Artigo de método

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

DOI:

10.3791/58820

⸱

31 de janeiro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo de caracterização de partículas nucleossoma no nível do único-molécula usando microscopia estático e Time-Lapse de força atômica (AFM), técnicas de imagem. O método de superfície functionalization descrito permite a captura da estrutura e dinâmica dos nucleosomes em alta resolução em nanoescala.

Resumo

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Cromatina, que é uma longa cadeia de subunidades nucleossoma, é um sistema dinâmico que permite tais processos críticos como replication do DNA e transcrição para tomar lugar em células eucarióticas. A dinâmica dos nucleosomes fornece acesso ao DNA por máquinas de replicação e transcrição e contribui criticamente para os mecanismos moleculares subjacentes funções de cromatina. Estudos da único-molécula como a microscopia de força atômica (AFM) imagem contribuíram significativamente para a nossa compreensão atual do papel do nucleossoma estrutura e dinâmica. O atual protocolo descreve as etapas permitindo técnicas de alta resolução de imagem AFM estudar as propriedades estruturais e dinâmicas de nucleosomes. O protocolo é ilustrado por dados AFM obtidos para os nucleosomes Centrómero na qual histona H3 é substituída com sua contraparte Centrómero de proteína (CENP-A). O protocolo começa com a montagem do mono-nucleosomes usando um método de diluição contínua. A preparação do substrato mica acrescida com aminopropil silatrane (APS-mica) que é usado para o tratamento de imagens de nucleossoma é fundamental para a visualização de AFM de nucleosomes descrito e o procedimento para preparar o substrato é fornecido. Os nucleossomas depositados na superfície de APS-mica são primeiro fotografados usando AFM estático, que capta um instantâneo da população nucleossoma. De análises destas imagens, parâmetros, tais como o tamanho do DNA enrolado os nucleosomes podem ser medidos e este processo também é detalhado. O lapso de tempo AFM de imagem procedimento no líquido é descrito para o AFM de lapso de tempo de alta velocidade que pode capturar vários quadros da dinâmica nucleossoma por segundo. Finalmente, a análise da dinâmica do nucleossoma permitindo a caracterização quantitativa dos processos dinâmicos é descrita e ilustrada.

Introdução

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Em células eucariontes, o DNA é altamente condensado e organizado em cromossomos. 1 o primeiro nível de organização do DNA dentro de um cromossomo é o assembly de nucleosomes no qual 147 bp de DNA firmemente é acondicionada em torno de um núcleo de octamer de histona. 2 , 3 partículas nucleossoma montam sobre uma longa molécula de DNA, formando uma matriz de cromatina que é então organizada até uma unidade altamente compacto cromossomo é formada. 4 a desmontagem da cromatina fornece o acesso a livre DNA exigido pelo críticos processos celulares, tais como a replicação do genoma e a transcrição de genes, sugerindo que a cromatina é um sistema altamente dinâmico. 5 , 6 , 7 compreender as propriedades dinâmicas do DNA em vários níveis de cromatina é criticamente importante para elucidar os processos genéticos em nível molecular onde erros podem levar a morte celular ou o desenvolvimento de doenças como o câncer. 8 uma propriedade de cromatina de grande importância é a dinâmica dos nucleossomas. 9 , 10 , 11 , 12 a alta estabilidade destas partículas tem permitido a caracterização estrutural por técnicas cristalográficas. 2 o que a falta desses estudos são os detalhes dinâmicos de nucleosomes tais como o mecanismo do DNA desembrulhar do núcleo de histona; o percurso dinâmico de que é necessário para os processos de transcrição e replicação. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 além disso, as proteínas especiais denominadas fatores de remodelação foram mostradas para facilitar a desmontagem de partículas partícula17; no entanto, a dinâmica intrínseca da nucleosomes é o fator crítico neste processo que contribui para o processo de desmontagem inteira. 14 , 16 , 18 , 19

Único-molécula técnicas como único-molécula fluorescência19,20,21, captura óptica (pinças)13,18,22,23 e AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 ter sido instrumental na compreensão da dinâmica dos nucleosomes. Entre esses métodos, AFM beneficia de várias características originais e atraentes. AFM permite visualizar e caracterizar os nucleossomas individuais, bem como as matrizes mais27. Imagens de AFM, características importantes da estrutura do nucleossoma tais como o comprimento do DNA enrolado em torno do núcleo de histona podem ser medido 10,14,26,28; um parâmetro que é central para a caracterização da dinâmica desembrulhando nucleossoma. Passado o AFM estudos revelaram nucleosomes sistemas altamente dinâmicos e que o DNA pode espontaneamente desembrulhar o núcleo de histona14. O desempacotamento espontânea do DNA de nucleosomes foi visualizado diretamente pela AFM, operando no modo de lapso de tempo, quando a imagem é feita em soluções aquosas 14,26,29.

O advento da instrumentação AFM (HS-AFM) Time-Lapse de alta velocidade, foi possível visualizar o processo desembrulhando nucleossoma no milissegundo de tempo-escala 14,15,24. Recentes estudos de30 16,HS-AFM de específico nucleosomes Centrómero revelaram várias características inovadoras dos nucleosomes comparados com o tipo canônico. Os nucleossomas Centrómero constituem-se de um centrômero, uma pequena parte do cromossomo criticamente importante para cromossomo segregação31. Ao contrário dos nucleosomes canônicos na cromatina em massa, o núcleo de histona de nucleosomes Centrómero contém histona CENP-A em vez de histona H332,33. Como resultado desta substituição de histona, envolvimento de DNA em nucleosomes Centrómero é ~ 120 bp em vez do ~ 147 bp para nucleosomes canônicos; uma diferença que pode levar a morfologias distintas do centrómero e canônicos nucleosomes matrizes34, sugerindo que cromatina centrômero sofre maior dinâmica em comparação com o volume um. A dinâmica de novela exibida pela nucleosomes Centrómero em estudos de30 HS-AFM16,exemplificam a oportunidade única, fornecida por esta técnica de single-molécula Visualizar diretamente as propriedades estruturais e dinâmicas de nucleossomas. Exemplos desses recursos serão brevemente discutidos e ilustrados no final do livro. Este progresso foi feito devido ao desenvolvimento de novos protocolos para imagens de AFM dos nucleossomas, bem como as modificações de métodos existentes. O objetivo do protocolo descrito aqui é tornar esses avanços emocionantes em estudos de nucleossoma AFM único-molécula acessível a qualquer pessoa que gostaria de utilizar estas técnicas em suas investigações de cromatina. Muitas das técnicas descritas são aplicáveis a problemas além do estudo dos nucleosomes e podem ser usadas para investigações de outras proteínas e sistemas de DNA de interesse. Alguns exemplos de tais aplicações podem ser encontrados em publicações35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 e prospetos da estudos AFM de vários sistemas biomoleculares são dadas em clientes29,50,,51,53,54.

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Protocolo

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1. contínua diluição Assembly de Mono-nucleosomes

  1. Gerar e purificar um substrato de DNA aproximadamente 400 bp que contém uma nucleossoma de Widom 601 fora centrado no posicionamento de sequência. 55
    Nota: Para limitar a formação indesejada de di-os nucleossomas, cada 'braço' que flanqueiam a sequência de posicionamento não deve exceder 150 ~ bp.
    1. Use o plasmídeo pGEM3Z-601, juntamente com os primers projetados e amplificar o DNA de substrato usando PCR. Para o substrato de bp 423 com 122 e 154 comprimentos braço bp usado aqui, use para a frente (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') e reversa (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') as primeiras demão.
    2. Adicionar os tubos contendo a mistura de reação de um termociclador pré-aquecido para 95 ° C. Execute o seguinte programa para 33 ciclos após uma desnaturação inicial durante 5 min à desnaturação de ° c: 30 s 95 a 95 ° C, 30 s recozimento a 49 ° C, 35 s extensão a 72 ° C. Defina uma extensão final a 72 ° C por 10 min após os 33 ciclos.
    3. Purifica o DNA da mistura da PCR usando um Kit de purificação de PCR comercialmente disponível. Quando o DNA da coluna de limpeza do PCR de eluição, use 10 mM de tampão Tris (pH 7,5) no lugar do kit fornecido tampão de eluição.
      Nota: Tome cuidado extra para não transferir buffers entre as etapas de purificação. Um eluente contaminada pode causar problemas a jusante quando medir a concentração de DNA e/ou pode alterar a concentração de sal inicial da mistura montagem nucleossoma.
  2. Determinar a concentração de DNA por medir a absorvância de DNA purificado em 260 nm.
    1. Colete um espaço em branco no espectrofotómetro UV VIS usando apenas o 10 mM pH 7,5 eluição tampão Tris. Recolha uma medição do DNA purificado.
  3. Com a concentração determinada, alíquota 25 pmol de DNA purificado em um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL e colocá-lo em uma centrífuga a vácuo, até que a solução é pouco visível; Isto é tipicamente 30 min a 1 h.
    Nota: O substrato de DNA está agora pronto para a montagem do nucleossoma. Caso contrário, o protocolo pode ser pausado aqui e o DNA armazenado a-20 ° C até o uso.
  4. Coloque o tubo de microcentrífuga contendo o pmol 25 DNA no gelo e adicionar os componentes do conjunto nucleossoma na tabela 1, na ordem listada. Quando todos os componentes foram adicionados, retire a mistura do gelo e incubar a temperatura ambiente (RT) por 30 min.
    Nota: É fundamental que o teor de sal do buffer do histone estoque é considerado quando cálculo o NaCl necessários para obter a concentração final de 2 M. 15 , 56
  5. Monte os nucleosomes reduzindo a concentração de sal de 2 M da mistura para 200 mM utilizando uma taxa contínua de diluição. 57
    1. Encher uma seringa com 100 µ l de tampão de diluição contendo pH de 10 mM Tris 7.5 e colocá-lo em uma bomba de seringa.
    2. Direto a agulha da seringa pré-perfurado num buraco na tampa do tubo de microcentrífuga, garantir o contato é feito com a mistura de montagem (Figura 1).
    3. Funcionar a bomba de seringa em uma taxa de 0,75 µ l/min por 120 min.
      Nota: A solução resultante de µ l 100 contém 250 nucleosomes nM e 200 mM de NaCl.
    4. Transfira a mistura para um botão de diálise MWCO 10K e Dialize contra 200 mL de um buffer sal baixo pre-refrigerados (4 ° C), contendo 10 mM Tris pH 7.5, 0,25 mM de EDTA e ao 2,5 mM NaCl, para 1 hora a 4 ° C.
  6. Para avaliar o conteúdo de histona da Assembleia nucleossoma, prepare um gel de SDS-PAGE descontínuo com um 15% separando e 6% como descrito anteriormente30de empilhamento.
    1. Alíquota 10-20 µ l do nucleossoma estoque para um tubo de microcentrífuga e adicionar 4 x Laemmli Sample Buffer para uma trabalho de concentração de 1-2 x. 58
    2. Como um controle, repita esta preparação em um tubo de microcentrífuga separado para 1-2 µ g da unidade populacional de histona. Aquecer as amostras a 95 ° C por ~ 5 min.
    3. Carrega as amostras nas vias adjacentes um ao outro no gel. Adicione o amortecedor da amostra para as rotas não utilizadas para promover a migração de banda mesmo.
    4. Funcione o gel em 65 V até a frente da tintura se move através do gel de empilhamento. Quando é alcançado o gel de separação, aumentar para 150 V e correr até a frente da tintura migrou completamente fora do gel.
    5. Desmontar a unidade de eletroforese e transferência suavemente o gel para um recipiente coloração com dd H2O. Deixe o gel descansar por 5 min com agitação suave. Repita este processo mais duas vezes com dd fresco H2O usado cada vez.
      Nota: A mancha de Coomassie utilizada neste protocolo não exige as etapas de fixação típicas necessárias para manchas de Coomassie (ver Tabela de materiais). Se estiver sendo usada outra preparação de Coomassie, ajuste as etapas de fixação conforme necessário.
    6. Remover a água de lavagem final e adicionar a mancha apenas o suficiente para cobrir o gel. Deixe o gel sentar com agitação suave pelo menos 1 h.
      Nota: Para a agitação, o recipiente de coloração pode ser colocado em qualquer aparelho que promove o movimento da mancha sobre o gel, mantendo também o gel coberto em líquido.
    7. Remover a mancha do recipiente e lave o gel com dd H2O. substituir o dd H2O e embeber o gel por 30 min com agitação suave. (O gel deve aparecer como mostrada na Figura 2, com clara separação das bandas histona).
  7. Armazene os nucleosomes a 4 ° C até o uso.
    Nota: Quando armazenados nessas condições, os nucleossomas permanecem estáveis por vários meses. O protocolo pode ser pausado aqui.

2. functionalization da superfície de Mica para a imagem latente de AFM estático de Nucleosomes

  1. Prepare uma 50mm 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS solução stock em água desionizada conforme descrito. 30 loja 1 alíquotas de mL desta solução a 4 ° C até o uso.
    Nota: As alíquotas podem ser armazenadas por mais de um ano a 4 ° C. 59
  2. Preparar uma solução de 1: 300 trabalho APS para modificação de mica, dissolvendo-se 50 µ l do estoque APS 50 milímetros em 15ml dd H2O.
    Nota: Esta solução de trabalho pode ser armazenada em temperatura ambiente por vários dias.
  3. Corte tiras de 1 x 3 cm de mica de folhas de mica de alta qualidade (consulte Tabela de materiais para mica usado aqui).
    1. Verifique se a peça se encaixa quando colocado na diagonal em uma cubeta. Use a ponta de Pinças afiadas, uma lâmina de barbear ou fita adesiva, para decompor camadas da mica até que ambos os lados são clivados recentemente e a peça é tão fina quanto ~0.1 mm (Figura 3A). Imediatamente, coloque o pedaço de mica para a cubeta do APS preenchido e incube por 30 min (Figura 3B).
  4. Transferir o pedaço de mica para uma cubeta cheia de dd H2O e molho por 30 s (Figura 3). Seque completamente ambos os lados da faixa de APS-mica sob um fluxo de argônio.
    Nota: Um não-tecidos celulose e poliéster cleanroom Limpe (recomendada limpeza detalhada em materiais) podem ser usados para ajudar na água da borda do mica que wicking quando secar.
  5. Uso de faixa de mica seco é agora para a preparação da amostra. Caso contrário, guarde a peça em uma cubeta limpa e seca (Figura 3D).
    Nota: Armazenamento adicional no vácuo para 1-2 h é recomendado quando o ambiente é úmido. O protocolo pode ser pausado aqui.

3. preparação das amostras de nucleossoma na APS-Mica para imagens estáticas AFM

  1. Aplique a fita adesiva de dupla face para vários discos magnéticos e colocá-los para o lado.
  2. Corte o substrato APS-mica para o tamanho desejado (quadrados de 1 x 1 cm para o instrumento de AFM MM usado aqui). Coloque esses pedaços num recipiente limpo e manter cobertos.
  3. Preparar três diluições dos nucleosomes montados (nucleossoma final as concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 nM) usar um 0,22 µm filtrada amortecedor 10mm do contendo HEPES pH 7,5 e 4 mM MgCl2.
    Nota: Para limitar a perda de nucleosomes na baixa concentração final, as diluições devem ser feitas um de cada vez, imediatamente antes da deposição sobre a APS-mica.
  4. Depósito de 5-10 µ l da amostra diluída nucleossoma no centro da peça APS-mica e deixe incubar durante dois minutos. Lave suavemente a amostra com 2-3 mL de dd H2O para remover todos os componentes da reserva. Após cada mL de ~0.5 de dd H2O usado, agite suavemente o mica para remover a água de lavagem em excesso.
    Nota: Recomenda-se uma seringa descartável para esta etapa de lavagem.
  5. Seca a amostra depositada em um leve fluxo de gás argônio limpo.
    Nota: A amostra está pronta para ser fotografada ou pode ser armazenada em um armário de vácuo ou exsicador cheio de argônio. Amostras preparadas e armazenadas conforme descrito tem sido fotografadas em um ano após a preparação, sem perda de qualidade. O protocolo pode ser pausado aqui.

4. imagens de AFM estática dos Nucleosomes

  1. Monte uma ponta AFM no suporte da ponta. Use uma ponta que possui uma constante de mola de ~ 40 N/m e uma frequência de ressonância entre 300 e 340 kHz (veja a Tabela de materiais para os cantilevers usados aqui).
  2. Monte a amostra preparada na seção 3 no palco AFM com cuidado para não entrar em contato com a superfície da amostra.
  3. Posicione o laser sobre o cantilever até a soma é no máximo e ajuste os valores de deflexão vertical e lateral para perto de zero.
  4. Sintonize a sonda AFM para encontrar a sua frequência de ressonância e ajustar a amplitude de movimentação e definir o tamanho da imagem para 100x100 nm. Clique no botão Iniciar para iniciar a abordagem.
  5. Uma vez que se aproximava, gradualmente Otimize o Setpoint de Amplitude até a superfície da amostra é claramente vista. Aumente o tamanho de varredura para 1 x 1 µm e a resolução 512 x 512 pixels. Clique no botão de captura seguido do botão Iniciar para iniciar a aquisição de imagens.
    Nota: As imagens na Figura 4 mostram o fundo liso que pode ser esperado quando estas amostras de imagem.
  6. Para analisar a amostra nucleossoma, abra imagens capturadas utilizando o software de análise de instrumentos AFM.
    1. Achate a imagem usando um polinômio linha subtração ou recurso semelhante.
    2. Defina a tabela de cor para refletir o menor valor para o mínimo e o maior valor para o máximo. Manter um registro desses valores para cada imagem como eles serão necessários em uma etapa posterior.
      Nota: Se estes valores não são utilizados, dados de altura será incorretos na análise posterior como cortes transversais de núcleos nucleossoma aparecerá como planaltos da altura igual, ao invés de variáveis.
    3. Exporte a imagem como uma imagem TIFF no tamanho original. Desmarque todas as opções para salvar a imagem com uma borda ou escala bares.
    4. Abra a imagem no software de análise capaz de medições de comprimento de contorno.
    5. Definir o x, y e z escalas para coincidir com a imagem.
    6. Como uma calibração de comprimento interno, medir e registrar o comprimento do contorno do DNA livre de uma ponta à outra. Para este fator de calibração, use as medições para gerar um histograma e ajustá-lo com uma distribuição normal (gaussiana). Dividir o centro de pico (x-c) pelo comprimento de substrato em pares de bases.
      Nota: Este valor é o imagem conversão factor específico de nanômetros de pares de base de DNA.
    7. Medir e registrar o contorno comprimento de ambos os braços para cada nucleossoma da extremidade livre do braço para o centro do núcleo, de consistência (Figura 5A).
    8. Para cada núcleo nucleossoma, recolher dois completos largura a meia valores máximos de (FWHM) de um par de perpendicular do núcleo medições de seção transversal (Figura 5B média as duas medidas FWHM e subtraia a metade do valor resultante de cada braço do nucleossoma a correta para o comprimento medido desde a saída/entrada de DNA para o centro do núcleo que não é parte do comprimento do braço.
    9. Divida cada comprimento de braço pelo fator de calibração calculada (etapa 4.5.6) para obter comprimentos de braço em pares de bases do ADN.
    10. Calcule o grau de envolvimento subtraindo-se a soma de braço nucleossoma do comprimento total de pares de base do substrato sem invólucro de DNA. Plotar esses valores como um histograma e ajuste a técnica com uma distribuição normal (gaussiana) para obter os médios bàsicos embrulhados de DNA para a população de nucleossoma.
    11. Calcule a altura de nucleossoma média de cortes transversais medidos. Plotar isto como um histograma e ajuste a técnica com uma distribuição normal (gaussiana) para obter a altura da população nucleossoma.

5. imagens de AFM lapso de tempo da dinâmica do nucleossoma

  1. Monte a ponta AFM no suporte da ponta. Pode ser usada uma sonda com uma constante de mola de aproximadamente 0,1 N/m e uma frequência de ressonância de 7 a 10 kHz (veja a lista de materiais para os cantilevers usados aqui).
  2. Prenda um pedaço de 1 x 1 cm de APS-mica para um disco magnético usando fita dupla-pau e montar o disco no instrumento AFM.
  3. Dilua os nucleosomes para 1 concentração em um buffer de imagem filtrada de 0,22 µm contendo 10 mM HEPES pH 7,5 e 4 mM MgCl2nM.
  4. Deposite 5-10 µ l do nucleossoma diluída no centro da parte de mica para 2 min. Enxágue a amostra depositada com 20µL do buffer de imagem duas vezes. Após a segunda lavagem, manter uma gotícula de reserva na superfície de imagem.
  5. Use a câmera de visão superior para encontrar a ponta e a abordagem à superfície manualmente até que a ponta esteja ~ 100-500 µm da superfície.
  6. Adicione o buffer de imagem adicionais para preencher a lacuna entre a ponta e a superfície. Neste exemplo, cerca de 50 µ l de tampão de imagem é suficiente para preencher a lacuna. Encontre um pico de ressonância para a ponta.
  7. Começa a abordagem controlado por computador para a superfície. Quando se aproximou, começa a imagem com uma área de 1-2 µm para selecionar uma área de ~ 500 nm de interesse. Com esta área de interesse selecionada, ajuste a densidade de aquisição de dados para 512 x 512 pixels.
  8. Ajustar a tensão do ponto de ajuste e parâmetros de amplitude para melhorar a qualidade de imagem de unidade. Uma amplitude livre de 10 nm ou menos e uma taxa de varredura de ~ 2 Hz pode ser usada para capturar imagens de qualidade. Um exemplo da dinâmica de nucleossoma capturado usando AFM lapso de tempo é mostrado na Figura 6.

6. alta velocidade AFM de lapso de tempo por imagens do nucleossoma dinâmica

Nota: O protocolo abaixo é fornecido para o instrumento de HS-AFM, desenvolvido pelo grupo Ando (Universidade de Kanazawa, Kanazawa, Japão). 60

  1. Prepare-se para a imagem latente de líquido APS-mica.
    1. Anexar a vareta de vidro para a fase de varredor AFM com a vareta de vidro - cola varredor (ver Tabela de materiais). Deixe esta seco por um período mínimo de 10 min.
    2. Fazer ~0.1 mm espessura peças circulares de mica com um diâmetro de 1,5 mm, perfurando-lhes de uma folha de mica maior. Use a cola de haste de vidro-mica HS-AFM (consulte a Tabela de materiais) para anexar este pedaço de mica para a vareta de vidro sobre a HS-AFM e seco, intocado por um período mínimo de 10 minutos. Cleave camadas usando uma fita sensível à pressão, até que uma camada bem clivada é vista na fita.
    3. Dilua 1 µ l de caldo APS 50 milímetros em 99 µ l de dd H2O tornar-se uma solução APS 500 µM. Depósito 2,5 µ l desta solução na superfície de mica clivada fresco e deixe funcionalizar por 30 min.
      Nota: Para evitar a secagem da superfície, enquanto a funcionalização, a tampa de um tubo de centrifuga conico de 50 mL pode ser cabida com um pedaço úmido de papel de filtro e colocada sobre o scanner. O estoque APS é diluído 3 vezes menos para a imagem latente líquido do que para imagens estáticas para controlar a dinâmica de uma taxa que pode ser observada com o AFM.
    4. Enxágue o mica com 20 µ l de dd H2O aplicando várias lavagens de ~ 3 µ l. Remova a água completamente após cada lavagem, colocando uma limpeza não tecida na borda do mica. Após o enxágue final, colocar ~ 3 µ l de dd H2O na superfície e deixe descansar por um mínimo de 5 min para remover qualquer APS nonspecifically acoplado.
  2. Coloque a sonda no suporte de HS-AFM e posicionar o titular no palco AFM com a ponta virada para cima. Enxágue o titular usando ~ 100 µ l de dd H2O, seguido de lavagens dois ~ 100 µ l de 0,22 µm filtrada nucleosomes imagem de buffer que contém 10 mM HEPES pH 7,5 e 4 mM MgCl2.
  3. Com as lavagens feitas, encha a câmara com ~ 100 µ l do nucleossoma imagem reserva, submergindo a ponta. Ajuste a posição do modilhão até foi atingido com o laser. Enxágue o APS-mica com 20 µ l de filtrado nucleossoma tampão, de imagem usando ~ 4 µ l por lavagem.
  4. Diluir 1 µ l da unidade populacional de montagem nucleossoma em 250 µ l de filtrado nucleossoma imagem buffer para uma concentração de nucleossoma final de 1 nM. Depósito de 2,5 µ l desta diluição na superfície e deixe descansar por 2 min. enxaguar a superfície com ~ 4 µ l do nucleossoma buffer de imagem duas vezes. Após o enxágue final, deixe a superfície coberta de buffer de imagem.
    Nota: Se a superfície não é enxaguada depois depositar a amostra nucleossoma, a superfície vai rapidamente tornar-se superlotadas.
  5. Defina o scanner e o exemplo em cima do titular de ponta para que a amostra é o rosto para baixo. Para iniciar a abordagem, use a função de autoabordagem com uma amplitude de set point, ums perto da oscilação livre amplitude A0.
    Nota: Idealmente, ums = 0,95 A0, no entanto, operando com 82% de um0 irá funcionar tão bem se cuidado.
  6. Ajuste o ponto de ajuste até que a superfície está sendo bem controlada.
    Nota: Para minimizar a transferência de energia da ponta AFM para a amostra nucleossoma, a amplitude do cantilever deve ser mantida pequena, com amplitudes tão baixos quanto 1 nm ideal.
  7. Definir a área de imagem ao redor de 150 x 150 nm-200 x 200 nm, com taxa de aquisição de dados de ~ 300 ms por quadro de imagem.
    Nota: Este tamanho de imagem é normalmente suficiente para capturar a dinâmica dos nucleosomes vários simultaneamente. Uma superfície menos povoada pode chamar para que alterações destes parâmetros. A taxa de quadros sugerido é suficiente para capturar a dinâmica nucleossoma como loop, deslizando e desempacotamento, entre outros (ver resultados representante seção abaixo).

7. análise da dinâmica do nucleossoma capturada usando AFM lapso de tempo

  1. Converta imagens do tipo de dados HS AFM (ASD). TIFF imagens.
    1. Achate as imagens usando o software de análise do sistema AFM usando funções de linha ou de avião até que o fundo tenha contraste uniforme.
    2. Defina o contraste da imagem (escala de cores) como automático.
      Nota: O contraste pode ser ajustado manualmente para fins de apresentação, mas não para análise. Isso faz com que detalhes de altura para ser perdido nas imagens convertidas.
    3. Salve o intervalo selecionado de imagens como um arquivo. mov. Desmarque a opção barra de escala e de fronteira opções antes de salvar.
      Notas: Não faça análise em imagens que possuem barras de escala no quadro. Estas alteram o tamanho da imagem e irão resultar em medições falsas.
    4. Converter o arquivo. MOV em imagens tiff usando um software adequado (veja a Tabela de materiais). Use a mesma taxa de quadros para a conversão, como foi usado ao criar o arquivo. mov.
  2. Para medições de contorno comprimento braço, abrir as imagens em um software de medição capaz desta medida tipo (ver Tabela de materiais).
    1. Defina as dimensões da imagem para que correspondam ao que foi capturado.
    2. Meça o comprimento do contorno de cada nucleossoma braço da extremidade do braço para o centro do núcleo do nucleossoma e registrar as medições em uma planilha (Figura 4A).
    3. Meça o comprimento do substrato DNA acondicionado nos quadros depois desembrulha uma nucleossoma. Use isso para uma calibração específica filme do rácio nm/bp que é usado para nucleossoma envolvendo cálculos
    4. Colete dois perfis de corte transversal para o núcleo do nucleossoma e dois para o DNA nu (Figura 4B).
    5. Importar os perfis de seção transversal de um software de planilha e normalizar as parcelas, subtraindo-se o menor valor de z de todos os pontos no perfil.
    6. Calcular a altura e a largura total no máximo meia (FWHM) para cada seção transversal e a média de valores a partir de dois perfis para cada quadro.
  3. Subtrair a metade do valor de cada nucleossoma FWHM braços são a trama como um gráfico de dispersão juntamente com a soma calculada dos braços.
    1. Calcule o comprimento contorno das medições de DNA feitas para o DNA em quadros após a nucleossoma desembrulhou.
    2. Determine o fator de calibração nm/bp dividindo o comprimento contorno do DNA livre pelo comprimento de pares de base do substrato DNA. Use este valor para calcular nucleossoma quebra automática em cada quadro, conforme descrito na seção 5.12.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mono-nucleosomes foram preparados pela primeira vez AFM imagem experimentos usando um método de montagem de diluição contínua (Figura 1). Os nucleosomes preparados foram verificados usando descontínuo SDS-PAGE (Figura 2). Uma superfície de mica foi acrescida em seguida usando APS, que capta os nucleossomas na superfície, mantendo um fundo liso para geração de imagens de alta resolução (Figura 3). Os nucleossomas foram depositados na...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descrito acima é bastante simples e fornecer resultados altamente reprodutíveis, embora algumas questões importantes podem ser enfatizados. APS-mica funcionalizado é um substrato fundamental para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Uma elevada estabilidade de APS-mica é uma das características importantes deste substrato que permite preparar o substrato de imagem com antecedência para uso que pode ser usado pelo menos duas semanas depois de ser preparado. 59 ,

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Divulgações

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

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Autor de contribuições: YLL e MSD desenhou o projeto; MSD reuniu os nucleossomas. MSD e ZS realizadas análises de dados e experimentos AFM. Todos os autores escreveu e editou o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Plasmídeo pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
PCR PrimersIDT, Coralville, IAPedido personalizado(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polimeraseThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Número de catálogo para 200 unidades
Kit de purificação PCRQiagen, Hilden, Alemanha 28104Número de catálogo para 50 unidades
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001Número de catálogo para 250 g
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Número de catálogo para 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinante humanoEpiCypher, Durham, NC16-0010 Número decatálogo para 50 ug
H2A/H2B, recombinante humanoEpiCypher, Durham, NC15-0311Número de catálogo para 50 ug
H3 Octamer, humano recombinanteEpiCypher, Durham, NC16-0001Número de catálogo para 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Kit de dispositivo de diálise, 10K MWCO, 0,1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Número de catálogo para 10 dispositivos
Cloreto de sódioSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GNúmero de catálogo para 500 mg
Amicon Ultra-0.5  mL Filtros Centrífugos Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Número de catálogo para 8 dispositivos
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLNúmero de catálogo para 25 mL
de tricinaSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GNúmero de catálogo para 25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Número de catálogo para 1 kg
de persulfato de amônio (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700Número de catálogo para 10 g
solução de acrilamida/bis a 30%, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Número de catálogo para 500 mL
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Número de catálogo para 5 mL
4x tampão de amostra de proteína Laemmli para SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Número de catálogo para 10 mL
2-MESigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10MLNúmero do catálogo para 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Número de catálogo para 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA1610786Número de catálogo para 1 L
Toalhetes não tecidos para salas limpas: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Bloco de moscovita MicaAshevilleMica, Newport News, VAGrau-1
Aminopropil silatrano (APS)Sintetizado conforme descrito em 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25G Número decatálogo para fita adesiva de 25 g
Scotch-3M, St. Paul, MN
Ponta de prova do afm de TESPA-V2 (para a imagem latente estática)de Bruker AFM, Camarillo, ponta
MSNL-10 (para o tempo-lapso padrão que imaing)Bruker AFM, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei América, Jefferson ocidental, OHAA480Número de catálogo para o tubo
MgCl2Sigma-Aldrich de 2 g, St. Louis, MOM8266-100GNúmero de catálogo para 100 g
Filtro Millex-GP, 0.22  µ mSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010Número de catálogo para 10 dispositivos
BL-AC10DS-A2 sonda afm (para HS-AFM)Olympus, Japão
Composto FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japão 
Composto FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japão 
Microscópio de Força AtômicaMultimodo Bruker-Nano/Veeco, Santa Bárbara, CA
Microscopia de Força Atômica de Lapso de Tempo de Alta VelocidadeToshio Ando, Instituto de Ciências da Nano-Vida, Universidade de Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japão
de pontas de prova de prova do afm de CA pontas de prova de

Referências

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