Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo de caracterização de partículas nucleossoma no nível do único-molécula usando microscopia estático e Time-Lapse de força atômica (AFM), técnicas de imagem. O método de superfície functionalization descrito permite a captura da estrutura e dinâmica dos nucleosomes em alta resolução em nanoescala.

Abstract

Cromatina, que é uma longa cadeia de subunidades nucleossoma, é um sistema dinâmico que permite tais processos críticos como replication do DNA e transcrição para tomar lugar em células eucarióticas. A dinâmica dos nucleosomes fornece acesso ao DNA por máquinas de replicação e transcrição e contribui criticamente para os mecanismos moleculares subjacentes funções de cromatina. Estudos da único-molécula como a microscopia de força atômica (AFM) imagem contribuíram significativamente para a nossa compreensão atual do papel do nucleossoma estrutura e dinâmica. O atual protocolo descreve as etapas permitindo técnicas de alta resolução de imagem AFM estudar as propriedades estruturais e dinâmicas de nucleosomes. O protocolo é ilustrado por dados AFM obtidos para os nucleosomes Centrómero na qual histona H3 é substituída com sua contraparte Centrómero de proteína (CENP-A). O protocolo começa com a montagem do mono-nucleosomes usando um método de diluição contínua. A preparação do substrato mica acrescida com aminopropil silatrane (APS-mica) que é usado para o tratamento de imagens de nucleossoma é fundamental para a visualização de AFM de nucleosomes descrito e o procedimento para preparar o substrato é fornecido. Os nucleossomas depositados na superfície de APS-mica são primeiro fotografados usando AFM estático, que capta um instantâneo da população nucleossoma. De análises destas imagens, parâmetros, tais como o tamanho do DNA enrolado os nucleosomes podem ser medidos e este processo também é detalhado. O lapso de tempo AFM de imagem procedimento no líquido é descrito para o AFM de lapso de tempo de alta velocidade que pode capturar vários quadros da dinâmica nucleossoma por segundo. Finalmente, a análise da dinâmica do nucleossoma permitindo a caracterização quantitativa dos processos dinâmicos é descrita e ilustrada.

Introduction

Em células eucariontes, o DNA é altamente condensado e organizado em cromossomos. ¹ o primeiro nível de organização do DNA dentro de um cromossomo é o assembly de nucleosomes no qual 147 bp de DNA firmemente é acondicionada em torno de um núcleo de octamer de histona. ^{2 , 3} partículas nucleossoma montam sobre uma longa molécula de DNA, formando uma matriz de cromatina que é então organizada até uma unidade altamente compacto cromossomo é formada. ⁴ a desmontagem da cromatina fornece o acesso a livre DNA exigido pelo críticos processos celulares, tais como a repli....

Protocol

1. contínua diluição Assembly de Mono-nucleosomes

1. Gerar e purificar um substrato de DNA aproximadamente 400 bp que contém uma nucleossoma de Widom 601 fora centrado no posicionamento de sequência. ⁵⁵
   Nota: Para limitar a formação indesejada de di-os nucleossomas, cada 'braço' que flanqueiam a sequência de posicionamento não deve exceder 150 ~ bp.
   1. Use o plasmídeo pGEM3Z-601, juntamente com os primers projetados e amplificar o DNA de substrato usando PCR. Para o substrato de bp 423 com 122 e 154 comprimentos braço bp usado aqui, use para a frente (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') e reversa (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') as primeira....

Results

Mono-nucleosomes foram preparados pela primeira vez AFM imagem experimentos usando um método de montagem de diluição contínua (Figura 1). Os nucleosomes preparados foram verificados usando descontínuo SDS-PAGE (Figura 2). Uma superfície de mica foi acrescida em seguida usando APS, que capta os nucleossomas na superfície, mantendo um fundo liso para geração de imagens de alta resolução (Figura 3). Os nucleossomas foram depositados na.......

Discussion

O protocolo descrito acima é bastante simples e fornecer resultados altamente reprodutíveis, embora algumas questões importantes podem ser enfatizados. APS-mica funcionalizado é um substrato fundamental para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Uma elevada estabilidade de APS-mica é uma das características importantes deste substrato que permite preparar o substrato de imagem com antecedência para uso que pode ser usado pelo menos duas semanas depois de ser preparado. ^{59 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmídeo pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
PCR Primers	IDT, Coralville, IA	Pedido personalizado	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polimerase	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Número de catálogo para 200 unidades
Kit de purificação PCR	Qiagen, Hilden, Alemanha	28104	Número de catálogo para 50 unidades
Tris base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Número de catálogo para 250 g
EDTA	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Número de catálogo para 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinante humano	EpiCypher, Durham, NC	16-0010 Número de	catálogo para 50 ug
H2A/H2B, recombinante humano	EpiCypher, Durham, NC	15-0311	Número de catálogo para 50 ug
H3 Octamer, humano recombinante	EpiCypher, Durham, NC	16-0001	Número de catálogo para 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Kit de dispositivo de diálise, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	Número de catálogo para 10 dispositivos
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Número de catálogo para 500 mg
Amicon Ultra-0.5  mL Filtros Centrífugos	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Número de catálogo para 8 dispositivos
HCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Número de catálogo para 25 mL
de tricina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Número de catálogo para 25 g
SDS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Número de catálogo para 1 kg
de persulfato de amônio (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, CA	1610700	Número de catálogo para 10 g
solução de acrilamida/bis a 30%, 37.5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	Número de catálogo para 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	1610800	Número de catálogo para 5 mL
4x tampão de amostra de proteína Laemmli para SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	Número de catálogo para 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Número do catálogo para 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	Número de catálogo para 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	Número de catálogo para 1 L
Toalhetes não tecidos para salas limpas: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
Bloco de moscovita Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grau-1
Aminopropil silatrano (APS)	Sintetizado conforme descrito em 22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G Número de	catálogo para fita adesiva de 25 g
	Scotch-3M, St. Paul, MN
Ponta de prova do afm de TESPA-V2 (para a imagem latente estática)	de Bruker AFM, Camarillo, ponta
MSNL-10 (para o tempo-lapso padrão que imaing)	Bruker AFM, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue	Toagosei América, Jefferson ocidental, OH	AA480	Número de catálogo para o tubo
MgCl2	Sigma-Aldrich de 2 g, St. Louis, MO	M8266-100G	Número de catálogo para 100 g
Filtro Millex-GP, 0.22  µ m	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Número de catálogo para 10 dispositivos
BL-AC10DS-A2 sonda afm (para HS-AFM)	Olympus, Japão
Composto FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japão
Composto FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japão
Microscópio de Força Atômica	Multimodo Bruker-Nano/Veeco, Santa Bárbara, CA
Microscopia de Força Atômica de Lapso de Tempo de Alta Velocidade	Toshio Ando, Instituto de Ciências da Nano-Vida, Universidade de Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japão