Ensaios para a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus

Summary

Aqui nós apresentamos dois protocolos, um para medir a taxa de crescimento específico e outro para a capacidade de ligação de celular de rotavírus usando o ensaio de placa e RT-qPCR. Esses protocolos são disponível para confirmar as diferenças de fenótipos entre cepas de rotavírus.

Abstract

Contra o rotavírus é o principal fator etiológico para a diarreia infantil. É um vírus de RNA double-stranded (ds) e constitui uma população geneticamente diversa, conhecida como quasispecies, devido à sua taxa de mutação de alta. Aqui, descrevemos como medir a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus como seus fenótipos. Rotavírus é tratado com tripsina, a reconhecer o receptor de células e em seguida inoculado em cultura de células MA104. O sobrenadante, incluindo progênies virais, é coletado intermitentemente. O ensaio da chapa é usado para confirmar o título de vírus (unidade de deformação: pfu) de cada coletado sobrenadante. A taxa de crescimento específico é estimada por encaixe de dados tempo-curso de pfu/mL para o modelo de Gompertz modificado. No ensaio de ligação de celular, células MA104 em uma placa de 24 são infectadas com rotavírus e incubadas durante 90 min a 4 ° C para a adsorção de rotavírus para receptores celulares. Baixa temperatura impede de rotavírus de invadir a célula hospedeira. Após a lavagem para remover virions desacoplados, RNA é extraído de virions anexados a receptores celulares, seguidos de síntese do cDNA e transcrição reversa PCR quantitativo (RT-qPCR). Estes protocolos podem ser aplicados para investigar as diferenças fenotípicas entre estirpes virais.

Introduction

Vírus de RNA formam uma população geneticamente diversa, conhecida como quasispecies¹, por causa de sua taxa de mutação,² que é maior do que de organismos baseados em DNA. Estrutura populacional em quasispecies é afetada por fatores genéticos população, incluindo a mutação, a pressão de seleção e deriva genética. As tensões dentro de uma única linhagem genética podem mostrar diferentes fenótipos devido à diversidade genética. Por exemplo, luzimeire et al mostrou que a sensibilidade de cloro livre foi diferente entre cepas de norovírus murino que se originou de uma estirpe de placa-purificado S7-PP3³.

Rotavírus (rotavírus de género na família reoviridae) são vírus não-envelopado ds RNA formando quasispecies². Além dos factores genéticos de população acima descritos, rearranjo do genoma afeta a diversidade genética de rotavírus porque este vírus tem 11 genomas segmentados⁴. Rotavírus causam diarreia, principalmente entre os bebés, e mortes infantis em 2013 foram estimados cerca de 250.000⁵. Duas vacinas estão em uso em vários países e têm sido eficazes na redução da carga de infecção por rotavírus, mas alguns pesquisadores a discutir a presença de vacina-fuga mutantes^{6,7,8, 9}. a caracterização desses mutantes é importante compreender os mecanismos de fuga-vacina.

Aqui, apresentamos os protocolos para dois ensaios para avaliar a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus a fim de compreender as diferenças fenotípicas entre estirpes/mutantes. A curva de crescimento de rotavírus foi apresentada em anteriores relatórios¹⁰, mas geralmente não medem parâmetros de crescimento, tais como taxa de crescimento específico. Um célula-ensaio realizado anteriormente envolve o de técnica de coloração imunofluorescente¹¹. Aqui mostramos os métodos mais fáceis de usar o ensaio da chapa e RT-qPCR, que nos permitem discutir quantitativamente a diferença em fenótipos virais. Estes métodos são apropriados para a caracterização de fenótipos de rotavírus e finalmente podem contribuir para a construção de novas vacinas eficazes para vários genótipos.

Protocol

1. preparação média

1. Para tornar um meio de cultura celular (contendo soro médio), adicione 4,7 g de pó MEM da águia para 500 mL de água destilada. Autoclave a 120 ° C por 20 min e deixe o médio fresco à temperatura ambiente. Adicionar o soro fetal bovino (concentração final: 10%), L-glutamina (2 mM), penicilina estreptomicina (1%) e bicarbonato de sódio (1,125 g/L). Armazenar a 4 ° C para 1 mês.
2. Prepare o suporte de soro-livre para a propagação de vírus, conforme descrito na etapa 1.1, mas sem o soro fetal bovino. Armazenar a 4 ° C para 1 mês.
3. Para o ensaio de placa, esterilize 100 mL de meio MEM da águia (não contendo vermelho de fenol) em autoclave. Deixe o meio arrefecer à temperatura ambiente e em seguida, adicione 2% FBS, 2% penicilina estreptomicina, 4 mM L-glutamina e 2,25 g/L NaHCO₃. Loja a 4 ° C.
4. Para o ensaio de placa, esterilize 100 mL de gel de agarose 2,5% por autoclave. Prepare o gel no mesmo dia em que o ensaio da chapa é conduzido. Armazene o gel a 47 ° C em banho-maria.

2. cultura de pilha

1. Remova um criotubo contendo linhas de células MA104 do contêiner de nitrogênio líquido. Coloque o criotubo em banho-maria a 37 ° C para descongelar as células. Adicione 1 mL de suspensão de células para 20 mL do meio de soro contendo um balão T75. Incube o frasco em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂ por 2 ou 3 dias.
   Nota: A concentração celular final na suspensão é cerca de 10⁶ células/mL.
2. Uma vez que a monocamada celular atinge 80% confluência, remover o sobrenadante e lavar as células duas vezes com 5 mL de 1X PBS de Dulbecco (solução salina tamponada fosfato).
3. Adicionar 4 mL de 0,05% do trypsin-EDTA no balão e incubar a 37 ° C por 5 min separar as células do recipiente. Transferi a suspensão de células para um tubo de 15 mL e centrifugar 190 x g por 5 min.
4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas (10⁶ células) em 1 mL de soro contendo médio preparado em 1.1. Diluir as células ressuspensa em 100-fold com o meio.
5. Adicione 3 mL de suspensão de célula diluídos a cada poço de 6-bem (para o ensaio da chapa) ou placas de 24 poços (para o ensaio de ligação de celular), respectivamente. Incube as placas em uma incubadora a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado por 2 ou 3 dias.
   Nota: Um balão T75 é apropriado para coletar as amostras de tempo-curso porque o volume de amostra do líquido sobrenadante (1 mL) pode ser ignorado em comparação com o volume total de sobrenadante (30 mL). Enquanto isso, o título infeccioso do vírus em cada sobrenadante é medido pelo ensaio da chapa, que normalmente é realizado usando uma placa de 6. Uma placa de 24 é utilizada para o ensaio de ligação de celular.

3. taxa de crescimento específico de rotavírus

Nota: Rotavírus Rhesus (RRV, genótipo: G3P[3]) é utilizada no presente protocolo porque RRV pode rapidamente e facilmente formam placas com células MA104.

1. Lugar de um tubo contendo 1 mL de suspensão de vírus (10⁷ pfu/mL) em meio livre de soro armazenado a-80 ° C em banho-maria a 37 ° C para descongelar. Adicione 1 µ g / µ l tripsina de pâncreas de suínos para 1 mL da suspensão de vírus (concentração final de tripsina é 4 µ g/mL) e em seguida vórtice. Incube a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado por 30 min a suspensão de vírus.
   Nota: Tripsina de outras fontes pode ser usada, mas o efeito sobre a infecciosidade do rotavírus precisa ser testado com antecedência.
2. Dilua a suspensão de vírus ativado com um meio livre de soro para ajustar a multiplicidade de infecção (MOI) a 0,1 pfu/célula.
3. Adicionar 1 mL de suspensão de vírus diluído para linhas de células MA104 (80% de confluencia) num balão T75 3 dias após a célula chapeamento (2.1), incubar a 37 ° C, durante 1 h e agite suavemente o frasco a cada 15 min.
4. Em seguida, adicione 30 mL de um meio livre de soro contendo 0,13 µ g/mL de tripsina de um pâncreas de suínos para o balão. Incube o frasco a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado.
5. Coletar 1 mL do sobrenadante no frasco em 0, 6, 12, 18, 24 e 36 (e/ou 48) pós-infecção h (hpi) e substituir o sobrenadante em tubos de 1,5 mL com uma pipeta.
6. Realizar o congelamento (-80 ° C) e derreter em banho-maria a 37 ° C ciclo três vezes. Centrifugar os tubos a 12.600 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Recolha o sobrenadante.
7. Filtre o sobrenadante com um filtro de água destilada 0,2 µm para remover a fração de célula. Loja a-80 ° C sobrenadante na geladeira até aplicá-lo para o ensaio de placa para medir a concentração de vírus.
8. Coloque os tubos contendo o sobrenadante coletado (passo 3.5) em banho maria a 37 ° C. Adicionar 4 tripsina µ g/mL para um 1 mL da amostra diluída 10 vezes e incubar a 37 ° C por 30 min.
9. Durante a incubação 30 min em 3.8, para começar o ensaio da chapa para a medição do título de vírus obtido de amostras de curso do tempo (passo 3.5), lave as células MA104 duas vezes em uma placa de 6 com 2 mL de 1X PBS depois de retirar o meio contendo soro.
10. Serialmente diluir as amostras incubadas com um meio livre de soro e inocular 1 mL da amostra diluída em cada poço. Incubar a placa por 90 min a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado e agite suavemente a placa cada 15 min.
11. Após a incubação, remova o inóculo a placa 6. Adicione 4 tripsina µ g/mL para o meio preparado (etapa 1.3). Suavemente, mas imediatamente adicione 3 mL do meio misturado com gel de agarose (a proporção é de 1:1) para cada poço.
12. Manter a placa na temperatura de quarto por mais de 10 minutos (até que o gel de agarose, torna-se sólido) e incubar durante 2 dias a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado.
    Nota: Despeje o meio misturado com ágar da borda do poço.
13. Adicionar 1 mL de 0.015% solução de vermelho neutro diluída com 1X PBS a cada poço e incubar a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado. Remover o corante após 3h e incubar durante 1 dia em 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado.
14. No dia seguinte, contar o número de placas em cada poço e calcular o pfu/mL. Verifique cuidadosamente a confluência de célula antes do ensaio de placa para assegurar os números da placa.

4. célula de ensaio

Nota: Este protocolo é baseado em relatório^{13 do Gilling}.

1. Adicione 1 µ g / µ l tripsina de um pâncreas de suínos para 1 mL da suspensão de vírus (concentração final de tripsina é 4 µ g/mL) e em seguida vórtice (na mesma maneira como no 2.1). Dilua a suspensão de vírus com um meio livre de soro para ajustar o MOI de 1 pfu/célula.
2. Em seguida, lavar as células MA104 duas vezes na placa de 24 com 1 ml de tampão salino Tris (TBS; 2,53 g/L Tris base, 6,54 g/L NaCl, 0,3 g/L de KCl, Na₂HPO₄ para chegar a 1 L com água destilada de 0,046 g/l).
3. Inocular a 100 µ l de suspensão de vírus diluídos a cada poço de uma placa com células de 24 e incubar a 4 ° C por 90 min, com agitação suave cada 15 min.
4. Remover o inóculo de vírus e lavar as células duas vezes com 1 mL de TBS. Para extrair a dupla-hélice do RNA (ds) do rotavírus, adicionar 140 µ l de 1X PBS e 560 µ l de buffer de extração de RNA (ver Tabela de materiais) para cada poço. Misture adequadamente com uma pipeta (cerca de 10x ou até que a névoa ou o contaminante de células no buffer não é visto).
5. Depois de se recuperar o RNA encalhado dobro (dsRNA) de acordo com o protocolo do fabricante, coloque os tubos de 1,5 mL contendo o extrato de dsRNA sobre um bloco de calor a 95 ° C por 5 min desnaturar o dsRNA, imediatamente coloque os tubos no gelo e incubar durante mais de 2 min.
6. Sintetizar o cDNA usando uma transcrição reversa kit (veja a Tabela de materiais). Adicionar 4 µ l da solução de RNA viral desnaturada para um tubo PCR contendo 16 µ l da mistura (tabela 1) e misturar cuidadosamente com uma pipeta para não gerar bolhas. Spin para baixo os tubos.
7. Execute a transcrição reversa com um termociclador sob a condição mostrada na tabela 2. Se o cDNA não for usado imediatamente, armazene o tubo do PCR contendo o cDNA a-20 ° C por até 1 ano.
8. Usar os primers para PCR quantitativo (para a frente; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', reverso; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴ e uma sonda inserindo um quencher (qPCR sondas; 5'- / FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA-3'), direcionamento a 963 – 1049 região do segmento do genoma NSP3 de rotavírus (estirpe ST3, GenBank: X81436).
   Nota: Quencher é inserida a sonda desenhada por Zeng et al.¹⁴
9. Diluir o plasmídeo padrão em série (10¹ 10⁶ cópias/ml) com PCR, grau de água para a mistura de qPCR (tabela 3) e fazer a mistura de mestre (20 µ l/amostra) para qPCR tabela 4a seguir.
10. Adicionar 20 µ l do mix mestre para o poço de uma placa PCR de 96 poços e em seguida, misture 5 µ l de amostras de cDNA ou 5 µ l do plasmídeo padrão pipetando 10 vezes. Inicie a reação do sistema qPCR de acordo com as condições mostrada na tabela 4.
11. Para calcular o genoma de rotavírus vinculado à superfície de células MA104, regressão linear entre os valores de Ct e o número de genoma conhecido de um plasmídeo padrão de conduta e estimar o número de genoma do exemplo. Em seguida, calcule a relação de ligação de números do virion a células (G_t) no inóculo inicial (G₀).

Results

Uma visão geral de dois protocolos para a taxa de crescimento específico e célula-ensaio de placa-purificado cepas RRV é mostrada na figura 1A e 2A, respectivamente.

No ensaio para a taxa de crescimento específico, o título de vírus final atinge mais de 10⁷ pfu/mL ao propagar no frasco T75. Se a concentração máxima é inferior a 10⁷ pfu/mL, a célula de MA104 pode não ter se tornado confluente ou RRV não foi ativada pela tripsina. Alguns modelos de crescimento estão disponíveis para estimar a taxa de crescimento específico usando os dados de unidade infecciosa. Neste protocolo, o de modelo de Gompertz modificado¹² é empregado como um exemplo;

onde N₀ (10⁴ pfu/mL neste estudo) e N_t (10⁴ 10⁸ pfu/ml) são o título vírus infecciosos (pfu/mL) em 0 e t (exemplo: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, respectivamente, o A é o valor assimptótico [log (N_∞/N₀ )] (exemplo: 3-4), μ é a taxa de crescimento específico [1/h], e é constante o Napier e λ é o período de atraso [h]. Parâmetros do modelo são obtidos pela função solver do software de análise, o que minimiza a soma dos quadrados da diferença entre os valores observados e modelados. No exemplo da figura 1B, a taxa de crescimento específico (µ) é estimada em 0,197 [1/h] e o período de defasagem (λ) é 6,61 [h] aplicando o método menos quadrado para um modelo de Gompertz modificado e o título de vírus relativo na fase estacionária para a concentração inicial ( escala de log) (A) é 3,15 [log (N∞/n₀)]. Nós testamos 6 clones de rotavírus no total, e os valores estimados da taxa de crescimento específico variaram entre 0,19 e 0,27 [1/h]. Estes estimados valores são confiáveis porque o coeficiente de valores determinação na montagem do modelo é mais do que de 0,98.

Virions RRV vinculando a superfícies de células foram cerca de 10³ cópias/mL (vinculando a eficiência foi de cerca 1%) quando usando uma placa de 24 para o ensaio de ligação de celular (Figura 2B). O ensaio é geralmente realizado três vezes para cada amostra, e se uma grande variação do número de cópia é observada em uma amostra, podem ocorrer alguns problemas como excesso de lavagem e insuficiente de ativação da RRV por tripsina. O valor de Ct da qPCR superior a cerca de 36,0 não é preferível e é considerado como abaixo de um limite de detecção em nossa condição de qPCR.

	Volume / 1 reação
5 x PrimeScript Buffer	Μ l 4.0
PrimeScript RT enzima mistura eu	1,0 Μ l
Oligo dT Primer	1,0 Μ l
6 mers aleatórias	Μ l 4.0
Água destilada deionizada	6,0 Μ l
amostra de ssRNA	Μ l 4.0
Total	20,0 Μ l

Tabela 1: Master mix de composição para a síntese do cDNA do genoma de rotavírus.

Temperatura [° C]	Tempo
37	15 min
42	15 min
85	5 s
4	∞

Tabela 2: Condição de reação para a síntese do cDNA do genoma de rotavírus.

	Reação de volume/1
A pré-mistura Taq	12,5 Μ l
Encaminhar a cartilha (10 µM)	0,5 Μ l
Primeira demão reverso (10 µM)	0,5 Μ l
Sonda (10 µM)	0,5 Μ l
Tintura de referência II	0,5 Μ l
Água destilada deionizada	5.5 Μ l
amostra de cDNA	Μ l 5.0
Total	25 Μ l

Tabela 3: Master mix de composição para PCR quantitativo de rotavírus um genoma.

Temperatura [° C]	Tempo
95	5 min
94	20 s	ciclo 45
60	1 min
72	5 min

Tabela 4: Condição de reação de PCR quantitativo de rotavírus um genoma.

Figura 1: visão geral esquemática da estimativa de crescimento de rotavírus e a curva de crescimento de rotavírus. (A), a unidade infecciosa de rotavírus é medido com o ensaio da chapa. (B), a curva (linha azul) foi aproximado pelo modelo de Gompertz modificado com base em dados observados em nosso laboratório (círculo branco). A taxa de crescimento específico [µ]; 0,197 [h^-1], período lag (λ); 6,61 [h], o título de vírus relativo na fase estacionária com o título inicial final (escala log) (A); 3.15 [log (N∞/n₀)]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: visão geral esquemática e resultado representativo de ligação de célula obter cinco estirpes RRV purificada das placas em nosso laboratório. (A), A placa de cultura de células inoculada com rotavírus é incubada a 4 ° C para inibir a invasão de vírus nas células. Após a incubação e removendo partículas virais não vinculadas às células, quantificar o número de genomas proveniente de partículas virais acopladas à superfície da célula com RT-qPCR. (B) o resultado da célula-ligação ensaio foi exibido como vinculando a eficiência (%), que foi a proporção de partículas virais acopladas aos presentes no inóculo. Bar em negrito: mediana, fim das caixas: desvio quartil, fim da linha: máximo e mínimo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Nosso protocolo para medir a taxa de crescimento específico é mais fácil do que as anteriores e pode ser adaptado para outros vírus, a menos que seu sistema de cultura de células ainda não foi estabelecido. Neste estudo, nós usamos RRV (G3P[3]) porque esta cepa pode formar placas mais fácil do que o rotavírus humanos quando usando linhas de células MA104. Algumas cepas de rotavírus humano não podem formar placa nesta linha de celular. Portanto, em vez de ensaio da chapa, o foco formando (FFU) ensaio¹⁵ ou mediana cultura do tecido infecciosa dose unitária (TCID50) ensaio pode ser aplicado para muitas cepas de rotavírus¹⁶. O protocolo apresentado para determinação da taxa de crescimento específico pode ser usado para outros tipos de vírus, mas não é adequado para o vírus para o qual não é estabelecido a nenhum sistema de cultura celulares estabelecidas. Antes de iniciar o experimento para a taxa de crescimento específico, é melhor saber com antecedência quando o título de vírus infecciosos começa a aumentar e atingir a fase estacionária em um teste preliminar. Se também muitas placas estão presentes, o ensaio de placa deve efectuar-se novamente depois de alterar a taxa de diluição das amostras de vírus. A pós-infecção horas (hpi) para coletar amostras também são importantes porque a inclinação da fase de crescimento exponencial pode ser subestimada, se o ponto de tempo adequado para alcançar a fase estacionária é perdido. Na aproximação pelo modelo de Gompertz modificado, um coeficiente de determinação sempre deve ser calculado e verificado. Se a aptidão para o modelo de Gompertz modificado é baixa, outros modelos de crescimento, tais como o modelo logístico modificado¹² podem ser preferíveis.

Na manipulação de células, ao remover o inóculo médio ou vírus, a PBS para lavar ou agarose gel para ensaio de placa deve ser prontamente adicionados a cada um bem de uma placa de cultura de células para evitar que as células da secura. Ao mesmo tempo, você deve derramar delicadamente PBS ou agarose para células não para desconectar-se de poços. Este passo é o mais importante em ambos os ensaios (passo 3.9 e 3.11). Se o ensaio da chapa tem também muitas amostras, recomendamos subdividindo o gel de agarose (100ml cada máximo é recomendado) em várias garrafas médias e aquecer as garrafas até imediatamente antes da utilização desde agarose gel é solidificado dentro de cerca de 10 minutos no quarto temperatura. Tripsina é vulnerável a altas temperaturas,¹⁷, uma solução de tripsina deve ser adicionada a um médio e agarose para o ensaio de placa depois de arrefecer adequadamente.

No ensaio de ligação de celular, a incubação para ligação do vírus às células deve ser feita a 4 ° C para evitar a invasão das células. De acordo com o método de¹³, do Gilling células são propensas a secar em temperaturas baixas, por agitação suave é necessário cada 15 minutos durante a incubação. O kit de extração de RNA utilizado aqui pode ser substituído por outros kits. O declive da curva padrão em RT-qPCR deve ser aproximadamente 3.3, e o coeficiente de determinação deve ser superior a 0.98. Comparado com o microscópio de fluorescência para visualizar a localização do vírus nas células, o ensaio é mais rápida e fácil de usar porque a ligação de substâncias fluorescentes para vírus não é necessária.

Recentemente, enteroid intestinal humana (HIE), exibindo uma função e composição celular similar como epitélio gastrointestinal humano, tornou-se disponível para rotavírus propagação¹⁸. O uso de HIE pode permitir-nos avaliar a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de cepas não-viáveis de rotavírus. Além disso, os dois experimentos descritos aqui podem ser aplicados à avaliação dos efeitos da droga em ambos os fenótipos¹⁹. Os protocolos aqui apresentados tornam possível discutir quantitativamente as alterações nos valores de parâmetro do fenótipo das cepas de rotavírus em variadas condições.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7500 Sistema de PCR em Tempo Real	Applied Biosystems		qPCR
Agar-EPI	Nakalai Tesque, Inc	01101-34	Ensaio de placa
Hidrogenofosfato dissódico	Wako Pure Chemical Corporation	194-02875	Ensaio de ligação celular
Eagle's MEM "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05900	Cultura
Eagle's MEM "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05901	Ensaio de placa
EasYFlask 75 cm2	Thermo Scientific	156499	Cultura de células
Fetal bovino Serim, qualificado, regiões aprovadas pelo USDA	Gibco	10437028	Cultura celular e ensaio de placa
Primers direto / reverso	Eurofins Genômica		qPCR
L-glutamina, 200 mM Solução	Gibco	2530081	Cultura celular e ensaio de placa
Neutro	Red Wako Pure Chemical Corporation	140-00932	Ensaio
de placa PBS (-) "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05913	Cultura celular e ensaio de placa
Penicilina-estreptomicina, Liguid	Gibco	15140122	Cultura celular e ensaio de placa
Cloreto de potássio	Wako Pure Chemical Corporation	163-03545	Ensaio de ligação celular
Premix ExTaq (Perfect Real Time)	TAKARA Bio Inc.	RR039A	qPCR
PrimeScriptTN RT kit de reagentes (Perfect Real Time)	TAKARA Bio Inc.	RR037A	cDNA síntese
PrimeTime qPCR Probes	Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.		qPCR
QIAamp Viral RNA Mini Kit	QIAGEN	52904	Extração de RNA
Bicarbonato de Sódio	Wako Pure Chemical Corporation	199-05985	Ensaio de cultura celular e placa
Cloreto de sódio	Wako Pure Chemical Corporation	198-01675	Ensaio de ligação celular
Placas de cultura de tecidos Placa de 24 poços	TPP	92024	Ensaio de ligação celular
Placas de cultura de tecidos Placa de 6 poços	TPP	92006	Ensaio de placa
Base Trizma	SIGMA-ALDRICH	T1503	Ensaio de ligação celular
Tripsina do pâncreas suíno	SIGMA-ALDRICH	T0303-1G	Ativar para rotavírus
Tripsina-EDTA (0,05 %), vermelho de fenol	Gibco	25300054	Cultura celular
Termociclador	vertical de 96 poçosSíntese de cDNA da Applied Biosystems