Neste trabalho, pretendemos descrever o desempenho da técnica de centrifugação gradiente de densidade e sua aplicação na investigação de fisiologia de esperma.
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Artigo de método
Coleção de esperma de qualidade diferencial usando centrifugação gradiente de densidade
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Na reprodução sexuada, um gameta masculino ou espermatozoide funde-se com um gameta feminino para trazer sobre fertilização. No entanto, um grande número de espermatozoides com capacidade de fertilização é necessárias para interagir com um gameta feminino para garantir a fecundação. Como tal, a capacidade de fertilização dos espermatozoides individuais é fundamental para a reprodução bem sucedida. Centrifugação de gradiente de densidade tem sido utilizada por várias décadas como um método reprodutível, rápido, eficiente, eficaz e extremamente adaptável para recolher o esperma, só alta qualidade para ser usado em tecnologia de reprodução assistida. Os protocolos que descrevemos aqui centrar-se na utilização da técnica de centrifugação gradiente (PDGC) de densidade Percoll descontínua para isolar três populações distintas de esperma do galo por sua qualidade. Fomos capazes de coletar baixo, médio e alta qualidade esperma. Descrevemos também protocolos reprodutíveis que impliquem determinante potencial de fertilidade do esperma, avaliando sua viabilidade, a mobilidade e a penetração. Coleta de esperma por sua qualidade técnica PDGC seria útil com precisão e caracterizar completamente esperma com fertilidade diferencial potencial.
Introdução
Nos vertebrados, gametas masculinos passam por intensa pressão seletiva; Portanto a aptidão reprodutiva de um macho é crucial para alcançar a fecundação bem sucedida. Os machos de qualquer espécie de vertebrados determinado devem ser capazes de produzir espermatozoides em grandes quantidades e de qualidade suficiente para satisfazer as necessidades de fertilização. As células de esperma, para ter uma cabeça de esperma e um flagelo, são as células mais polarizadas no corpo. Eles também são muito heterogêneos na qualidade do esperma (ao vivo e morta, morfologicamente normal e anormal e imóvel, baixa, alta e móvel móvel), que é revelada através da ampla variação na efici....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade da Geórgia e institucional Cuidado Animal.
1. lavar usando centrifugação tradicional
- Prepare a solução de tampão fosfato (PBS). Adicione 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,24 g de KH2PO4 a 800 mL de água destilada (dH2O). Ajustar o pH para 7,4 usando 0.1 N HCl e trazer a solução para 1 L com dH2O.
- Prepare o tampão de motilidade. Adicionar 6,5 g de NaCl, 4,5 g de glicose, 0,444 g de CaCl2 e 11,5 g de N - hidroximetil - metil-2-amino-etanesul....
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Resultados
A técnica PDGC resultou na separação distinta de três camadas de esperma pelo grau de qualidade em todos os parâmetros. Separa o esperma em uma camada de alta qualidade abaixo a solução de densidade mais elevada, uma camada de qualidade média entre o maior e solução de densidade menor e uma camada de baixa qualidade acima a solução de menor densidade. Estas diferenças de qualidade são evidenciadas diferenças claras de viabilidade (Figura 4), mobilidade (
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Discussão
Fertilidade não só determina a rentabilidade da produção animal, mas também atua como um meio de seleção natural das espécies para a existência. A função final de uma célula de esperma é fertilizar um óvulo. O oviduto de uma fêmea seleciona somente as mais aptas esperma para garantir a fertilização do óvulo23,24. Estudos in vitro também revelaram uma estreita correlação entre características qualitativas esperma e fertilização sucesso4<.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Corporação Química e Científica Accudenz | Accurate, Westbury, NY, EUA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EUA | P7828 | |
| Schiff ' s reagente | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EUA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EUA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EUA | 198285 | |
| Centrífuga ST 40R | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences Espectrofotômetro UV/Vis | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Não foi encontrado catálogo | |
| Microscópio de fluorescência invertida e contraste de fase Olympus IX 71 | Olympus America Inc., PA, USA | Nenhum catálogo foi encontrado |
Referências
- Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
- Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gall....
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Reimpressões e permissões
