Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Células-tronco mesenquimais (MSCs), com a capacidade de diferenciação e contributo para a regeneração dos tecidos mesenquimais como osso, cartilagem, músculo, ligamento, tendão e adiposo, têm sido isoladas de quase todos os tecidos do corpo adulto^{1 , 2}. além de fornecer homeostase do tecido, produzindo células residentes em caso de inflamação crônica ou lesão, eles produzem vitais citocinas e fatores de crescimento para orquestrar a angiogênese, sistema imunológico e tecido remodelação³. A interação do MSCs com tecido de câncer não é bem compreendida, mas acumula evidências sugerem que o MSCs podem promover tumor iniciação, progressão e metástase⁴.

A capacidade de localização de MSCs à área lesada ou cronicamente inflamada torna um candidato valioso para terapias baseadas em células-tronco. No entanto, os tecidos de câncer, "nunca cura feridas", também liberar citocinas inflamatórias, moléculas pro-angiogênico e fatores de crescimento vitais, que atraem MSCs para a área de cancerogenous⁵. Embora existam limitada relatórios mostrando efeitos inibitórios do MSCs no cancro crescimento^6,7, sua progressão do câncer e metástase, promovendo efeitos tem sido extensivamente relataram⁸. MSCs afectam directa ou indirectamente carcinogênese de maneiras diferentes, incluindo a supressão de células do sistema imunológico, secreção de fatores de crescimento/citocinas que oferecem suporte a proliferação de células cancerosas e migração, reforçar a atividade angiogênico e regulação ^9,de transição epitelial-mesenquimal (EMT)¹⁰. Ambiente de tumor consiste de vários tipos de células, incluindo fibroblastos associada a câncer (CAFs) e/ou miofibroblastos, células endoteliais, adipócitos e células do sistema imunológico¹¹. Destes, CAFs são o tipo de célula mais abundante na área do tumor que secretam várias quimiocinas promover câncer de crescimento e a metástase⁸. Ficou demonstrado que MSCs derivadas da medula óssea podem diferenciar em CAFs no tumor estroma¹².

Células-tronco polpa dental (DPSCs), caracterizadas como os primeiros MSCs de derivado de tecido dentais por Gronthos et al . ¹³ em 2000 e então amplamente investigados por outros^14,15, express pluripotência marcadores como Oct4, Sox2e Nanog¹⁶ e pode se diferenciar em várias células linages¹⁷. Análise de expressão de gene e proteína provou que DPSCs produzir níveis comparáveis de fatores de crescimento/citocinas com outros MSCs como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiogenin, fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF2), interleucina-4 (IL-4), IL-6, IL-10, e fator de células-tronco (SCF), bem como ligante de quinase-3 fms-como tirosina (Flt - 3L) que pode promover a angiogênese, modulam as células imunes e suporte câncer célula proliferação e migração^18,19,20 . Enquanto as interações do MSCs com ambiente de câncer têm sido bem documentadas na literatura, a relação entre DPSCs e células de câncer não foi avaliada ainda. No presente estudo, estabelecemos estratégias de tratamento médio de co-cultura e condição para uma linhagem de células de câncer de próstata metastático altamente, PC-3 e DPSCs para propor a ação potencial do mecanismo de MSCs dentais na progressão do câncer e metástase.

Termo de consentimento informado dos pacientes foi obtido após a aprovação do Comitê de ética institucional.

1. cultura e isolamento de DPSC

1. Transferir os dentes do siso obtidos de adultos jovens com idades entre os 17 e os tubos de 20 a 15 mL contendo modificado Eagle médio (DMEM de Dulbecco completa) [baixa glicose DMEM meios de comunicação, suplementados com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina / solução de anfotericina (PSA)], dentro de 8 h após a ressecção. Manter o material de tecido frio (4 ° C) durante a transferência, para evitar potenciais morte celular.
2. Remover o tecido pulpar por forceps de extração de estéril do centro do dente com cuidado, coloque o tecido pulpar no frio meio DMEM completo em pratos de cultura de tecido de 10 cm e pique-os em pedaços pequenos (2-3 mm) por bisturi.
   Nota: Todos os procedimentos experimentais devem ser efectuados sob condições estéreis em capa de fluxo laminar. Esta técnica não enzimáticos tem sido utilizado anteriormente^21,22,23.
3. Tecidos de celulose pequeno lugar dentro da cultura de tecidos trataram placas 6 boas e adicionar 200 µ l de mídia DMEM completa para cobrir cada pedaços de tecido de celulose pequena.
4. Incube os poços de cultura de tecidos, a 37 ° C numa atmosfera de ar umidificado (80% de umidade) com 5% de CO₂ por 2 h fornecer acessório de tecido.
   Nota: Este passo pode ser prolongado para 3-4 h, controlando a evaporação da mídia.
5. Adicionar o volume apropriado (2-2,5 mL) de meio DMEM completo aos poços e incubar a 37 ° C numa atmosfera de ar umidificado com 5% de CO₂ para as células a se espalhar no tecido.
   Nota: As células se tornam visíveis após cerca de 4 dias e atingem a confluência após 8-9 dias.
6. Quando células alcançar 80% de confluência, retire mídia 6-poços chapas, lavar com 2 mL de soro de tampão fosfato (PBS) e adicionar 2 mL de tripsina. Incube durante 2 min em uma incubadora a 37 ° C, com atmosfera de ar umidificado e 5% de CO₂. Em seguida, adicione 2 mL de meio DMEM completo seguido de incubação de 2 min para inibir a tripsina. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min para células de Pelotas.
7. Células de passagem para os frascos em completa DMEM mídia e loja para novas experiências. Adicionar 15 mL de mídia DMEM completa para os frascos de T-75 e células de transferência de dois poços da placa para frascos de T-75 um 6-poços e incubar a 37 ° C, com atmosfera de ar umidificado e 5% de CO₂.

2. caracterização do DPSCs

1. Realize análises morfológicas.
   1. Células da semente (passo 1.6) na cultura do tecido revestido frascos (ou placas boas 6) em meio DMEM completo pelo menos 8 passagens observar a morfologia celular.
   2. Visualizar células por microscópio de luz e definir a morfologia de células semelhantes a fibroblastos. Células devem anexar para os pratos de cultura e morfologia da célula como eixo.
      Nota: Como alternativa, células podem ser cultivadas como células únicas por até 14 dias no poço-placas para observar a capacidade de formação de colônia que é uma característica específica de fibroblastos e MSCs.
2. Realize análises de marcador de superfície.
   1. Trypsinize as células da etapa 1.7. Retire o frasco de cultura de tecidos T-75 mídia, lavar com 2 mL de PBS e adicionar 2 mL de tripsina. Incube durante 2 min em uma incubadora a 37 ° C, com atmosfera de ar umidificado e 5% de CO₂. Em seguida, adicione 2 mL de meio DMEM completo seguido de incubação de 2 min para inibir a tripsina. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min para células de Pelotas.
   2. Consertar as células com paraformaldeído 4% por 20 min em temperatura ambiente em tubos de 1,5 mL e em seguida, lave-os com 500 µ l de PBS 3 vezes para remover paraformaldeído.
   3. Incube as células fixas com os anticorpos contra CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 e CD73 durante 1 h a 4 ° C em 100 µ l de PBS.
      Nota: A concentração de anticorpo usado é de 0,5 µ g/mL. CD34, CD14 e CD45 são utilizados como marcadores negativos, enquanto CD29, CD90, CD105, CD166 e CD73 são utilizados como marcadores de superfície celular positivo para MSCs.
   4. Lavar as células 3 vezes com PBS e usar respectivos anticorpos secundários como isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), etc. para rotulagem. Incube as células com anticorpos secundários de 1: 500 diluído em 100 µ l de PBS durante 30 min a 4 ° C e lavagem 3 vezes com PBS.
   5. Mantenha as amostras no escuro para análise de citometria de fluxo e detectar positivos e negativos de coloração por citometria de fluxo.
      Nota: Use células controle imaculado para organizar a dispersão para a frente e lateral. Organize gating de positivamente manchado populações excluindo células mortas, detritos e população não-corada. Use 100 µm bocal com pressão de bainha de 45 libras por polegada quadrada e coletar 10.000 eventos para determinar o DPSCs positivos, organizando canais.
3. Execute a diferenciação de DPSCs.
   1. Células de⁴ sementes 1 × 10 em placas de 24 poços em completar a mídia DMEM e incubam por 24 h a 37 ° C numa atmosfera de ar umidificado com 5% de CO₂.
   2. Formular a diferenciação mídia usando competir meio DMEM como base media. Prepare a mídia osteogênica misturando 100 nM dexametasona, β-glicerofosfato de 10 mM e o ácido ascórbico 0,2 mM. Prepare a mídia chondrogenic misturando 1 × insulina-transferrina-selênio (ITS-G), 100 dexametasona nM, 100 ng/mL transformadora fator de crescimento beta (TGF-β), 14 μg/mL de ácido ascórbico e 1 mg/mL albumina de soro bovino (BSA). Prepare a mídia adipogenic misturando 100 dexametasona nM, 5 insulina μg/mL, 0,5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) e 60 μM indometacina.
      Nota: Mídia de diferenciação pode ser mantida a 4 ° C pelo menos uma semana.
   3. Mudar meios de crescimento para osteo, Alexandra ou mídia de adipo-genic diferenciação e meios de atualizar duas vezes por semana durante duas semanas.
   4. Confirmar a diferenciação por von Kossa e Alcian coloração azul, atividade enzimática (atividade da fosfatase alcalina), imunocitoquímica e análises de reação em cadeia (qPCR) polimerase quantitativa de acordo com os protocolos descreveram anteriormente²¹.
      1. Executar von Kossa e Alcian blue citológicas em células que são corrigidas com paraformaldeído 4% à temperatura ambiente durante 10 min. lavam as células fixas com PBS e manchá-las com o kit de vonKossa de acordo com as recomendações do fabricante para observar os depósitos de cálcio .
      2. Prepare o Alcian azul coloração solução dissolvendo-se 1,00 g de corante de azul de Alcian em 100 mL de ácido acético a 3% (v/v) para manchar ainda mais. Lavar as células fixas com PBS e células por 30 min com solução de azul de Alcian de mancha. Visualize as amostras coradas por um microscópio de luz.

3. preparação de condição médio (CM)

1. Substitua a mídia de células da etapa 1.7 com fresco completa DMEM 24 h antes da coleta do CM.
   Nota: Recomenda-se passagem 2-4.
2. Recolha médio condição (CM) cultivadas DPSCs quando as células chegam a confluência de 80%. Centrifugue a mídia coletadas a 300 x g por 5 min remover restos de material e célula de resíduos de tecido.
   Nota: Como alternativa, use filtros de seringa 0,2 µm para remover restos de meio de condição.
3. Recolher o sobrenadante e armazenar a-20 ° C para novas experiências.
   Nota: Mantenha o sobrenadante a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.

4. tratamento de células cancerosas com CM

1. Realize análises de viabilidade celular.
   1. Semente PC-3 células (células de câncer de próstata humano) em placas de 96 poços, com uma densidade de células de 5 × 10³ células/poço em completar DMEM e incubam em uma câmara umidificada em 37 ° C e 5% CO₂ por 24 h.
   2. Trate as células com 10, 20, 30, 40 e 50% de CM (v/v) misturadas com DMEM completa por 24 h.
   3. Medir a viabilidade celular usando 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (MTS)-ensaio conforme descrito anteriormente,²⁴.
2. Execute a fim de nick do dUTP transferase terminal deoxynucleotidyl rotulagem análises (TUNEL).
   1. Semente PC-3 células em cultura de células de 6-poços chapas em uma densidade de células de 2 × 10⁵ células/poço e incubam durante uma noite em uma câmara umidificada a 37 ° C e 5% de CO₂ .
   2. Misture 20% CM (v/v) com completar meio DMEM e aplicar às células por 24 h.
   3. Trypsinize células e suspender em 50 μL de mistura de reação de TUNEL (rotulagem solução + solução enzimática, fornecido com o kit) e incubar a 37 ° C por 60 min em atmosfera umidificada e 5% CO₂ .
      Nota: Para tripsinização, remova a mídia de placas de cultura de célula 6-poços, lavar com 1 mL de PBS e adicione 500 µ l de tripsina. Incube durante 2 min em uma incubadora a 37 ° C, com atmosfera de ar umidificado e 5% de CO₂. Adicione 1 mL de meio DMEM completo seguido de incubação de 2 min para inibir a tripsina. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min para células de Pelotas.
   4. Enxaguar com PBS e analisar as células em PBS usando citometria de fluxo.
3. Realize análises de qPCR.
   1. Semente PC-3 células em cultura de células de 6-poços chapas em uma densidade de células de 2 × 10⁵ células/poço e incubam durante uma noite em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO₂ .
   2. Misture 20% CM (v/v) com completar meio DMEM e aplicar às células por 24 h.
   3. Trypsinize células e coletar centrifugado para isolamento e cDNA síntese de RNA.
      Nota: Remova a mídia de placas de cultura de célula 6-bem, lavar com 1 mL de PBS e adicione 500 µ l de tripsina. Incube a 2 min em uma incubadora a 37 ° C, com atmosfera de ar umidificado e 5% de CO₂. Adicione 1 mL de meio DMEM completo seguido de incubação de 2 min para inibir a tripsina. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min para células de Pelotas.
   4. Realize experimentos de qPCR de acordo com o protocolo descrito anteriormente,²⁵.
4. Execute a migração celular das células cancerosas.
   1. Semente de 1 × 10⁵ PC-3 células em placas de 12-poços e incubá-los numa incubadora umidificado durante a noite a 37 ° C e 5% de CO₂.
   2. Arranhar as células com uma ponta estéril 200 μL e mudar o meio imediatamente com meio fresco contendo diferentes concentrações de CM [por exemplo, 10, 20, 30, 40 e 50% de CM (v/v) misturado com DMEM completa].
   3. Observar riscos sob um microscópio invertido e tirar fotos em intervalos de tempo diferentes (0 e 24 h).
   4. Medir o encerramento do zero usando o software Image J usando a fórmula:
      
      Nota: Abra a imagem zero com o software Image J. Desenhe uma linha que tem a mesma magnitude que a barra de escala que já existe na imagem. Clique em analisar, definir escala e observar a distância, em pixels, como a ampliação da linha desenhada. Escreva o tamanho da barra de escala para a parte de distância conhecida, organizar unidade (pixels, centímetros, etc) e clique em okey. Vá para a seção de analisar novamente e clique em medições. Isto dará primeiro o tamanho da barra de escala como a unidade selecionada. Clique em uma aresta da risque e arraste até atingir a outra extremidade da risque. Observe o valor para cada ponto de tempo (0 h e 24 h). Conecte esses valores na fórmula acima e calcular o risco encerramento.

5. célula de migração por contacto indirecto de células cancerosas e DPSCs

1. Sementes de 3 × 10⁴ DPSCs para placa 24 inserções com 0,4 μm pore e incubá-los numa incubadora umidificado durante a noite a 37 ° C.
2. Células de PC-3 sementes para 24-bem placas em uma densidade de célula de 5 × 10⁴ e incubá-los numa incubadora umidificado durante a noite a 37 ° C e 5% de CO₂.
3. PC-3 células com uma ponta estéril 200 μL de coçar, mudar o meio com meio fresco e colocar inserções carregando DPSCs para PC-3 células.
4. Observar as células sob um microscópio invertido e tirar fotos em intervalos de tempo diferentes (0 e 24 h) para analisar a migração celular.

6. co-cultura ensaio e análise de citometria de fluxo

1. Rotular o PC-3 células e DPSCs usando PKH67 (verde) e PKH26 (vermelho) célula fluorescente vinculador corantes, respectivamente,²⁶.
2. Trypsinize células PC-3 e DPSCs, respectivamente. Remova a mídia do frasco de cultura de tecidos T-75, lave com 2 mL de PBS e adicionar 2 mL de tripsina. Incube durante 2 min em uma incubadora a 37 ° C, com atmosfera de ar umidificado e 5% de CO₂. Adicione 2 mL de meio DMEM completo seguido de incubação de 2 min para inibir a tripsina.
3. Centrifugar as células em 300 x g durante 5 min, descartar o sobrenadante e ressuspender pelotas de célula na solução corante preparada em tampão diluente-C fornecido pelo kit (veja a Tabela de materiais).
4. Incubar as células na solução corante por 10 min e finalizar a reação de coloração adicionando-se 100 µ l de FBS. Centrifugar as células em 300 x g durante 5 min, desprezar o sobrenadante e lavar as células com meio de cultura completo antes de cultivo co.
5. Placa rotulada células (5 × 104/bem) nas 6-poços chapas na proporção de 1:1 (DPSCs: PC3). Manter pilhas co cultivadas em DMEM completa.
6. Recolha pilhas após períodos de incubação de 24h ou 48h por centrifugação de células a 300 x g durante 5 min e lavagem com PBS.
7. Ressuspender as células em 300 µ l de fluorescência-ativado da pilha classificação Reserva (FACS) em 5 mL redondo fundo tubos de citometria de fluxo. Vórtice de dispersar os agregados de células bem antes da análise da amostra.
8. Use um bocal de 100 µm com pressão de bainha de 45 libras por polegada quadrada.
   Nota: A taxa de fluxo extremamente elevada pode diminuir a sensibilidade da deteção de fluorescência.
9. Use controle unstained células e células coloridas únicas para ajuste apropriado para a frente e tensão de laser de dispersão de lado para tipos de células e de compensação, como mencionado anteriormente,²⁷.
   Nota: Utilize o gating para células vivas para excluir os restos celulares, células mortas ou agregados.
10. Colete 10.000 eventos (100.000 é preferível) para determinar o percentuais positivos DPSCs verdes e vermelho PC-3 células, organizando FL-1 (verde) e canais de FL-2 (vermelho).

Figura 1 descreve as características gerais do Mestrado de DPSCs sob condições de cultura. DPSCs exercer a morfologia celular dos fibroblastos, como depois de chapeamento (figura 1B). Antígenos de superfície de MSC (CD29, CD73, CD90, CD105 e CD166) são altamente expressos enquanto marcadores hematopoiéticas (CD34, CD45 e CD14) são negativas (Figura 1). Alterações a nível morfológico e molecular relacionada osteo-, Alexandra- e adipo-genic diferenciação são observados na cultura de DPSCs, seguida de diferenciação pedido cocktail (Figura 1).

Para determinar a atividade de moléculas secretadas de DPSCs na migração e proliferação de células de câncer de próstata, aplicamos CM que é coletado de células-tronco cultivadas dentais e analisado a proliferação de células cancerosas e comportamento migratório. Tratamento CM (20% v/v) foi selecionado com base em análises de viabilidade celular MTS. PC-3 células tratadas com células-tronco CM foram submetidas a análises de ensaio e qPCR o TUNEL para determinar o Regulamento de morte e apoptose celular sob controle e condições experimentais. Concluiu-se que tratamento CM maior viabilidade celular e reduzida a morte celular em cultura de células de PC-3. Ex vivo ensaio migração celular (ensaio de zero) foi realizado para avaliar se a CM de DPSCs afeta a migração de células de câncer de PC-3. Tratamento com as concentrações de 10% e 20% encerramento de zero CM (v/v) aumentada significativamente em comparação com o grupo controle a 24 h (Figura 2). Da mesma forma, o tratamento CM (v/v) de 20% induzido upregulation de expressões de gene de proteínas da matriz extracelular como colágeno I, fibronectina e laminina, que desempenham um papel significativo na migração celular.

Usamos duas técnicas diferentes de cultura para estabelecer culturas co diretas e indiretas de PC-3 células e DPSCs condições ex vivo . Sistema de trans-bem foi selecionado para criar um ambiente de interação indireta para PC-3 células de câncer. PC-3 células foram semeadas na parte inferior da placa bem e inserções carregando DPSCs foram colocadas na parte superior. Porque visamos gerar uma interação direta em, membranas de trans-bem com tamanho de poro 0,4 μm foram usadas para impedir a movimentação de célula física de DPSCs da parte superior à parte inferior através da membrana. Secretado moléculas de DPSCs aumentaram risco de encerramento de PC-3 células significativamente em comparação com células de controle. PC-3 células cultivadas co com DPSCs demonstraram fechamento zero de 51%, enquanto que células controle tinham um encerramento de 38% após 24 h (Figura 3A). Direto co culturas contendo proporção 1:1 de DPSCs e PC-3 células foram usadas para analisar a auto-organização de células-tronco e células cancerosas. As células foram coradas com corantes vermelhos e verdes de membrana para distinguir diferentes tipos de células sob o microscópio. PC-3 células coradas com corante de fluorescência vermelha foram cercadas por DPSCs, em uma estrutura de tubo, após um período de incubação de 24 h. Co de culturas de células coradas com corantes fluorescentes foram analisadas por citometria de fluxo com base na coloração de fluorescência, e proporções de célula foram detectadas. DPSCs e PC-3 células criaram uma estrutura bem organizada, em que o PC-3 células proliferaram rapidamente após 48 h (Figura 3B). Embora as células foram semeadas em uma relação igual (1:1) para direct co-cultura, 62.22% de PC-3 células foram determinadas após incubação de 48 h, indicando a maior taxa de proliferação de células de PC-3.

Figura 1: caracterização de células-tronco polpa dental (DPSCs). (A) polpa tecidos obtidos a partir do centro do dente. (B) morfologia do fibroblasto como célula de DPSCs. escala bar: 100 μm. (C) análises de citometria de fluxo de DPSCs. CD29, CD73, CD90, CD105 e CD 166 são marcadores de superfície positivas, enquanto CD14, CD34, e CD45 são marcadores de superfície negativas. NC: controle negativo (meio de cultura tratada células). (D) diferenciação de DPSCs para tipos de células mesenquimais foi confirmado com von Kossa, coloração, Alcian Blue manchando e gotículas lipídicas (barra de escala: 200 μm). Osteocalcina, colágeno tipo II (Col. II) e ácido graxo proteína 4 (FABP4) immunostainings mostrou a diferenciação osteo - Alexandra- e adipogenic de barra DPSCs. escala: 200 μm. Esta figura é uma adaptação de Dogan et al 34. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: coleção de meio de condição (CM) de DPSCs para análises de viabilidade e risco de celular. Células positivas TUNEL foram diminuiu aplicativo CM (v/v) de 20%. Medida quantitativa do risco encerramento mostrou que CM maior migração celular de PC-3. CM: meio condicionado; NC: controle negativo (meio de cultura tratada células). * P < 0,05. Esta figura é uma adaptação de Dogan et al 34. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: metodologia para ensaio de migração de células trans-bem e cultura co. (A) PC-3 célula encerramento zero no sistema de trans-bem co-cultura. (B) padrão de interação de manchado DPSCs (fluorescência verde) e PC-3 células (fluorescência vermelha) após 24 h e 48 h de co-cultura (proporção de semeadura de 1:1). Maior número de celular PC-3 foi detectado no que diz respeito a barra DPSCs. escala: 200 μm. Esta figura é uma adaptação de Dogan et al 34. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.