Deteção de endotoxinas em nanomateriais engenharia representa um dos grandes desafios no campo da nanomedicina. Aqui, apresentamos um estudo de caso que descreve a estrutura composta por três diferentes formatos LAL para estimar a contaminação potencial de endotoxinas em nanopartículas.
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Artigo de método
Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios
Neste artigo
Resumo
Resumo
Quando presentes em produtos farmacêuticos, uma parede de pilha bacteriana gram-negativos endotoxina de componente (muitas vezes também chamada lipopolissacarídeo) pode causar inflamação, febre, hipo - ou hipertensão arterial e, em casos extremos, pode levar a danos de tecidos e órgãos que podem tornar-se fatal. As quantidades de endotoxina em produtos farmacêuticos, portanto, são estritamente regulamentadas. Entre os métodos disponíveis para a detecção de endotoxinas e quantificação, o ensaio de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) é comumente usado em todo o mundo. Enquanto qualquer produto farmacêutico pode interferir com o ensaio LAL, nano-formulações representam um desafio particular devido à sua complexidade. O objetivo deste trabalho é fornecer um guia prático para pesquisadores inexperientes na estimativa de endotoxinas em nanomateriais engenharia e drogas nanopartículas-formulado. Neste documento, recomendações práticas para a realização de três formatos LAL, incluindo turbidez, cromogênico e gel-coágulo ensaios são discutidas. Estes ensaios podem ser usados para determinar a contaminação de endotoxinas em medicamentos baseados em nanotecnologia, vacinas e adjuvantes.
Introdução
Uma endotoxina é um bloco de construção da parede de pilha bacteriana gram-1,2. Ele pode ativar as células do sistema imunológico em muito baixas concentrações de (picograma)1,2. Os mediadores proinflammatory (citocinas, leucotrienos, eicosanoides, etc) produzidos pelas células em resposta a uma endotoxina são responsáveis pela febre, hipotensão, hipertensão e mais graves problemas de saúde, incluindo a falência múltipla de órgãos 1 , 2 , 3. a severid....
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Protocolo
1. preparação das amostras de nanopartículas
- Prepare a amostra de estudo em LAL grau água.
- Se o pH da amostra está fora do intervalo de 6-8, ajuste o pH usando apirógena hidróxido de sódio ou ácido clorídrico.
- Usando leite água grau preparar várias diluições da amostra do estudo. Certifique-se que a maior diluição que não ultrapasse a máxima diluição válida (MVD). Consulte a seção de discussão para obter detalhes sobre a estimativa de MVD.
2. preparação dos reagentes comuns entre formatos LAL
- Diluir o estoque de hidróxido de sódio concentrado usando água reagente LAL livre de pirogênio para prep....
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Resultados
O exemplo de dados gerados após o teste esta formulação em ensaios LAL é mostrado na tabela 1. Doxorrubicina lipossomal peguilado interferiu com LAL cromogênico a diluição 5. No entanto, esta interferência foi superada pelo maiores diluições. Recuperação de Spike foi entre 50 e 200% quando esta formulação foi testada em diluições 50 e 500 turbidez e LAL cromogênico, bem como a diluição 5 na turbidez LAL. Quando ajustado pelo factor de diluição, os resultados foram consist.......
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Discussão
As informações fornecidas neste protocolo tem sido descritas antes15,26 e se baseia em vários documentos normativos publicados pela Food e Drug Administration (FDA ou FDA) e farmacopeia dos Estados Unidos (USP)4 , 5 , 6 , 27e também está disponível no site NCL20 em protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.3 (gel-co.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
O estudo foi apoiado por fundos federais do Instituto Nacional de câncer, National Institutes of Health, sob contrato HHSN261200800001E. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do departamento de saúde e serviços humanos, nem faz menção de nomes comerciais, produtos comerciais, ou organizações implicam o endosso pelo governo dos EUA.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Turbidez LAL Ensaio | |||
| Hidróxido de Sódio | Sigma | S2770 | Quando necessário, é usado para ajustar o pH da amostra para estar entre 6-8 |
| Ácido clorídrico | Sigma | H9892 | Quando necessário, é usado para ajustar o pH da amostra para estar entre 6-8 |
| LAL | Reagent Associates of Cape Cod | T0051 | Este reagente pode ser usado com turbidez apenas ensaio |
| Controle de Endotoxina Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | Este reagente pode ser usado com ensaios de turbidez e gel-coágulo |
| LAL grau água | Associates of Cape Cod | WP0501 | Este reagente pode ser usado com qualquer formato LAL |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Usado para prevenir a resposta falso-positiva de beta-glucanos |
| Tubos de diluição de vidro descartáveis sem endotoxinas 12 x 75 mm | Associados de Cape Cod | TB240 | Estes tubos podem ser usados com todos os três ensaios |
| Tubos de reação de vidro descartáveis sem endotoxinas 8 x 75 mm | Associados de Cape Cod | TK100 | Estes tubos podem ser usados com ensaios de turbidez e cromogênicos |
| Pontas livres de pirogênio com volumes de 0,25 e 1,0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Pontas e pipetas podem adsorver endotoxina e liberar lixiviáveis que interferem no ensaio de LAL. Essas pontas RAININ são usadas porque seu desempenho ideal no ensaio LAL foi verificado e confirmado |
| Tubos de microcentrífuga sem pirogênio, 2,0 mL | Eppendorf | 22600044 | Outros suprimentos equivalentes podem ser usados |
| Compostos de taxa de pirogênio, | Eppendorf | de | Outros suprimentos equivalentes podem ser usados |
| Pipetador de repetição | Eppendorf | 4982000020 | Outros suprimentos equivalentes podem ser usados |
| Microcetrifuga | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Geladeira, 2-8 C | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Vortex | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Freezer, -20 C | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Pyros Kinetix ou Pyros Kinetix Flex reader | Associados de Cape Cod | PKF96 | Outros instrumentos podem ser usados. No entanto, os reagentes LAL e os padrões de endotoxina usados neste ensaio podem exigir otimização. Quando outra instrumentação for usada, consulte os fabricantes do instrumento e do kit LAL para obter instruções |
| Ensaio LAL Cromogênico | |||
| Pirocromo LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | Este reagente é específico para o Chromogenic |
| Assay Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | Este padrão é diferente daquele usado para LALs de turbidez e coágulo de gel; é otimizado para um desempenho ótimo no ensaio cromogênico |
| Hidróxido de Sódio | Sigma | S2770 | Quando necessário, é usado para ajustar o pH da amostra para estar entre 6-8 |
| Ácido clorídrico | Sigma | H9892 | Quando necessário, é usado para ajustar o pH da amostra para estar entre 6-8 |
| água de grau LAL | Associados de Cape Cod | WP0501 | Este reagente pode ser usado com qualquer tampão |
| Glucashield de formato LAL | Associados de Cape Cod | GB051-25 | Usado para prevenir a resposta falso-positiva de beta-glucanos |
| Tubos descartáveis de diluição de vidro sem endotoxinas 12 x 75 mm | Associados de Cape Cod | TB240 | Estes tubos podem ser usados com todos os três ensaios |
| Tubos de reação de vidro descartáveis sem endotoxinas 8 x 75 mm | Associados de Cape Cod | TK100 | Estes tubos podem ser usados com ensaios de turbidez e cromogênicos |
| Ponteiras livres de pirogênio com volumes de 0,25 e 1,0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Ponteiras e pipetas podem adsorver endotoxinas e liberar lixiviáveis que interferem no ensaio de LAL. Essas pontas RAININ são usadas porque seu desempenho ideal no ensaio LAL foi verificado e confirmado |
| Tubos de microcentrífuga sem pirogênio, 2,0 mL | Eppendorf | 22600044 | Outros suprimentos equivalentes podem ser usados |
| Compostos de taxa de pirogênio, | Eppendorf | de | Outros suprimentos equivalentes podem ser usados |
| Pipetador de repetição | Eppendorf | 4982000020 | Outros suprimentos equivalentes podem ser usados |
| Microcetrifuga | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Geladeira, 2-8 C | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Vortex | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Freezer, -20 C | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Pyros Kinetix ou Pyros Kinetix Flex reader | Associados de Cape Cod | PKF96 | Outros instrumentos podem ser usados. No entanto, os reagentes LAL e os padrões de endotoxina usados neste ensaio podem exigir otimização. Quando outra instrumentação for usada, consulte os fabricantes do instrumento e do kit LAL para obter instruções |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | Este reagente é específico para o ensaio de gel-coágulo |
| Controle Endotoxina Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | Este reagente pode ser usado com ensaios de turbidez e gel-coágulo |
| Hidróxido de Sódio | Sigma | S2770 | Quando necessário, é usado para ajustar o pH da amostra para estar entre 6-8 |
| Ácido clorídrico | Sigma | H9892 | Quando necessário, é usado para ajustar o pH da amostra para estar entre 6-8 |
| água de grau LAL | Associados de Cape Cod | WP0501 | Este reagente pode ser usado com qualquer formato de LAL |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Usado para evitar a resposta falso-positiva de beta-glucanos |
| Tubos de diluição de vidro descartáveis sem endotoxinas 12 x 75 mm | Associados de Cape Cod | TB240 | Estes tubos podem ser usados com todos os três ensaios |
| Tubos de reação de vidro descartáveis sem endotoxinas 10 x 75 mm | Associados de Cape Cod | TS050 | Estes tubos são para uso com o ensaio de gel-coágulo |
| Pontas livres de pirogênio com volumes de 0,25 e 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Pontas e pipetas podem adsorver endotoxinas e liberar lixiviáveis que interferem no ensaio de LAL. Essas pontas RAININ são usadas porque seu desempenho ideal no ensaio LAL foi verificado e confirmado |
| Tubos de microcentrífuga sem pirogênio, 2,0 mL | Eppendorf | 22600044 | Outros suprimentos equivalentes podem ser usados |
| Compostos de taxa de pirogênio, | Eppendorf | de | Outros suprimentos equivalentes podem ser usados |
| Pipetador de repetição | Eppendorf | 4982000020 | Outros suprimentos equivalentes podem ser usados |
| Microcetrifuga | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Geladeira, 2-8 C | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Vórtice | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Freezer, -20 C | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada | |
| Banho-maria, 37 C | qualquer marca | Qualquer marca pode ser usada, no entanto, é importante desligar a circulação de água ou usar banho-maria não circulante, pois o fluxo de água afetará a formação de coágulos e levará a resultados falso-negativos |
Referências
- Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
- Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E.
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Reimpressões e permissões
