Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo das células-tronco sobre o papel das células-tronco adultas na regulação do comportamento das células cancerosas. A principal vantagem dessa técnica é que permite a avaliação das interações de células cancerígenas e células-tronco in vitro sem o uso de organismos vivos. Essa técnica tem potencial para metástase do câncer, pois modela o papel de promoção de células-tronco adultas em metástases cancerígenas para tecidos duros, como osso.

A demonstração do procedimento será realizada por Huseyin Apdik, um pós-doutorado em meu laboratório. Comece usando fórceps de extração estéreis para remover o tecido da polpa do centro dos dentes do siso obtidos de adultos jovens de 17 a 20 anos. Coloque o tecido em DMEM completo a frio em pratos de cultura de tecido de 10 centímetros e use um bisturi para picar as amostras em fragmentos de dois a três milímetros.

Transfira as peças de cada prato para poços individuais de uma cultura tecidual tratada com placa de seis poços e cubra os tecidos em cada poço com 200 microliters de DMEM completo. Permita que os tecidos se conectem aos fundos do poço com uma incubação de pelo menos duas horas em uma incubadora de cultura celular umidificada, 37 graus Celsius e 5% de CO2. Ao final da incubação, alimente os tecidos com dois a 2,5 mililitros de meio completo fresco e cultive as células por mais oito a nove dias.

Quando a cultura atingir 80% de confluência, lave cada poço com dois mililitros de PBS seguidos pelo descolamento das células com dois mililitros de trippsina a 37 graus Celsius. Após dois minutos, pare a reação com dois mililitros de DMEM completos por poço e colete as células por centrifugação. Em seguida, resuspenque as pelotas em 15 mililitros de meio completo fresco por dois poços de células e escome as células em frascos T75 para sua cultura subsequente.

Após pelo menos oito passagens, visualize as células por microscopia leve. As células-tronco da polpa dentária deveriam ter se ligado aos pratos da cultura e devem exibir uma morfologia celular semelhante ao fuso. Para a análise do marcador de superfície, após a demonstração da trippsinização, fixe as células com 4% de paraformaldeído por 20 minutos à temperatura ambiente em tubos de 1,5 mililitros seguidos por três lavagens em 500 microliters de PBS por lavagem.

Após a última lavagem, rotule as células com os anticorpos apropriados de interesse em 100 microliters de PBS por tubo durante uma hora a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as células três vezes em PBS como demonstrado e rotule as células com os anticorpos secundários apropriados em 100 microliters de PBS por tubo por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as amostras três vezes em PBS e analise as células por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão.

Para diferenciação das células-tronco da polpa dentária, as sementes uma vez 10 para as quatro células em poços individuais de placas de 24 poços em 500 microliters de DMEM completo para uma incubação 24 horas na incubadora de cultura celular. No dia seguinte, substitua o meio em cada poço pelo meio de diferenciação adequado e devolva as células à incubadora, refrescando o meio duas vezes por semana durante duas semanas. A diferenciação pode ser confirmada pelas manchas azuis de von Kossa e Alcian de acordo com os protocolos padrão.

Após duas a quatro passagens, recolhe os supernacantes médios condicionados das células-tronco de polpa dentária cultivadas quando as culturas atingem 80% de confluência. Em seguida, centrifufique o meio coletado para remover qualquer material de tecido residuais e detritos celulares e armazene o meio a 20 graus Celsius negativo até o uso. Para o tratamento de células cancerígenas, sementes uma vez 10 a cinco células tumorais em poços individuais de uma placa de 12 poços para incubação durante a noite a 37 graus Celsius e 5%CO2.

Na manhã seguinte, use uma ponta estéril de 200 microliter para fazer uma lesão de arranhão em cada poço e substituir imediatamente o supernaente em cada poço por meio fresco contendo várias concentrações de meio condicionado. Em seguida, observe imediatamente os arranhões sob um microscópio invertido e obtenha imagens das culturas feridas em intervalos de tempo regulares. No final da análise, meça o fechamento do arranhão ao longo do tempo no ImageJ.

Para avaliar a migração de células-tronco de polpa dentária, a primeira semente três vezes 10 para as quatro células-tronco de polpa dentária em inserções individuais de placa de 24 poços com 0,4 mícrons em 250 microliters de DMEM e incubar as pastilhas durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, semente cinco vezes 10 as quatro células tumorais em poços individuais de uma placa de 24 poços em 500 microliters de DMEM para incubação durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, arranhe as células tumorais como demonstrado.

Substitua os supernacantes por 500 microliters de DMEM fresco e coloque uma célula-tronco de polpa dentária semeada em cada poço alimentado com meio fresco. Em seguida, observe imediatamente as células em um microscópio invertido e imagem das células em intervalos regulares para avaliar a migração de células-tronco de polpa dentária. Para avaliar as interações diretas das células-tronco da polpa dentária com células cancerígenas, experimentosinizar cada cultura rotulada para obter suspensões unicelulares e coletar as células dissociadas por centrifugação.

Resuspenda as pelotas em soluções distintas de corante de linker celular preparadas em tampão C diluído, fornecidas de acordo com as instruções do fabricante, e incubar as células são temperatura ambiente por 10 minutos. Termine a reação de coloração com 100 microlitres de soro bovino fetal e colete as células por centrifugação. Em seguida, centrifugar as células com meio de crescimento completo antes de emplacar cinco vezes 10 para as quatro células-tronco de polpa dentária e células tumorais por poço em uma placa de seis poços em uma proporção de um para um em dois mililitros de meio completo.

Recolher as células após 24 ou 48 horas de incubação por centrifugação seguida de uma lavagem em PBS. Em seguida, resuspenque as células em 300 microliters de tampão de triagem celular ativado pela fluorescência em tubos de citometria de fluxo de fundo redondo de cinco mililitros e vórtice para dispersar quaisquer agregados celulares antes de analisar as células de acordo com protocolos de análise citométrica de fluxo padrão. As células-tronco da polpa dentária exibem uma morfologia celular semelhante ao fibroblasto após o revestimento e expressam antígenos da superfície das células-tronco mesenquimais, mas não marcadores de células hematopoiéticas.

Alterações no nível morfológico e molecular relacionadas à diferenciação osteo, condro e adipogênica também são observadas nas culturas de células-tronco da polpa dentária seguindo a aplicação adequada do coquetel de diferenciação. O tratamento de culturas de células tumorais com 10 e 20% de concentrações de meios condicionados aumenta significativamente o fechamento do arranhão em comparação com as culturas de células tumorais de tratamento médio. Moléculas secretadas de células-tronco de polpa dentária inserem co-culturas também aumentaram o fechamento de arranhões em células tumorais feridas em comparação com co-culturas celulares de controle.

A análise do microscópio de fluorescência das interações de tronco de polpa dentária e célula tumoral dentro de uma cultura celular in vitro revela a criação de uma estrutura bem organizada dentro da qual as células tumorais se proliferam rapidamente após 48 horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter duas amostras de tecido em meio frio e transportar imediatamente amostras para o laboratório para minimizar a morte celular. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores dos campos de células-tronco na exploração de interações adultas de câncer de células-tronco em humanos.

Após esse procedimento, outros métodos como o rastreamento de células imunes para células rotuladas diferenciais de vários tipos de células-tronco e câncer podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como as células-tronco adultas interagem com células cancerígenas e controlam a metástase do câncer. Não se esqueça que trabalhar com as amostras humanas pode ser perigoso e que precauções como analisar amostras de pacientes para doenças infecciosas e obter o consentimento do paciente por escrito devem ser sempre implementadas na realização desse procedimento.