Ensaios para a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus

Vírus de RNA formam uma população geneticamente diversa, conhecida como quasispecies¹, por causa de sua taxa de mutação,² que é maior do que de organismos baseados em DNA. Estrutura populacional em quasispecies é afetada por fatores genéticos população, incluindo a mutação, a pressão de seleção e deriva genética. As tensões dentro de uma única linhagem genética podem mostrar diferentes fenótipos devido à diversidade genética. Por exemplo, luzimeire et al mostrou que a sensibilidade de cloro livre foi diferente entre cepas de norovírus murino que se originou de uma estirpe de placa-purificado S7-PP3³.

Rotavírus (rotavírus de género na família reoviridae) são vírus não-envelopado ds RNA formando quasispecies². Além dos factores genéticos de população acima descritos, rearranjo do genoma afeta a diversidade genética de rotavírus porque este vírus tem 11 genomas segmentados⁴. Rotavírus causam diarreia, principalmente entre os bebés, e mortes infantis em 2013 foram estimados cerca de 250.000⁵. Duas vacinas estão em uso em vários países e têm sido eficazes na redução da carga de infecção por rotavírus, mas alguns pesquisadores a discutir a presença de vacina-fuga mutantes^{6,7,8, 9}. a caracterização desses mutantes é importante compreender os mecanismos de fuga-vacina.

Aqui, apresentamos os protocolos para dois ensaios para avaliar a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus a fim de compreender as diferenças fenotípicas entre estirpes/mutantes. A curva de crescimento de rotavírus foi apresentada em anteriores relatórios¹⁰, mas geralmente não medem parâmetros de crescimento, tais como taxa de crescimento específico. Um célula-ensaio realizado anteriormente envolve o de técnica de coloração imunofluorescente¹¹. Aqui mostramos os métodos mais fáceis de usar o ensaio da chapa e RT-qPCR, que nos permitem discutir quantitativamente a diferença em fenótipos virais. Estes métodos são apropriados para a caracterização de fenótipos de rotavírus e finalmente podem contribuir para a construção de novas vacinas eficazes para vários genótipos.

1. preparação média

1. Para tornar um meio de cultura celular (contendo soro médio), adicione 4,7 g de pó MEM da águia para 500 mL de água destilada. Autoclave a 120 ° C por 20 min e deixe o médio fresco à temperatura ambiente. Adicionar o soro fetal bovino (concentração final: 10%), L-glutamina (2 mM), penicilina estreptomicina (1%) e bicarbonato de sódio (1,125 g/L). Armazenar a 4 ° C para 1 mês.
2. Prepare o suporte de soro-livre para a propagação de vírus, conforme descrito na etapa 1.1, mas sem o soro fetal bovino. Armazenar a 4 ° C para 1 mês.
3. Para o ensaio de placa, esterilize 100 mL de meio MEM da águia (não contendo vermelho de fenol) em autoclave. Deixe o meio arrefecer à temperatura ambiente e em seguida, adicione 2% FBS, 2% penicilina estreptomicina, 4 mM L-glutamina e 2,25 g/L NaHCO₃. Loja a 4 ° C.
4. Para o ensaio de placa, esterilize 100 mL de gel de agarose 2,5% por autoclave. Prepare o gel no mesmo dia em que o ensaio da chapa é conduzido. Armazene o gel a 47 ° C em banho-maria.

2. cultura de pilha

1. Remova um criotubo contendo linhas de células MA104 do contêiner de nitrogênio líquido. Coloque o criotubo em banho-maria a 37 ° C para descongelar as células. Adicione 1 mL de suspensão de células para 20 mL do meio de soro contendo um balão T75. Incube o frasco em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂ por 2 ou 3 dias.
   Nota: A concentração celular final na suspensão é cerca de 10⁶ células/mL.
2. Uma vez que a monocamada celular atinge 80% confluência, remover o sobrenadante e lavar as células duas vezes com 5 mL de 1X PBS de Dulbecco (solução salina tamponada fosfato).
3. Adicionar 4 mL de 0,05% do trypsin-EDTA no balão e incubar a 37 ° C por 5 min separar as células do recipiente. Transferi a suspensão de células para um tubo de 15 mL e centrifugar 190 x g por 5 min.
4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas (10⁶ células) em 1 mL de soro contendo médio preparado em 1.1. Diluir as células ressuspensa em 100-fold com o meio.
5. Adicione 3 mL de suspensão de célula diluídos a cada poço de 6-bem (para o ensaio da chapa) ou placas de 24 poços (para o ensaio de ligação de celular), respectivamente. Incube as placas em uma incubadora a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado por 2 ou 3 dias.
   Nota: Um balão T75 é apropriado para coletar as amostras de tempo-curso porque o volume de amostra do líquido sobrenadante (1 mL) pode ser ignorado em comparação com o volume total de sobrenadante (30 mL). Enquanto isso, o título infeccioso do vírus em cada sobrenadante é medido pelo ensaio da chapa, que normalmente é realizado usando uma placa de 6. Uma placa de 24 é utilizada para o ensaio de ligação de celular.

3. taxa de crescimento específico de rotavírus

Nota: Rotavírus Rhesus (RRV, genótipo: G3P[3]) é utilizada no presente protocolo porque RRV pode rapidamente e facilmente formam placas com células MA104.

1. Lugar de um tubo contendo 1 mL de suspensão de vírus (10⁷ pfu/mL) em meio livre de soro armazenado a-80 ° C em banho-maria a 37 ° C para descongelar. Adicione 1 µ g / µ l tripsina de pâncreas de suínos para 1 mL da suspensão de vírus (concentração final de tripsina é 4 µ g/mL) e em seguida vórtice. Incube a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado por 30 min a suspensão de vírus.
   Nota: Tripsina de outras fontes pode ser usada, mas o efeito sobre a infecciosidade do rotavírus precisa ser testado com antecedência.
2. Dilua a suspensão de vírus ativado com um meio livre de soro para ajustar a multiplicidade de infecção (MOI) a 0,1 pfu/célula.
3. Adicionar 1 mL de suspensão de vírus diluído para linhas de células MA104 (80% de confluencia) num balão T75 3 dias após a célula chapeamento (2.1), incubar a 37 ° C, durante 1 h e agite suavemente o frasco a cada 15 min.
4. Em seguida, adicione 30 mL de um meio livre de soro contendo 0,13 µ g/mL de tripsina de um pâncreas de suínos para o balão. Incube o frasco a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado.
5. Coletar 1 mL do sobrenadante no frasco em 0, 6, 12, 18, 24 e 36 (e/ou 48) pós-infecção h (hpi) e substituir o sobrenadante em tubos de 1,5 mL com uma pipeta.
6. Realizar o congelamento (-80 ° C) e derreter em banho-maria a 37 ° C ciclo três vezes. Centrifugar os tubos a 12.600 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Recolha o sobrenadante.
7. Filtre o sobrenadante com um filtro de água destilada 0,2 µm para remover a fração de célula. Loja a-80 ° C sobrenadante na geladeira até aplicá-lo para o ensaio de placa para medir a concentração de vírus.
8. Coloque os tubos contendo o sobrenadante coletado (passo 3.5) em banho maria a 37 ° C. Adicionar 4 tripsina µ g/mL para um 1 mL da amostra diluída 10 vezes e incubar a 37 ° C por 30 min.
9. Durante a incubação 30 min em 3.8, para começar o ensaio da chapa para a medição do título de vírus obtido de amostras de curso do tempo (passo 3.5), lave as células MA104 duas vezes em uma placa de 6 com 2 mL de 1X PBS depois de retirar o meio contendo soro.
10. Serialmente diluir as amostras incubadas com um meio livre de soro e inocular 1 mL da amostra diluída em cada poço. Incubar a placa por 90 min a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado e agite suavemente a placa cada 15 min.
11. Após a incubação, remova o inóculo a placa 6. Adicione 4 tripsina µ g/mL para o meio preparado (etapa 1.3). Suavemente, mas imediatamente adicione 3 mL do meio misturado com gel de agarose (a proporção é de 1:1) para cada poço.
12. Manter a placa na temperatura de quarto por mais de 10 minutos (até que o gel de agarose, torna-se sólido) e incubar durante 2 dias a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado.
    Nota: Despeje o meio misturado com ágar da borda do poço.
13. Adicionar 1 mL de 0.015% solução de vermelho neutro diluída com 1X PBS a cada poço e incubar a 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado. Remover o corante após 3h e incubar durante 1 dia em 37 ° C e 5% CO₂ sob o vapor saturado.
14. No dia seguinte, contar o número de placas em cada poço e calcular o pfu/mL. Verifique cuidadosamente a confluência de célula antes do ensaio de placa para assegurar os números da placa.

4. célula de ensaio

Nota: Este protocolo é baseado em relatório^{13 do Gilling}.

1. Adicione 1 µ g / µ l tripsina de um pâncreas de suínos para 1 mL da suspensão de vírus (concentração final de tripsina é 4 µ g/mL) e em seguida vórtice (na mesma maneira como no 2.1). Dilua a suspensão de vírus com um meio livre de soro para ajustar o MOI de 1 pfu/célula.
2. Em seguida, lavar as células MA104 duas vezes na placa de 24 com 1 ml de tampão salino Tris (TBS; 2,53 g/L Tris base, 6,54 g/L NaCl, 0,3 g/L de KCl, Na₂HPO₄ para chegar a 1 L com água destilada de 0,046 g/l).
3. Inocular a 100 µ l de suspensão de vírus diluídos a cada poço de uma placa com células de 24 e incubar a 4 ° C por 90 min, com agitação suave cada 15 min.
4. Remover o inóculo de vírus e lavar as células duas vezes com 1 mL de TBS. Para extrair a dupla-hélice do RNA (ds) do rotavírus, adicionar 140 µ l de 1X PBS e 560 µ l de buffer de extração de RNA (ver Tabela de materiais) para cada poço. Misture adequadamente com uma pipeta (cerca de 10x ou até que a névoa ou o contaminante de células no buffer não é visto).
5. Depois de se recuperar o RNA encalhado dobro (dsRNA) de acordo com o protocolo do fabricante, coloque os tubos de 1,5 mL contendo o extrato de dsRNA sobre um bloco de calor a 95 ° C por 5 min desnaturar o dsRNA, imediatamente coloque os tubos no gelo e incubar durante mais de 2 min.
6. Sintetizar o cDNA usando uma transcrição reversa kit (veja a Tabela de materiais). Adicionar 4 µ l da solução de RNA viral desnaturada para um tubo PCR contendo 16 µ l da mistura (tabela 1) e misturar cuidadosamente com uma pipeta para não gerar bolhas. Spin para baixo os tubos.
7. Execute a transcrição reversa com um termociclador sob a condição mostrada na tabela 2. Se o cDNA não for usado imediatamente, armazene o tubo do PCR contendo o cDNA a-20 ° C por até 1 ano.
8. Usar os primers para PCR quantitativo (para a frente; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', reverso; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴ e uma sonda inserindo um quencher (qPCR sondas; 5'- / FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA-3'), direcionamento a 963 – 1049 região do segmento do genoma NSP3 de rotavírus (estirpe ST3, GenBank: X81436).
   Nota: Quencher é inserida a sonda desenhada por Zeng et al.¹⁴
9. Diluir o plasmídeo padrão em série (10¹ 10⁶ cópias/ml) com PCR, grau de água para a mistura de qPCR (tabela 3) e fazer a mistura de mestre (20 µ l/amostra) para qPCR tabela 4a seguir.
10. Adicionar 20 µ l do mix mestre para o poço de uma placa PCR de 96 poços e em seguida, misture 5 µ l de amostras de cDNA ou 5 µ l do plasmídeo padrão pipetando 10 vezes. Inicie a reação do sistema qPCR de acordo com as condições mostrada na tabela 4.
11. Para calcular o genoma de rotavírus vinculado à superfície de células MA104, regressão linear entre os valores de Ct e o número de genoma conhecido de um plasmídeo padrão de conduta e estimar o número de genoma do exemplo. Em seguida, calcule a relação de ligação de números do virion a células (G_t) no inóculo inicial (G₀).

Uma visão geral de dois protocolos para a taxa de crescimento específico e célula-ensaio de placa-purificado cepas RRV é mostrada na figura 1A e 2A, respectivamente.

No ensaio para a taxa de crescimento específico, o título de vírus final atinge mais de 107 pfu/mL ao propagar no frasco T75. Se a concentração máxima é inferior a 107 pfu/mL, a célula de MA104 pode não ter se tornado confluente ou RRV não foi ativada pela tripsina. Alguns modelos de crescimento estão disponíveis para estimar a taxa de crescimento específico usando os dados de unidade infecciosa. Neste protocolo, o de modelo de Gompertz modificado12 é empregado como um exemplo;

onde N0 (104 pfu/mL neste estudo) e Nt (104 108 pfu/ml) são o título vírus infecciosos (pfu/mL) em 0 e t (exemplo: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, respectivamente, o A é o valor assimptótico [log (N∞/N0 )] (exemplo: 3-4), μ é a taxa de crescimento específico [1/h], e é constante o Napier e λ é o período de atraso [h]. Parâmetros do modelo são obtidos pela função solver do software de análise, o que minimiza a soma dos quadrados da diferença entre os valores observados e modelados. No exemplo da figura 1B, a taxa de crescimento específico (µ) é estimada em 0,197 [1/h] e o período de defasagem (λ) é 6,61 [h] aplicando o método menos quadrado para um modelo de Gompertz modificado e o título de vírus relativo na fase estacionária para a concentração inicial ( escala de log) (A) é 3,15 [log (N∞/n0)]. Nós testamos 6 clones de rotavírus no total, e os valores estimados da taxa de crescimento específico variaram entre 0,19 e 0,27 [1/h]. Estes estimados valores são confiáveis porque o coeficiente de valores determinação na montagem do modelo é mais do que de 0,98.

Virions RRV vinculando a superfícies de células foram cerca de 103 cópias/mL (vinculando a eficiência foi de cerca 1%) quando usando uma placa de 24 para o ensaio de ligação de celular (Figura 2B). O ensaio é geralmente realizado três vezes para cada amostra, e se uma grande variação do número de cópia é observada em uma amostra, podem ocorrer alguns problemas como excesso de lavagem e insuficiente de ativação da RRV por tripsina. O valor de Ct da qPCR superior a cerca de 36,0 não é preferível e é considerado como abaixo de um limite de detecção em nossa condição de qPCR.

Tabela 1: Master mix de composição para a síntese do cDNA do genoma de rotavírus.

Tabela 2: Condição de reação para a síntese do cDNA do genoma de rotavírus.

Tabela 3: Master mix de composição para PCR quantitativo de rotavírus um genoma.

Tabela 4: Condição de reação de PCR quantitativo de rotavírus um genoma.

Figura 1: visão geral esquemática da estimativa de crescimento de rotavírus e a curva de crescimento de rotavírus. (A), a unidade infecciosa de rotavírus é medido com o ensaio da chapa. (B), a curva (linha azul) foi aproximado pelo modelo de Gompertz modificado com base em dados observados em nosso laboratório (círculo branco). A taxa de crescimento específico [µ]; 0,197 [h-1], período lag (λ); 6,61 [h], o título de vírus relativo na fase estacionária com o título inicial final (escala log) (A); 3.15 [log (N∞/n0)]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: visão geral esquemática e resultado representativo de ligação de célula obter cinco estirpes RRV purificada das placas em nosso laboratório. (A), A placa de cultura de células inoculada com rotavírus é incubada a 4 ° C para inibir a invasão de vírus nas células. Após a incubação e removendo partículas virais não vinculadas às células, quantificar o número de genomas proveniente de partículas virais acopladas à superfície da célula com RT-qPCR. (B) o resultado da célula-ligação ensaio foi exibido como vinculando a eficiência (%), que foi a proporção de partículas virais acopladas aos presentes no inóculo. Bar em negrito: mediana, fim das caixas: desvio quartil, fim da linha: máximo e mínimo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.