Method Article

Experimentos de bicamada lipídica com contato bolha Bilayers para Patch-Clampers

DOI:

10.3791/58840

⸱

January 16th, 2019

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para a formação de bilayers do lipid usando um método de BICAMADA contato bolha. Uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico, segundo a qual uma monocamada é constituída na interface água-óleo. Duas pipetas são manipuladas para encaixar as bolhas para formar uma BICAMADA.

Abstract

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Bilayers do lipid fornecem uma única plataforma experimental para estudos funcionais de canais iônicos, permitindo que o exame das interações de canal-membrana sob a membrana várias composições de lipídios. Entre eles, a BICAMADA de interface da gota ganhou popularidade; no entanto, o tamanho grande membrana dificulta a gravação do ruído de fundo eléctrica baixa. Nós temos estabelecido um método de BICAMADA (CBB) contato bolha que combina os benefícios da bicamada lipídica planar e remendo-braçadeira métodos, tais como a capacidade de variar a composição de lipídios e manipular a mecânica de BICAMADA, respectivamente. Usando a configuração para experimentos de remendo-braçadeira convencional, CBB-baseado podem ser prontamente realizados experimentos. Em breve, uma solução de eletrólito em uma pipeta de vidro é fundida em uma fase de solvente orgânica (hexadecano) e a pressão da pipeta é mantida para obter um tamanho de bolha estável. A bolha é espontaneamente forrada com uma monocamada de lipídios (lipídios puros ou mistos de lipídios), que é fornecida de lipossomas nas bolhas. Em seguida, as duas bolhas de monocamada-alinhado (~ 50 µm de diâmetro) na ponta da pipeta de vidro são encaixadas para formação da bicamada. Introdução do canal-reconstituído lipossomas dentro da bolha leva à incorporação de canais na BICAMADA, permitindo a gravação atual de canal único com uma relação sinal-ruído comparável de gravações de remendo-braçadeira. CBBs com uma composição assimétrica lipídios formam-se facilmente. A CBB é renovada repetidamente por estourar as bolhas anteriores e formando novos. Várias perturbações físicas e químicas (por exemplo, perfusão de membrana e a BICAMADA tensão) podem ser impostas a CBBs. aquiem, apresentamos o procedimento básico para formação da CBB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para canais de íon, a membrana celular não é simplesmente um material de apoio, mas um parceiro para gerar o fluxo de íons. Funcionalmente, a membrana é um isolador elétrico, no qual íon canais são incorporados, e todas as membranas celulares são transmitidas com um potencial de membrana de repouso. Convencionalmente, um potencial de membrana arbitrária foi imposta de um circuito externo pelo qual a corrente elétrica através dos canais foi medido. Esta avaliação quantitativa do fluxo de iões em potenciais de membrana diferentes revelou as propriedades moleculares destes canais, tais como sua permeação íon-seletivo e associada funções1,2. Plataforma para estudos funcionais de canais iônicos de membrana é a membrana celular ou membrana de bicamada lipídica. Historicamente, gravações de corrente elétricas monocanal realizaram-se primeiro no lipid bilayers3,4, e as técnicas pertinentes foram desenvolvidas para as membranas celulares, tais como o método de remendo-braçadeira (Figura 1A )5,6. Desde então, estas duas técnicas evoluíram separadamente para fins diferentes (Figura 1)7,8.

Lipídios de membrana e membranas de BICAMADA são atualmente o foco de pesquisa para os seus papéis no apoio a estrutura e função das proteínas de canal. Portanto, a pronta disponibilidade de métodos para variar a composição lipídica em bilayers está em alta demanda. Métodos de formação de bicamada lipídica como a planar lipídios BICAMADA (PLB)8,9,10,11, gotículas de água em óleo BICAMADA12e gota interface BICAMADA (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , técnicas de 19 (Figura 1) são escolhas comuns, fornecendo uma oportunidade para examinar a função canal sob diferentes composições de lipídios20. Embora o DIB é tecnicamente muito mais fácil de produzir do que a convencional PLB, o grande tamanho de DIB criou um desincentivo para remendo-clampers para aplicá-la para o estudo atuais gravações de canal único com tamanho usual de condutância (< 100 picosegundo).

Para contornar o ruído de fundo, a área de BICAMADA deve ser minimizada. Esta questão recorda as repetições da história no desenvolvimento de técnicas eletrofisiológicas para bilayers do lipid (Figura 1). Nos primeiros dias, formou-se uma BICAMADA de pequeno porte (1-30 µm de diâmetro) na ponta de uma pipeta (método de imersão a dica; Figura 1 C) 21 , 22 , 23, em vez de usar uma BICAMADA autônoma (~ 100 µm de diâmetro) em um septo hidrofóbico em uma câmara (Figura 1B). O método de imersão a ponta permitido para medições elétricas com muito de ruído de fundo inferior24. Nossas experiências com o PLB25,26, ponta-mergulho22,23,27e remendo-braçadeira28,29,30, métodos de 31 nos levaram a uma nova ideia de formar bilayers do lipid usando os princípios da bicamada de água em óleo. Referimos a isto como o contato bolha BICAMADA (CBB) método20,32. Neste método, ao invés de pendurar as gotículas de água em uma fase de óleo (Figura 1D), uma bolha de água é levada de uma pipeta de vidro (com diâmetro de ponta de cerca de 30 µm) para a fase de óleo (Figura 1E e 2), onde o bolha é mantida através da aplicação de uma pressão constante. Um forms monocamada espontaneamente na interface água-óleo na superfície da bolha. Em seguida, duas bolhas são encaixadas através da manipulação de duas pipetas de vidro, e a BICAMADA é formada como as duas monocamadas aproximam uns aos outros, com uma área de BICAMADA de equilíbrio. O tamanho da bolha é controlado pela pressão intrabolha (mantendo a pressão) e, da mesma forma, o tamanho da bicamada. Diâmetro médio de 50 µm é frequentemente usado. Embora o volume da bolha é pequeno (< 100 pL), está relacionado com o maior volume da solução de pipeta que é na faixa de microlitros, constituindo a fase de eletrólito em massa.

Há muitos benefícios de usar o método da CBB (tabela 1). Como uma técnica de formação de bicamada lipídica, membranas de várias composições de lipídios podem ser produzidas, e membranas assimétricas são mais prontamente formado32 do que são aqueles pelo convencional método dobrável33. A BICAMADA pode ser manipulada mecanicamente, ao contrário do PLB convencional que só pode ser dobrado com uma diferença de pressão hidrostática34,35. Alterando a pressão de exploração, as bolhas ou expandir ou encolhem, levando ao aumento ou diminuição da membrana de tensão32. A BICAMADA é mecanicamente destacável em monocamadas, semelhantes a congelar-fratura técnica36,37 das membranas em estudos morfológicos, mas com a CBB, uma manobra permite múltiplas desanexar e anexar ciclos32 . O pequeno volume da solução de eletrólito dentro da bolha permite fusão eficiente de lipossomas canal-reconstituído a BICAMADA, e a probabilidade de conseguir as gravações do canal é muito maior do que com a técnica convencional de PLB. O volume de pequena bolha também permite perfusão rápida (dentro de ~ 20 ms) injeção uma vez outra pipeta é inserida em qualquer das bolhas. Ao contrário do método de remendo-braçadeira, uma vez quebrado, uma membrana CBB é re-formada imediatamente e repetidamente, e pipetas podem ser usadas várias vezes ao dia. Integrando os benefícios da remendo-braçadeira e métodos PLB, a CBB fornece uma plataforma versátil para variar as condições físico-químicas da membrana, permitindo estudos sem precedentes de interações de canal-membrana.

Antes de apresentar um protocolo detalhado do processo de formação de CBB, o fundo físico-químico da formação BICAMADA é apresentado primeiro, que será útil para remendo-clampers resolver dificuldades experimentais relacionadas com a formação da membrana que são encontrados.

Experimentos CBB dar aulas de química de superfície ciência38. A CBB é semelhante a uma bolha de sabão soprada de um canudo para o ar, onde da mesma forma, uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico. Um vai notar que uma bolha de água dificilmente é inflada quando lipídios de membrana não estão incluídos na bolha de água ou solvente orgânico. Na ausência de lipídios anfifílicos, a tensão de superfície em uma interface água-óleo é elevada, e a pressão intrabolha para explodir uma bolha vai ser alta. Esta é uma realização da equação de Laplace (ΔP = 2 γ/R, onde ΔP é a pressão intrabolha, γ é a tensão de superfície, e R é o raio da bolha). Quando a concentração de lipídios na fase orgânica ou a solução eletrolítica é elevada, aumenta a densidade dos lipídios na monocamada, conforme indicado pela isoterma de adsorção de Gibbs (-dγ = Γeu dµeu, onde Γ é o excesso de superfície do composto i e µeu é o potencial químico do componente eu)39, levando a uma baixa tensão superficial e a facilidade de formação de bolhas. A CBB, a BICAMADA pode ser observada de um ângulo tangencial (Figura 2) e o ângulo de contato entre a monocamada e BICAMADA é mensurável. Este ângulo representa um equilíbrio entre a surface tensions da monocamada e BICAMADA (equação jovem: γbi = γmo cos(θ), onde γbi é a tensão de BICAMADA, γmo é a tensão de monocamadas e θ é o ângulo de contato). As alterações no ângulo contato indicam mudanças na tensão BICAMADA, dado que a tensão de monocamada é avaliada de alterações no ângulo de contato em função do potencial de membrana (equação de Young-Lippmann: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), onde Cm é a capacitância de membrana, V é o potencial de membrana e θ0 e θv são os ângulos de contacto em 0 e V mV, respectivamente)40,41 ,,42. Quando duas bolhas estão perto o suficiente, eles se aproximam um do outro espontaneamente. Isto é devido a força van der Waals, e podemos observar visualmente este processo dinâmico na formação da CBB.

Um sistema CBB é composto por fases distintas: ou seja, uma fase de óleo em massa, revestidas com uma monocamada e uma contato BICAMADA (Figura 3) de bolhas de água. Estas são uma reminiscência das várias fases observadas em um PLB, tais como um toro que contenham solventes em torno da fase de BICAMADA e uma fase orgânica fina imprensado por duas monocamadas43,44. A CBB, fase monocamada é contínua com o folheto do BICAMADA e moléculas lipídicas prontamente difundem entre a monocamada e o folheto. A fase de monocamada cobre a maior parte da superfície da bolha, constituindo a fase principal que serve como um reservatório de lipídios. Porque a cauda hidrofóbica de lipídios na monocamada se estende para fora para a fase de óleo em massa, o interior da bicamada ou o núcleo hidrofóbico abre a fase de óleo a granel. Assim, uma substância hidrofóbica injectada a fase de óleo perto da bicamada é capaz de acessar facilmente o interior da bicamada. Esta é a técnica de perfusão de membrana que tínhamos desenvolvido recentemente45, pelo qual a composição de lipídios na BICAMADA mudou rapidamente (dentro de um segundo) durante gravações atuais de canal único. Nós achamos que o teor de colesterol na BICAMADA poderia ser reversível controlado por ligar a perfusão de colesterol e desligar45. No caso em que a concentração da substância relevante na monocamada e bicapa difere, o gradiente de concentração da substância relevante é imediatamente dissolvido através da difusão, que é conhecido como o efeito de Marangoni46, 47. por outro lado, flip-flops através de monocamadas são lento48,,49,50.

Usando o método da CBB, a BICAMADA é formada sob condições físico-químicas versáteis, como um pH de eletrólito tão baixo quanto 1 51, uma concentração de sal (K+, Na+, etc.) até 3 M, um potencial de membrana tão alto quanto ±400 mV e um sistema de temperatura até 60 ° c.

Existem várias opções para a formação da CBB e a incorporação de moléculas de canal nele. Para a formação da monocamada na interface água-óleo, lipídios são adicionados em um solvente orgânico (método de lipídios-out; Figura 4 A, 4 C) ou em uma bolha como lipossomas (lipid-no método; Figura 4 B, 4 D). Notavelmente, o lipid-em método permite a formação de membranas assimétricas15,32. Moléculas de canal solúveis em solução aquosa (por exemplo, canal-formando peptídeos) são adicionadas diretamente na bolha (Figura 4A, B)52,53, Considerando que as proteínas de canal são reconstituídas em lipossomas, que são adicionados dentro da bolha (Figura 4C, D). Neste documento, a formação da CBBs pelo método lipid-para um peptide de canal (polytheonamide B (pTB); Figura 4 A) ou de uma proteína (canal de potássio KcsA, Figura 4C) é mostrada.

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Protocol

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1. prepare os lipossomas

  1. Disperse os fosfolípidos (por exemplo, 10 mg em pó) em clorofórmio em uma concentração desejada (por exemplo, 10 mg/mL).
  2. Evapore o clorofórmio.
    1. Lugar a solução de fosfolípidos em um balão de fundo redondo e o conjunto em um evaporador rotativo (ver Tabela de materiais) conectado a um cilindro de gás de2 N. Gire o frasco sob fluxo de2 N à temperatura ambiente até um filme fino fosfolipídeo aparece (depois de ~ 30 min).
    2. Coloque o frasco aberto em um dessecador que está conectado a uma bomba de vácuo. Usando a bomba de vácuo, Aspire dentro do exsicador durante várias horas para remover completamente o clorofórmio.
  3. Adicionar um volume adequado de uma solução de eletrólito no balão e suspender o fosfolípido para obter um 2 mg/mL suspensão de fosfolípidos.
  4. Proceda à sonicação a suspensão para várias dezenas de segundos usando um sonicador de banho (consulte a Tabela de materiais) para obter uma suspensão de vesículas em várias camadas (MLV).
  5. Para a preparação de proteoliposomes que contêm proteínas de canal de íon, adicionar uma solução de proteína (com as proteínas solubilizadas com detergentes adequados; volume de 2% é o máximo) para a suspensão MLV e proceda à sonicação durante vários segundos usando o sonicador de banho.

2. prepare pipetas de vidro de grande diâmetro

  1. Definir um vidro capilar para um puxador de pipeta e fabricar micropipetas com uma fina ponta afunilada através de duas etapas puxando.
  2. Definir a micropipeta em um microforge e entre em contato com a ponta da micropipeta de um filamento de platina na porção afilada, com um diâmetro de 30 a 50 µm.
  3. Aquecer o filamento brevemente (5 s) e desligá-lo imediatamente.
    Nota: Esta manipulação formas apontar um crack para o aquecimento, segundo a qual a ponta da micropipeta é cortada, deixando um grande furo com um diâmetro de 30 a 50 µm.

3. tratar a superfície da lâmina de vidro com um poço raso côncavo (siliconização para um acabamento repelente de água)

  1. Limpe a superfície do vidro slide com um poço raso com água destilada e álcool etílico.
  2. Aplica um volume adequado (por exemplo, 100 µ l) de um reagente siliconizing (Water-repellent) ao vidro de slide no buraco.
  3. Seque o reagente completamente no ar.
  4. Coloque a lâmina de vidro no palco de um microscópio invertido.

4. formam a CBB e executar medição eletrofisiológica

  1. Adicione 100 µ l de hexadecano para o poço raso de vidro siliconizado buraco slide.
    Nota: Para o método lipídios, fosfolipídios são dispersos no hexadecano (20 mg/mL) previamente.
  2. Encha a solução eletrolítica até metade do comprimento da micropipeta, utilizando uma seringa de tuberculina.
  3. Defina a micropipeta no suporte micropipeta com uma porta de pressão, permitindo que o eletrodo de fio de Ag/AgCl mergulhar a solução eletrolítica de pipeta.
  4. Conecte um dos suportes de micropipeta para o palco principal de um amplificador de remendo-braçadeira e o outro para o aterramento elétrico.
  5. Conecte um microinjector à porta do titular micropipeta de pressão.
  6. Defina a micropipeta para uma posição apropriada acima do palco de um microscópio invertido, manipulando o micromanipulador.
  7. Ajuste o deslocamento do eletrodo potencial.
    1. Coloque 1 µ l da solução eletrolítica mesmo usada para preencher a micropipeta sobre a superfície plana em torno do poço raso de vidro slide do buraco, criando uma cúpula de eletrólito.
    2. Mergulhe a ponta de ambas as micropipetas para a cúpula de eletrólito manipulando o micromanipulador.
    3. Ajuste o potencial de deslocamento do eletrodo do amplificador remendo-braçadeira.
    4. Confirmar o deslocamento correto no final dos experimentos, quebrando a CBB através da aplicação de um elevado potencial de membrana (avaria elétrica; usando o Zap do amplificador), fazendo com que as duas bolhas para ser fundidos em um (fusão da bolha).
    5. Corrigi o potencial de junção líquida54 nos casos onde as soluções de eletrólitos assimétrica são usadas, tal que o valor calculado é adicionado para o potencial para o verdadeiro potencial de membrana de membrana aplicada.
      Nota: A potencial de junção líquida é calculada usando o programa JPCalc55.
  8. Desenhe a solução lipossoma da ponta.
    Nota: Quando canais Water-soluble são examinadas usando o método lipid-out, a aspiração da solução lipossoma não é necessária.
    1. Coloque 1 µ l da solução de lipossoma sobre a superfície plana em torno do poço raso do vidro slide buraco (lipossomas contendo cúpula).
    2. Manipular o micromanipulador e insira a ponta da micropipeta a cúpula de lipossomas contendo.
    3. Aspire a solução contendo lipossomas, reduzindo a pressão no interior do titular micropipeta usando o microinjector.
    4. Repita o procedimento para a outra pipeta.
  9. Manipular o micromanipulador e mergulhe a ponta da micropipeta ao hexadecano no poço raso.
  10. Explodir uma bolha de água lentamente, aumentando a pressão até que a bolha atinja o tamanho desejado (por exemplo, 50 µm de diâmetro) e manter a mesma pressão posteriormente.
  11. Elimine as bolhas passando a ponta através da interface óleo-ar, se é difícil manter o tamanho das bolhas estáveis.
  12. Repita as etapas de 4,8 para 4,9 até formam-se bolhas estáveis.
  13. Manipule as bolhas para permitir o contato entre eles (Figura 5).
    Nota: Às vezes, as bolhas abordagem outro espontaneamente para formar a CBB. Em outros casos, as bolhas estão perto, mas não entre em contato com os outros. Neste caso, empurre as bolhas outro mecanicamente.
  14. Ajuste a pressão para manter o tamanho da bolha, pois o tamanho pode ser alterado gradualmente até à pressão constante intrabolha.
  15. A membrana potencial para o valor apropriado usando o amplificador de remendo-braçadeira e esperamos para o canal atual a emergir (Figura 6).

5. medir capacitância bicapa

  1. Medir a capacitância elétrica BICAMADA (Cel) aplicando uma rampa de potencial.
    Nota: Quando a taxa da mudança da tensão do comando de rampa é ms 10 mV/10 (ou 1 V/s) seguido de ms de mV/10-10, a amplitude do salto atual sobre as mudanças na inclinação corresponde a leitura do valor (por exemplo, membrane'scapacitance 100 pA → 100 pF).
  2. Avaliar a área de BICAMADA de duas bolhas empilhados um sobre o outro e focar o microscópio a nível da bicamada para exibir a borda da bicamada (Figura 6).
    Nota: A forma de BICAMADA principalmente é circular, e a área é calculada a partir do raio.
  3. Calcular a capacitância de membrana específicos (Csp) dividindo a capacitância elétrica pela área de BICAMADA (Csp = Cel/A).
  4. Calcular a espessura de BICAMADA (espessura do núcleo hidrofóbico) usando Dc = (εrε0) /Csp (onde εr e ε0 representam a permissividade da região hidrofóbica da bicamada e a permissividade de um vácuo, respectivamente).

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Results

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Um típico CBB tinha um diâmetro de 50 µm (Figura 56), sendo a capacitância de membrana específicas em hexadecano 0.65 µF/cm2. O tamanho da bolha arbitrariamente era controlado pela pressão intrabolha. Quando pequenas bolhas são necessárias para as gravações de baixo ruído, o diâmetro da ponta deve ser correspondentemente pequeno. Por exemplo, para um tamanho de bolha de 50 µm de diâmetro, o diâmetro da ponta deve ser de 30 µm.

...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método CBB de formação de bicamada lipídica é baseado no princípio de uma gota de água em óleo, revestida por uma monocamada de20. Tecnicamente, os procedimentos para a formação de CBBs são fáceis, especialmente para os pesquisadores da remendo-braçadeira, que são proficientes em manipular Micropipetas de vidro. A configuração eletrofisiológica para a braçadeira do remendo prontamente é usada na CBB quando dois manipuladores de pipeta com microinjectors estão disponíveis. Por outro lado, porque ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostaria de agradecer Mariko Yamatake e Masako Takashima para assistência técnica. Este trabalho foi financiado em parte por KAKENHI concessão números 16H 00759 e 17 H 04017 (SO).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Azolectina (L-&alfa;-Fosfatidilcolina, Tipo IV-S)Sigma-AldrichP3644
Conversor A/DMolecular DivicesDigidata1550A
Eletrodo Ag/AgClWarner Instruments64-1317
Bath SonicatorBransonM1800H-J
CâmeraHamamatsu PhotonicsC11440-10C
Aparelho de Harvard Capilar de Vidro30-0062
HepesDojindo342-01375
Furo SlideglassMatsunami VidroS339929
Microscópio InvertidoOlympusIX73
Mesa de IsolamentoHerzTDI-86LA(Y)2
Micro InjenctorNarishigeIM-11-2
Micro ManipuladorNarishigeEMM
MicroforgeNarishigeMF-830
micropipeta
n-HexadecanoNacalai07819-32
Amplificador Patch-ClampHEKAEPC800
Extrator de pipetasSutter Instrument Co.P-87
POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina)Avanti Polar Lipids850457
POPE (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
)		Avanti Polar Lipids850757
POPG (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol))Avanti Polar Lipids840457
Cloreto de PotássioNacalai28514-75
Evapolador RotativoIwakiREN-1000
Ácido SuccínicoNacalai32402-05
Bomba de VácuoBuchiV-100
Suporte de

References

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