Coleção de esperma de qualidade diferencial usando centrifugação gradiente de densidade

Summary

Neste trabalho, pretendemos descrever o desempenho da técnica de centrifugação gradiente de densidade e sua aplicação na investigação de fisiologia de esperma.

Abstract

Na reprodução sexuada, um gameta masculino ou espermatozoide funde-se com um gameta feminino para trazer sobre fertilização. No entanto, um grande número de espermatozoides com capacidade de fertilização é necessárias para interagir com um gameta feminino para garantir a fecundação. Como tal, a capacidade de fertilização dos espermatozoides individuais é fundamental para a reprodução bem sucedida. Centrifugação de gradiente de densidade tem sido utilizada por várias décadas como um método reprodutível, rápido, eficiente, eficaz e extremamente adaptável para recolher o esperma, só alta qualidade para ser usado em tecnologia de reprodução assistida. Os protocolos que descrevemos aqui centrar-se na utilização da técnica de centrifugação gradiente (PDGC) de densidade Percoll descontínua para isolar três populações distintas de esperma do galo por sua qualidade. Fomos capazes de coletar baixo, médio e alta qualidade esperma. Descrevemos também protocolos reprodutíveis que impliquem determinante potencial de fertilidade do esperma, avaliando sua viabilidade, a mobilidade e a penetração. Coleta de esperma por sua qualidade técnica PDGC seria útil com precisão e caracterizar completamente esperma com fertilidade diferencial potencial.

Introduction

Nos vertebrados, gametas masculinos passam por intensa pressão seletiva; Portanto a aptidão reprodutiva de um macho é crucial para alcançar a fecundação bem sucedida. Os machos de qualquer espécie de vertebrados determinado devem ser capazes de produzir espermatozoides em grandes quantidades e de qualidade suficiente para satisfazer as necessidades de fertilização. As células de esperma, para ter uma cabeça de esperma e um flagelo, são as células mais polarizadas no corpo. Eles também são muito heterogêneos na qualidade do esperma (ao vivo e morta, morfologicamente normal e anormal e imóvel, baixa, alta e móvel móvel), que é revelada através da ampla variação na efici....

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade da Geórgia e institucional Cuidado Animal.

1. lavar usando centrifugação tradicional

1. Prepare a solução de tampão fosfato (PBS). Adicione 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ e 0,24 g de KH₂PO₄ a 800 mL de água destilada (dH₂O). Ajustar o pH para 7,4 usando 0.1 N HCl e trazer a solução para 1 L com dH₂O.
2. Prepare o tampão de motilidade. Adicionar 6,5 g de NaCl, 4,5 g de glicose, 0,444 g de CaCl₂ e 11,5 g de N - hidroximetil - metil-2-amino-etanesul....

Results

A técnica PDGC resultou na separação distinta de três camadas de esperma pelo grau de qualidade em todos os parâmetros. Separa o esperma em uma camada de alta qualidade abaixo a solução de densidade mais elevada, uma camada de qualidade média entre o maior e solução de densidade menor e uma camada de baixa qualidade acima a solução de menor densidade. Estas diferenças de qualidade são evidenciadas diferenças claras de viabilidade (Figura 4), mobilidade (

Discussion

Fertilidade não só determina a rentabilidade da produção animal, mas também atua como um meio de seleção natural das espécies para a existência. A função final de uma célula de esperma é fertilizar um óvulo. O oviduto de uma fêmea seleciona somente as mais aptas esperma para garantir a fertilização do óvulo^23,24. Estudos in vitro também revelaram uma estreita correlação entre características qualitativas esperma e fertilização sucesso^4<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corporação Química e Científica Accudenz	Accurate, Westbury, NY, EUA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EUA	P7828
Schiff ' s reagente	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EUA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EUA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EUA	198285
Centrífuga ST 40R	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	75004524
DU 530 Life Sciences Espectrofotômetro UV/Vis	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		Não foi encontrado catálogo
Microscópio de fluorescência invertida e contraste de fase Olympus IX 71	Olympus America Inc., PA, USA		Nenhum catálogo foi encontrado