Determinação de subconjuntos de regulação de células T no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo

Resumo

Neste documento, apresentamos um protocolo para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço para um estudo mais aprofundado destas células usando citometria de fluxo. Além disso, este protocolo foi utilizado para determinar os subconjuntos de pilhas de T reguladoras usando citometria de fluxo.

Resumo

Nosso sistema imunológico consiste de um número e variedade de células imunes, incluindo células de células (Treg) T reguladoras. Células TREG podem ser divididas em dois subconjuntos, tímicas células derivadas de Treg (tTreg) e perifericamente induzida por células Treg (pTreg). Eles estão presentes em diferentes órgãos do nosso corpo e podem ser diferenciados por marcadores específicos, tais como o Helios e Neuropilin 1. Relatou-se que as células tTreg são funcionalmente mais supressivas do que células pTreg. Portanto, é importante determinar a proporção de células tanto tTreg e pTreg na investigação de populações de células heterogêneas. Neste documento, coletamos glândulas do timo, pancreáticos drenagem de linfonodos e baço de normoglycemic não-obesos diabéticos ratos para distinguir células de tTreg de pTreg células usando citometria de fluxo. Estamos preparados manualmente suspensões única célula por estes órgãos. Conjugados a fluorocromo superfície CD4, CD8, CD25, e anticorpos Neuropilin 1 foram usados para manchar as células. Eles foram mantidos na geladeira durante a noite. No dia seguinte, as células foram coradas com anticorpos intracelulares de Foxp3 e Helios fluorocromo conjugado. Estes marcadores foram usados para caracterizar os dois subconjuntos de células Treg. Este protocolo demonstra uma maneira simples, mas prática para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço e usá-los para análise de subsequentes fluxo cytometric.

Introdução

Pilhas de T (Treg) reguladoras são essenciais para a homeostase do sistema imune. Células TREG são definidas pela expressão de antígenos de superfície CD4 e CD25 e transcrição fator forkhead caixa P3 (Foxp3)^1,2,3. Primeiro, Sakaguchi et al mostrou que CD25 é constitutivamente expressa em células T supressor ratos⁴, que previa uma observação pioneira para a identificação de células Treg humanas. Células TREG desempenham um papel central na tolerância imunológica, exercendo uma capacidade supressora através de uma variedade de mecanismos, incluindo citól....

Protocolo

Comitê local de ética animal na Universidade de Uppsala aprovado as experiências com animais.

1. colheita de órgãos de animais

1. Sacrifica os ratos por deslocamento cervical.
2. Coloque as glândulas do Timo e baços em frascos de 20ml cintilação ou tubos de 15ml cónico preenchidos com 5 mL de Hanks´ equilibrada solução salina (HBSS). Lugar PDLNs em micro tubos de 1,5 mL preenchidos com 1 mL de RPMI 1640. Use todo Timo e baço e todos os PDLNs.
   Nota: Os órgãos devem ser mantidos no gelo durante todo o procedimento e o investigador deve tentar ser rápido ao preparar suspensões de célula única, especialmente ao....

Resultados

Para investigar a expressão da Nrp1 e Helios em células tTreg e pTreg, nós preparados única células das glândulas do timo, PDLNs e baços de camundongos NOD de normoglycemic e manchadas-los com os marcadores de células Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios e Nrp1 para fluxo cytometric análise. Os resultados foram analisados conforme o representante gating estratégias (Figura 1). Descobrimos que a proporção de células de Helios⁺ entre CD4⁺CD8^.......

Discussão

Neste estudo, nós isolado única células das glândulas do timo, PDLNs e baços de camundongos NOD e investigou a expressão de Helios e Nrp1 em CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg células usando citometria de fluxo. No presente estudo, foram utilizados camundongos NOD, que é um modelo murino de diabetes tipo 1. Em um estudo anterior, usamos as estirpes de tipo selvagem do mouse CD-1 e camundongos C57BL/6 para investigar se o Helios ou Nrp1 é um melhor marcador para distinguir células tTreg d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos			Empanados internos
HBSS	Statens veterinä rmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Conjunto de Tampão de Coloração de Fator de Transcrição	ThermoFisher	00-5523-00	Contém Concentrado de Fixação/Permeabilização, Diluente de Fixação/Permeabilização e Tampão de Permeabilização (10x)
eBioscience Citometria de Fluxo Coloração Buffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Anticorpo Monoclonal (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Anticorpo Monoclonal (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen  APC-H7 Rato anti-Rato CD8a	BD Biosciences	560182
Rato Neuropilina-1 Anticorpo conjugado com	APC R & D Systems	FAB5994A
FOXP3 Anticorpo Monoclonal (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Anticorpo Helios Anti-rato/humano Pacific Blue	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Tubo de Teste de Poliestireno de Fundo Redondo, com Tampa de Pressão de Filtro de Células	CORNING	352235	A 35 µ m malha de nylon é incorporada à tampa de pressão de posição dupla
Tubo 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro tubo 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001
Frascos de cintilação descartáveis	WHEATON
Citometria de fluxo	BD
	Technologies	Flowlogic

NOD Software de análise de citometria de fluxo Inivai