino (livre de protease)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>placas de fundo plano transparente de 96 poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812-100EA</td><td>qualquer placa transparente de 96 poços funcionará</td></tr><tr><td>Tecan M1000 Leitor de placas infinitas</td><td>Tecan, Inc.</td><td>não aplicável</td><td>qualquer leitor de placas capaz de medir a absorbância a 595 e 882 nm funcionará</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>colunas de rotação de membrana de sílica</td><td>Epoch Life Science</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microfífugas de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9580154</td><td></td></tr><tr><td>acetato de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>tartarato de potássio de antimônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1088922</td><td></td></tr><tr><td>4 N ácido sulfúrico (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA818-500</td><td></td></tr><tr><td>heptamolibdato de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1376630</td><td></td></tr><tr><td>ácido ascórbico</td><td>Fisher AC401471000</td><td></td><td></td> Científica</tr></tbody></table>

análise para inorgânico polifosfato em bactérias

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Polifosfatos inorgânicos (pólipo) é um polímero biológico encontrado nas células de todos os domínios da vida e é necessário para a virulência e resposta ao estresse em muitas bactérias. Há uma variedade de métodos para quantificação de pólipo em materiais biológicos, muitos dos quais são trabalhosos ou insensível, limitando sua utilidade. Apresentamos aqui um método simplificado para quantificação de pólipo em bactérias, usando uma extração de coluna de membrana de silicone otimizada para processamento rápido de várias amostras, digestão do pólipo com o pólipo específicas exopolyphosphatase ScPPX e a detecção do fosfato livre resultante com um ensaio colorimétrico sensível à base de ácido ascórbico. Este procedimento é simples, barato e permite a quantificação confiável pólipo em diversas espécies bacterianas. Apresentamos a quantificação de pólipo representativa de bactéria Gram-negativa (Escherichia coli), bactéria Gram-positivas de ácido lático (Lactobacillus reuteri) e as espécies de micobactérias (Mycobacterium smegmatis). Nós também incluímos um protocolo simples para a purificação de afinidade niquelar de quantidades de mg de ScPPX, que não está atualmente disponível comercialmente.

As principais etapas do protocolo são feito de forma simplificada na Figura 1o diagrama elabore.
Para demonstrar o uso do presente protocolo com bactérias Gram-negativas, selvagem-tipo e. coli MG165539 foi crescido a fase log de mid LB médio rico a 37 ° C, com agitação (200 rpm), em seguida lavadas e incubadas durante um adicional 2 h em morpholinopropanesulfonate-ta...

Nós descrevemos um método simples para a rápida quantificação dos polifosfatos inorgânicos em diversas bactérias, incluindo espécies de micobactérias, Gram-positivas e Gram-negativas.

Análise para inorgânico polifosfato em bactérias

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

O polifosfato inorgânico é um elemento-chave na resposta ao estresse bacteriano. Mas os métodos mais antigos para extrair e medir o pólipo em bactérias são complexos e intensivos em mão-de-obra. A principal vantagem desta técnica é que ela permite quantificação rápida, sensível e barata dos níveis de pólipo em uma variedade de diferentes espécies bacterianas.O procedimento será demonstrado por Arya Pokhrel, uma estudante de graduação do meu laboratório. Para começar, cresça bactérias lactobacillus reuteri em meio de indução de enzimas malic sem cistina a 37 graus celsius durante a noite sem tremer. Centrifugar um mililitro desta cultura durante a noite em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para colher células suficientes para produzir um total de 50 a 100 microgramas de proteína celular.Remova o supernascer da pelota celular completamente e adicione 250 microliters gitc lysis buffer e resuspend por vórtice. Incubar a 95 graus celsius por 10 minutos para lise as células. Armazene o lysate a 80 graus celsius.Primeiro, prepare os padrões BSA contendo zero, 1, 2 e 4 miligramas por mililitro de BSA no buffer de lise GITC. Aliquot cinco microliters de lisatos de células bem mistas e cinco microliters de padrões BSA para separar poços em uma placa clara de 96 poços. Adicione 195 microliters de reagente bradford a cada poço e meça absorvância em 595 nanômetros em um leitor de placas.Calcule a quantidade de proteína em cada poço em comparação com a curva padrão BSA, conforme descrito no manuscrito. Para determinar a quantidade total de proteína em cada amostra, multiplique o valor resultante por 05. Para iniciar a extração de polifosfato, adicione 250 microlitadores de 95% de etanol a cada amostra de linfose e vórtice de GITC para misturar.Pipeta esta mistura a uma coluna de rotação de membrana de sílica colocada em um tubo centrífuga de 1,5 mililitro. Centrífuga a 16, 100 g por 30 segundos. Descarte o fluxo através e adicione 750 microlitradores do tris-cloridrato, cloreto de sódio, EDTA e mistura de etanol.Centrífuga a 16, 100 gs por 30 segundos. Descarte o fluxo através e centrifugar a coluna de giro a 16, 100 gs por dois minutos. Coloque a coluna em um tubo de microfuça de 1,5 mililitro limpo.Adicione 150 microlitres de 50 mililitros pH oito tris-cloridrato, e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Elute polyP por centrifugação a 8.000 g por dois minutos. Comece por preparar padrões contendo zero, cinco, 50 ou 200 fosfato de potássio micromolar em 50 mililitros pH oito tris-cloridrato.Alíquota de 100 microlitadores de cada padrão fosfato e 100 microliters de amostras de pólipo extraídas em poços separados de uma placa clara de 96 poços. Prepare uma mistura mestre contendo, por amostra, 30 microliters de 5X ScPPX tampão de reação, 19 microliters de água e um microliter de ScPPX purificado. Adicione 50 microliters da mistura mestre a cada poço da placa de 96 poços.E incubar por 15 minutos a 37 graus celsius. No dia da detecção, prepare um novo estoque de solução de detecção misturando-se a 9,12 mililitros de base de solução de detecção com 88 mililitros de um ácido ascórbico molar, e permita que ele chegue à temperatura ambiente antes do uso. Adicione 50 microliters de solução de detecção a cada amostra e padrões na placa de 96 poços.Para permitir o desenvolvimento de cores, incubar a placa em temperatura ambiente por aproximadamente dois minutos. Use um leitor de placas para medir a absorvância em 882 nanômetros e calcular a concentração de fosfato de cada amostra em comparação com a curva padrão fosfato de potássio. Em seguida, converta as concentrações de fosfato em nanomoles de fosfato derivado de pólipo em cada célula lysate e normalize o teor de pólipo celular em proteína celular total, como descrito no manuscrito.E.coli, uma bactéria gram-negativa, cultivada em LB não produziu pólipo. Mas quando cultivado em MOPS, produziu cerca de 192 nanomoles de pólipo por miligrama de proteína total. Um mutante E.coli delta ppk, que não tem quinase polip, não produziu pólipo em nenhum dos meios.Um mutante delta ppx, que não tem exopolyfosphatase, produziu aproximadamente a mesma quantidade de pólipo que o tipo selvagem. E o mutante delta phoB, que é defeituoso no transporte de fosfato, produziu significativamente menos pólipo do que o tipo selvagem. L.reuteri tipo selvagem, uma bactéria gram-positiva cultivada durante a noite no meio MEIC acumulou cerca de 51 nanomoles de pólipo por miligrama de proteína total.Um mutante nulo L.reuteri ppk1 sem quinase polip continha menos da metade dessa quantidade. Esta presença de pólipo no mutante nulo ppk1 é provavelmente devido a L.reuteri contendo uma segunda quinase polip. Mycobacterium smegmatis strain SMR five, cultivado em Hartmans-de Bont médio na ausência de etanol acumulado cerca de 141 nanomoles pólipos por miligrama de proteína total.Enquanto o tratamento do etanol resultou em um aumento triplo. Após este procedimento, a eletroforese de gel de acrilamida pode ser realizada para avaliar diferenças no comprimento da cadeia de pólipo. Ao tentar este procedimento, evite erros comuns.Lembre-se de evitar obter bolhas em poços de placas de microtáticos, e tenha cuidado para transferir suas amostras para o tubo apropriado ao mudar da coluna para o tubo de microfuge. Não se esqueça que trabalhar com GITC e ácidos fortes pode ser perigoso, e equipamentos de proteção adequados devem ser sempre usados durante a realização deste procedimento.

assaying-for-inorganic-polyphosphate-in-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo descreve um método de alto rendimento da hidrólise enzimática que utiliza um leitor de microplacas para medir e classificar o fósforo do solo como P monoésteres, diésteres de P inorgânico e P. Até 96 amostras podem ser medidos de uma só vez em um laboratório padrão.

High-Throughput medição e classificação de P orgânico em amostras ambientais

Pirofosfatos inositol desempenhar um papel importante em patologias humanas como câncer, diabetes e obesidade, no entanto, o mecanismo exato de ação é uma questão de disputa. A falta de disponível comercialmente pirofosfatos inositol estudos detalhados torna problemática. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para produzir e isolar miligramas de pirofosfatos inositol.

Preparação de Qualidade pirofosfatos Inositol

Fonte: Pokhrel, A., et al. Ensaio para polifosfato inorgânico em bactérias. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra um ensaio colorimétrico para medir o polifosfato inorgânico (polyP) em amostras bacterianas. O procedimento envolve a conversão enzimática do poliP em fosfato livre, que então reage com o molibdato e o ácido ascórbico para produzir um complexo de cor azul. Ao comparar a absorbância deste complexo com uma curva padrão de concentrações de fosfato conhecidas, o conteúdo de poliP em...

Um ensaio para a quantificação de polifosfato inorgânico em bactérias

Fonte: Vidilaseris, K., et al. Triagem para inibidores de pirofosfatase ligados à membrana de Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um ensaio colorimétrico para rastrear inibidores da pirofosfatase ligada à membrana bacteriana (mPPase) quantificando a liberação de ortofosfato. O método permite a identificação de compostos que inibem a mPPase de Thermotoga maritima, um potencial alvo de drogas antimicrobianas.

Triagem de inibidores da pirofosfatase ligada à membrana bacteriana usando um ensaio colorimétrico 

Este artigo apresenta um procedimento para investigar a adsorção de fosfonatos em ferro-contendo materiais de filtro, particularmente granular hidróxido férrico, com pouco esforço e alta confiabilidade. Em uma solução tamponada, o fosfonato é posto em contacto com o adsorvente usando um rotador e em seguida analisado através de um método de determinação de fósforo miniaturizados.

Procedimento otimizado para determinar a adsorção de fosfonatos para Granular hidróxido férrico, usando um método de determinação de fósforo miniaturizado

Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.

Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

Neste manuscrito, estabelecemos um método de alto throughput para quantificar a atividade da fosfatase alcalina na cultura de S. aureus biofilme da placa de 96 poços de cultura de...

Colorimétrico análise de alcalina fosfatase atividade no biofilme de S. aureus

O crescimento de culturas bacterianas radiolabeled em pratos do de microtitulação facilita a amostragem elevada da taxa de transferência que permite testes técnicos e biológicos múltiplos da repetição da abundância da associação do nucleotide, incluindo aquele de (p) ppgpp. Os efeitos das transições de crescimento provocados por fontes de estresse fisiológico, bem como a recuperação do estresse podem ser monitorados.

Usando microtiter prato Radiolabeling para múltiplo in vivo medições de Escherichia coli (p) ppGpp seguido por cromatografia em camada fina

Aqui apresentamos um método de triagem para inibidores de pirofosfatase ligado à membrana (da Thermotoga maritima)com base na reação azul molibdênio em um formato de placa de 96 poços.

Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga

Este protocolo descreve um ensaio nãoradioativo para medir a atividade de quinase de quinases (PNKs) em pequenos substratos de DNA e RNA.

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

Um procedimento para espectrometria de massa por ionização por eletrospray de eletroforese capilar para a quantificação absoluta de pirofosfatos de inositol de extratos de células de mamíferos é descrito.

Quantificação Absoluta de Pirofosfatos de Inositol por Eletroforese Capilar Eletrospray Ionização Espectrometria de Massa

Aprenda a quantificar polifosfato inorgânico em bactérias de forma rápida, sensível e econômica. Este método simplificado aplica-se a espécies Gram-negativas, Gram-positivas e micobacterianas.

Análise para inorgânico polifosfato em bactérias

Explorar mais vídeos