Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Resumo

Nós fornecemos os protocolos para avaliação de células-tronco mesenquimais isoladas de polpa dentária e interações de células de câncer de próstata baseadas em métodos diretos e indiretos co-cultura. Médio de condição e membranas de trans-bem são apropriadas analisar a atividade indireta parácrina. Semeando diferencialmente manchado células juntos é um modelo adequado para a interação célula-célula direto.

Resumo

Câncer como um processo de várias etapas e doença complicada é não só regulado pelo crescimento e proliferação das células individuais, mas também controlada por interações de ambiente e célula-célula de tumor. Identificação de câncer e interações de células-tronco, incluindo alterações no ambiente extracelular, interações físicas e fatores secretados, poderá permitir a descoberta de novas opções de terapia. Aliamos técnicas de co-cultura conhecidos para criar um sistema de modelo para as células-tronco mesenquimais (MSCs) e câncer interações célula. No estudo atual, as células-tronco polpa dental (DPSCs) e interações de células de câncer de próstata PC-3 foram examinadas por técnicas de co-cultura diretos e indiretos. Médio de condição (CM) obtidos de DPSCs e 0,4 µm de tamanho de poros bem trans membranas foram usadas para estudar a atividade parácrina. Co-cultura de diferentes tipos de células juntos foi realizada para estudar a interação célula-célula direto. Os resultados revelaram que CM aumentou a proliferação celular e diminuição da apoptose em cultura de células de câncer de próstata. Tanto CM e sistema de trans-bem aumentaram a capacidade de migração celular de células PC-3. Células coradas com membrana diferentes corantes foram semeadas em vasos cultura mesmo, e DPSCs participaram em uma estrutura auto-organizada com PC-3 células sob essa condição de co-cultura direto. Em geral, os resultados indicaram que as técnicas de cultura co poderiam ser útil para câncer e interações MSC como um sistema modelo.

Introdução

Células-tronco mesenquimais (MSCs), com a capacidade de diferenciação e contributo para a regeneração dos tecidos mesenquimais como osso, cartilagem, músculo, ligamento, tendão e adiposo, têm sido isoladas de quase todos os tecidos do corpo adulto^{1 , 2}. além de fornecer homeostase do tecido, produzindo células residentes em caso de inflamação crônica ou lesão, eles produzem vitais citocinas e fatores de crescimento para orquestrar a angiogênese, sistema imunológico e tecido remodelação³. A interação do MSCs com tecido de câncer não é bem compreendida, mas acumula evidências sugerem que ....

Protocolo

Termo de consentimento informado dos pacientes foi obtido após a aprovação do Comitê de ética institucional.

1. cultura e isolamento de DPSC

1. Transferir os dentes do siso obtidos de adultos jovens com idades entre os 17 e os tubos de 20 a 15 mL contendo modificado Eagle médio (DMEM de Dulbecco completa) [baixa glicose DMEM meios de comunicação, suplementados com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina / solução de anfotericina (PSA)], dentro de 8 h após a ressecção. Manter o material de tecido frio (4 ° C) durante a transferência, para evitar potenciais morte celular.
2. Remover o tecido pulpar por forc....

Resultados

Figura 1 descreve as características gerais do Mestrado de DPSCs sob condições de cultura. DPSCs exercer a morfologia celular dos fibroblastos, como depois de chapeamento (figura 1B). Antígenos de superfície de MSC (CD29, CD73, CD90, CD105 e CD166) são altamente expressos enquanto marcadores hematopoiéticas (CD34, CD45 e CD14) são negativas (Figura 1). Alterações a nível morfológico e molecular relac.......

Discussão

Contribuição do MSCs para ambiente de tumor é regulada por diversas interações incluindo híbrido célula geração através de células fusões, entosis ou citocinas e chemokine atividades entre células-tronco e células de câncer²⁸. Organização estrutural, interações célula-célula e fatores secretados determinam o comportamento de células de câncer em termos de promoção de tumor, progressão e metástase para o tecido circundante. Sistemas adequados ex vivo modelo para investigar os meca.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Invitrogen	11885084	Para cultura de células
FBS	Invitrogen	16000044	Para cultura de células
PSA	Lonza	17-745E	Para cultura de células
Tripsina	Invitrogen	25200056	Para dissociação celular
PBS	Invitrogen	10010023	Para lavagens
Dexametasona	Sigma	D4902	Componente do meio de diferenciação
β-Glicerofosfato	Sigma	G9422	Componente do meio de diferenciação osteogênica
Ácido ascórbico	Sigma	A4544	Componente do meio de diferenciação osteo e condrogênica
Insulina-Transferrina-Selênio (ITS − G)	Invitrogen	41400045	Componente do meio de diferenciação condrogênica
TGF-β	Sigma	SRP3171	Componente do meio de diferenciação condrogênica
Insulina	Sigma	I6634	Componente do meio de diferenciação adipogênica
Isobutil-1-metilxantina (IBMX)	Sigma	I7018	Componente do meio de diferenciação adipogênica
Indometacina		Sigma I7378	Componente do meio de diferenciação adipogênica
MTS Reagente	Promega	G3582	Análises de viabilidade celular
Ensaio TUNEL	Sigma	11684795910	Análises apoptóticas
Inserções de placas de 24 poços	Corning	3396	Para ensaio de migração trans-poço
PKH67	Sigma	PKH67GL	Para coloração de células de co-cultura
PKH26	Sigma	PKH26GL	Para coloração de
células de co-culturaParaformaldeído	Sigma	P6148	Para fixação celular
von Kossa Kit	BioOptica	04-170801.A	Para coloração celular (diferenciação)
Azul Alcian	Sigma	A2899	Para coloração celular (diferenciação)