Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

Summary

Este artigo ilustra um poderoso método para quantificar as mitocôndrias ou lisossomos em células vivas. A combinação de corantes lisossomo mitocôndria-específico ou com conjugado fluorescente anticorpos marcadores de superfície permite a quantificação dessas organelas em populações de células mistas, como as células primárias de amostras de tecido, colhidas por meio de citometria de fluxo multicolor.

Abstract

Células T utilizam diferentes programas metabólicos para combinar com suas necessidades funcionais durante a proliferação e diferenciação. As mitocôndrias são componentes celulares cruciais responsáveis pelo fornecimento de energia da célula; no entanto, as mitocôndrias em excesso também produzem espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem causar morte celular. Portanto, o número de mitocôndrias constantemente deve ser ajustado para atender às necessidades das células. Este regulamento dinâmico é alcançado em parte através da função de lisossomos que removem macromoléculas e organelas excedente/danificado. Portanto, o conteúdo mitocondrial e dos lisossomos celular é indicadores-chave para avaliar a adaptação metabólica das células. Com o desenvolvimento de sondas para organelas, bem caracterizada lisossoma ou corantes específicos de mitocôndrias tornaram-se disponíveis em vários formatos para rotular as mitocôndrias e lisossomos celulares. Citometria de fluxo multicolor é uma ferramenta comum de fenótipos de célula de perfil e tem a capacidade de ser integrado com outros ensaios. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado de como combinar os corantes específicos organela com marcadores de superfície coloração para medir a quantidade de lisossomos e mitocôndrias em populações diferentes de células T em um citômetro de fluxo.

Introduction

A ativação e proliferação de células T são passos críticos para a montagem de sucesso respostas imunes. Avanços recentes sugerem que o metabolismo celular é fortemente associado com o desenvolvimento e as funções das células T. Por exemplo, ingênuo T células dependem em grande parte a fosforilação oxidativa (OXPHOS) para atender a demanda de energia durante a recirculação entre os órgãos linfoides secundários. Após a ativação, ingênuo T células passam por drásticas reprogramação metabólica, incluindo a indução da glicólise aeróbica para aumentar a produção de ATP e para atender as demandas metabólicas tremenda durante a proliferação e diferenciação celular. As células....

Protocol

O procedimento de colheita de tecidos rato descrito aqui foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade Nacional de Yang-Ming e institucional Cuidado Animal.

1. preparação da suspensão de linfócitos de órgãos linfoides

1. Eutanásia o mouse por um método aprovado como inalação de CO₂ em uma câmara de acrílico transparente, seguida por deslocamento cervical para garantir a morte.
   Nota: Manter a taxa de fluxo de CO₂ para um deslocamento de 20% por minuto da câmara e não superior a 5 libras por polegada quadrada (libra por polegada quadrada). Demora 2-3 min para um mouse para perder a consciência. Manter....

Results

Identificação dos principais células T subconjuntos no baço e Timo

Em breve, suspensões de célula única do baço e Timo foram lysed das células vermelhas do sangue, incubadas com sobrenadante 2.4G2, seguidas por organela específica tintura e marcador de superfície a coloração com anticorpos conjugados de fluorescência (tabela 1). A progressão do desenvolvimento de timócitos pode ser descrita usan.......

Discussion

Este protocolo combina corantes específicos organela e marcador de superfície coloração para quantificar a quantidade de mitocôndrias ou lisossomos em populações diferentes de células T. Este método foi desenvolvido para superar a limitação da cela número e homogeneidade requisitos para os métodos tradicionais, tais como a microscopia eletrônica e análise de immunoblot. É especialmente útil na análise de populações de células raras e examinando simultaneamente vários tipos de células ao mesmo tempo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinça Graefe de 10 cm (reta e serrilhada)	Dimeda
de 11 cm (reta com cabeças afiadas/afiadas)	Dimeda
de 15 mL	Thermo Fisher Scientific	339650
	TERUMO
Placa de Petri de 6 cm	&alfa;-plus
70 µ m filtro de células de nylon	SPL Lifesciences	93070
Cloreto de amônio (NH4Cl)	Clone de 102007 Sigma	A9434
Anti-mouse CD25	Biolegend		PC61
Anti-mouse CD4	Biolegend	100453	Clone: GK1.5
Anti-mouse CD44	Biolegend	103029	Clone: IM7
Anti-mouse CD62L	Biolegend	104407	Clone: MEL-14
Anti-mouse CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ	Biolegend	109233	Clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Tubo de fundo redondo de poliestireno (tubo FACS)	BD Biosciences	352052
Soro Fetal Bovino (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hidroxietil piperazinaetanossulfônico (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamina (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Aminoácidos não essenciais (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140122
Bicarbonato de potássio (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Solução de iodeto de propídio	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 meio (pó)	Gibco	31800089
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Sigma	S5761
Piruvato de sódio (100 mM)	Gibco	11360070