Name: Determinação de subconjuntos de regulação de células T no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a preparar suspensões de células únicas do timo, linfonodos pancreáticos e baço murinos para citometria de fluxo. Este método manual e econômico permite analisar subconjuntos de células T reguladoras em estudos de imunologia.

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O presente estudo foi apoiado financeiramente pelo Conselho de pesquisa Sueco, EXODIAB, Fundação sueca de Diabetes, fundo de Diabetes criança sueca, SEB Diabetesfonden e O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Os autores também queria obrigado Per-Ola Carlsson e Stellan Sandler para seus suportes e discussões.

Comitê local de ética animal na Universidade de Uppsala aprovado as experiências com animais.
1. colheita de órgãos de animais
<ol><li>Sacrifica os ratos por deslocamento cervical.</li>
	<li>Coloque as glândulas do Timo e baços em frascos de 20ml cintilação ou tubos de 15ml cónico preenchidos com 5 mL de Hanks´ equilibrada solução salina (HBSS). Lugar PDLNs em micro tubos de 1,5 mL preenchidos com 1 mL de RPMI 1640. Use todo Timo e baço e todos os PDLNs. Nota: Os órgãos devem ser mantidos no gelo durante todo o procedimento e o investigador deve tentar ser rápido ao preparar suspensões de célula única, especialmente ao manusear o tecido tímico, desde que as células imunes do Timo podem ser rapidamente degradadas em altas temperaturas.</li>
</ol>2. única célula isolamento do Timo e baço
<ol><li>Aperte completamente o Timo e o baço com um par de pinças para liberar as células do sistema imunológico. Descarte a restante cápsula do Timo e baço.</li>
	<li>Transferi a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar 433 x g por 5 min a 4 ° C, para formar um pellet. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Para lisar os glóbulos vermelhos, Ressuspender a suspensão de eritrócitos em 5 mL de 0,2 M NH4Cl e incubar a temperatura ambiente por 10 min. inverter os tubos de cabeça para baixo suavemente cada 2 min. Adicione 5 mL de HBSS, no final da incubação, para parar a Lise.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em cerca de 5 mL de HBSS. Encha os tubos com HBSS.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em cerca de 5 mL de HBSS. Encha os tubos com HBSS.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 5 mL de HBSS por Timo e 10 mL para o baço.</li>
	<li>Transferência de 1 mL de suspensão de células do Timo e 500 µ l de suspensão de célula esplênica para 5 mL redonda tubos com tampas de filtro da célula. Aplica a suspensão de células para as tampas de filtro de célula. Nota: Uma malha de nylon de 35 µm é incorporada a tampa. Cerca de 5 milhões de células foram coletadas em cada tubo.</li>
</ol>3. única célula isolamento de PDLN
<ol><li>Coloque uma malha de metal estéril 250 µm sobre um tubo cônico de 15 mL em um rack. Enxágue a malha com 1 mL de RPMI.</li>
	<li>Transferir os gânglios linfáticos para o engranzamento do metal e triturá-los através da malha usando um par de pinças. Aplique 1 mL de RPMI o engranzamento do metal para lavar as células dentro do tubo. Repetir 3 vezes mais e remover a malha.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em cerca de 5 mL de RPMI. Encha os tubos com RPMI.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em cerca de 5 mL de RPMI. Encha os tubos com RPMI.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 2 mL de RPMI. Transferência de 2 mL de suspensão de células para 5 mL redonda tubos com tampas de filtro da célula. Aplica a suspensão de células para as tampas de filtro de célula.</li>
</ol>4. fluxo Cytometry
<ol><li>Centrifugar as suspensões de células do timo, PDLN e baço a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Manchar as células com as seguintes anticorpos superfície em 100 µ l de buffer (buffer de FACS) a coloração de citometria de fluxo: 0,75 anticorpo µ g/100 µ l CD4 FITC-conjugados, 0,60 anticorpo CD8 APC-H7-conjugados de µ g/100 µ l, 0,30 µ g/100 µ l CD25 PE-conjugado anticorpo, 5 µ l (01:20) APC-conjugado anticorpo Nrp1. Incube os tubos no gelo por 40 min.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de tampão de FACS a cada tubo. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Repita mais uma vez.</li>
	<li>Corrigir e permeabilize as células por resuspending o centrifugado em 500 µ l de tampão de fixação de permeabilização (PFB). Nota: PFB é preparada pela mistura de 1 parte de fixação/permeabilizacao se concentrar com 3 peças de fixação/permeabilização diluente.</li>
	<li>Manter os tubos na geladeira a 4 ° C durante a noite. Nota: Uma incubação de 1 h também funciona.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 500 µ l de tampão de lavagem permeabilização (PWB). Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Nota: PWB é preparado pela diluição permeabilização Buffer (10x) a 01:10 em água destilada.</li>
	<li>Manchar as células com as seguintes anticorpos intracelulares em 100 µ l do PWB: 0,30 anticorpo µ g/100 µ l Foxp3 PE-Cy7-conjugado, anticorpo conjugado PacificBlue Helios de 4 µ l (01:25). Incube os tubos no gelo por 1h.</li>
	<li>Adicione 500 µ l do PWB para cada tubo. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 500 µ l do PWB. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 300 µ l de tampão de FACS.</li>
	<li>Analise as células em um citômetro de fluxo.</li>
	<li>As células única baseadas na dispersão-área lateral, altura e largura e Forward Scatter-área, altura e largura da porta. Execute 1 milhão eventos para análise.</li>
	<li>Exportar os arquivos FCS de experiências e analisá-los usando um software de analisador de citometria de fluxo.</li>
</ol>

<ol><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+regulatory+T+cells+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Helios%2C+an+Ikaros+transcription+factor+family+member%2C+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li>
<li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells%2C+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li>
<li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767(2015).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633(2015).</li>
<li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste estudo, nós isolado única células das glândulas do timo, PDLNs e baços de camundongos NOD e investigou a expressão de Helios e Nrp1 em CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células usando citometria de fluxo. No presente estudo, foram utilizados camundongos NOD, que é um modelo murino de diabetes tipo 1. Em um estudo anterior, usamos as estirpes de tipo selvagem do mouse CD-1 e camundongos C57BL/6 para investigar se o Helios ou Nrp1 é um melhor marcador para distinguir células tTreg d...

Pilhas de T (Treg) reguladoras são essenciais para a homeostase do sistema imune. Células TREG são definidas pela expressão de antígenos de superfície CD4 e CD25 e transcrição fator forkhead caixa P3 (Foxp3)1,2,3. Primeiro, Sakaguchi et al mostrou que CD25 é constitutivamente expressa em células T supressor ratos4, que previa uma observação pioneira para a identificação de células Treg humanas. Células TREG desempenham um papel central na tolerância imunológica, exercendo uma capacidade supressora através de uma variedade de mecanismos, incluindo citólise através da secreção de granzymes para induzir apoptose, consumo de citocinas e inibição através da expressão de citotóxicos Linfócitos T antígeno 45. Além disso, eles podem secretam citocinas inibidoras como transformar o fator de crescimento beta (TGF-β), interleucina-10 (IL-10) e IL-355. Células TREG naturalmente podem ser derivadas de timo, caso em que eles são designados do Timo células derivadas de Treg (tTreg), ou eles podem ser induzidos nos órgãos periféricos, nesse caso são chamados perifericamente induzida por células Treg (pTreg).
Helios, um membro da família de factor de transcrição Ikaros, foi relatado para ser um marcador para distinguir entre as células tTreg células e e pTreg6. Mais tarde, dois outros grupos relataram que Neuropilin 1 (Nrp1), um receptor III semaphorin, poderia servir como um marcador de superfície para tTreg células sob determinadas condições de7,8. Não obstante, Singh et al demonstraram que o Helios é um marcador melhor neste contexto em ingênuo ratos9.
Os subconjuntos de células Treg desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase do sistema imune e na proteção contra a infecção e autoimunidade. Portanto, é importante determinar os números e proporções dessas populações nos tecidos linfoides e não linfoides. Para conseguir isso, é preciso preparar suspensões única célula por estes órgãos. Um número de protocolos foram descrito ou utilizado em estudos anteriores. Principalmente, dissociators automáticos têm sido utilizados em relatórios publicados anteriormente10,11. Usar o dissociators automáticos é conveniente e economia de tempo, mas é um procedimento caro. Portanto, usamos um método manual para preparar suspensões única célula de murino glândulas do timo, linfonodos pancreáticos (PDLNs) drenagem e baços de normoglycemic não-obesos diabéticos (ASSENTIMENTO) mouses e células únicas isoladas por estes órgãos. Este método tem sido utilizado em nossos estudos anteriores e descobrimos que o método manual para preparar a suspensão de célula única é tão eficiente quanto dissociador automático método9,12,13,14. Além disso, usamos a citometria de fluxo para determinar as proporções de CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células e subconjuntos de Treg células tTreg e pTreg. As células tTreg e pTreg foram distinguidas usando o Helios e Nrp1 como marcadores de células tTreg. Assim, nossos resultados indicam que o método manual para preparar as células única funciona eficientemente e as suspensões preparadas única célula podem ser ainda mais usadas para estudos utilizando citometria de fluxo.

<table><tbody><tr><td>Camundongos</td><td></td><td></td> NOD <td>Empanados internos</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Statens veterin&auml; rmedicinska anstalt</td><td>991750</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD Millipore</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Conjunto de Tampão de Coloração de Fator de Transcrição</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td>Contém Concentrado de Fixação/Permeabilização, Diluente de Fixação/Permeabilização e Tampão de Permeabilização (10x)</td></tr><tr><td>eBioscience Citometria de Fluxo Coloração Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Anticorpo Monoclonal (RM4-5), FITC, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Anticorpo Monoclonal (PC61.5), PE, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0251-83</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen&nbsp; APC-H7 Rato anti-Rato CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>560182</td><td></td></tr><tr><td>Rato Neuropilina-1 Anticorpo conjugado com</td><td>APC R & D Systems</td><td>FAB5994A</td><td></td></tr><tr><td>FOXP3 Anticorpo Monoclonal (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>25-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Helios Anti-rato/humano Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>137220</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Tubo de Teste de Poliestireno de Fundo Redondo, com Tampa de Pressão de Filtro de Células</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td>A 35 &micro; m malha de nylon é incorporada à tampa de pressão de posição dupla</td></tr><tr><td>Tubo 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubo 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cintilação descartáveis</td><td>WHEATON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citometria de fluxo</td><td>BD</td> Software de análise de citometria de fluxo Inivai <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Technologies</td><td>Flowlogic</td><td></td></tr></tbody></table>

determinação de subconjuntos de regulação de células t no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Nosso sistema imunológico consiste de um número e variedade de células imunes, incluindo células de células (Treg) T reguladoras. Células TREG podem ser divididas em dois subconjuntos, tímicas células derivadas de Treg (tTreg) e perifericamente induzida por células Treg (pTreg). Eles estão presentes em diferentes órgãos do nosso corpo e podem ser diferenciados por marcadores específicos, tais como o Helios e Neuropilin 1. Relatou-se que as células tTreg são funcionalmente mais supressivas do que células pTreg. Portanto, é importante determinar a proporção de células tanto tTreg e pTreg na investigação de populações de células heterogêneas. Neste documento, coletamos glândulas do timo, pancreáticos drenagem de linfonodos e baço de normoglycemic não-obesos diabéticos ratos para distinguir células de tTreg de pTreg células usando citometria de fluxo. Estamos preparados manualmente suspensões única célula por estes órgãos. Conjugados a fluorocromo superfície CD4, CD8, CD25, e anticorpos Neuropilin 1 foram usados para manchar as células. Eles foram mantidos na geladeira durante a noite. No dia seguinte, as células foram coradas com anticorpos intracelulares de Foxp3 e Helios fluorocromo conjugado. Estes marcadores foram usados para caracterizar os dois subconjuntos de células Treg. Este protocolo demonstra uma maneira simples, mas prática para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço e usá-los para análise de subsequentes fluxo cytometric.

Para investigar a expressão da Nrp1 e Helios em células tTreg e pTreg, nós preparados única células das glândulas do timo, PDLNs e baços de camundongos NOD de normoglycemic e manchadas-los com os marcadores de células Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios e Nrp1 para fluxo cytometric análise. Os resultados foram analisados conforme o representante gating estratégias (Figura 1). Descobrimos que a proporção de células de Helios+ entre CD4+CD8...

Neste documento, apresentamos um protocolo para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço para um estudo mais aprofundado destas células usando citometria de fluxo. Além disso, este protocolo foi utilizado para determinar os subconjuntos de pilhas de T reguladoras usando citometria de fluxo.

Determinação de subconjuntos de regulação de células T no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Este protocolo ajuda na investigação do papel das células imunes em determinados órgãos em saúde e patologia. A principal vantagem dessa técnica é que esta é uma técnica econômica, já que é uma técnica manual. Demonstrando o procedimento será Zhengkang Luo, um estudante de doutorado do meu laboratório.Para começar, coloque as glândulas tímicas e baços de camundongos previamente eutanizados em frascos de cintilação de 20 ml, ou tubos cônicos de 15 ml, preenchidos com 5 ml da solução de sal balanceada de Hank. Coloque os linfonodos de drenagem pancreática em micro-tubos de 1,5 ml preenchidos com 1 ml de RPMI-1640. Certifique-se de usar todo o timo e baço, e todas as PDLNs.Mantenha os órgãos no gelo durante todo o procedimento. Usando uma tesoura, esprema bem o timo e o baço para liberar as células imunes. Descarte as cápsulas timmáticas e esplênicas restantes.Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 ml. Centrifugar a 433 vezes g e a 4 graus celsius por cinco minutos, e descartar o supernante. Para lise os glóbulos vermelhos, suspenda a suspensão celular em 5 ml de cloreto de amônio molar de 0,2 molar e incubar à temperatura ambiente por dez minutos.Inverta os tubos suavemente a cada dois minutos. No final da incubação, adicione 5 ml de HBSS para parar a lise. Centrifugar os tubos a 433 vezes g e a 4 graus celsius por cinco minutos.Descarte o supernasce e suspenda as células em aproximadamente 5 ml de HBSS. Em seguida, encha os tubos com HBSS. Repita este processo, desde centrifugar as amostras até encher o tubo com HBSS, uma vez.Centrifugar os tubos mais uma vez a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e suspenda a pelota no HBSS. Obtenha tubos de fundo redondo de 5 ml com tampas de coador de células.Transfira 1 ml da suspensão da célula timiço e 500 microlitres da suspensão da célula esplênica para os tubos, aplicando a suspensão às tampas do coador celular. Primeiro, coloque um tubo cônico de 15 ml em um rack. Coloque uma malha metálica estéril de 250 micrômetros sobre o tubo.Enxágüe a malha com 1 ml de RPMI. Em seguida, transfira os linfonodos para a malha metálica e use um par de pinças para moê-los através da malha. Aplique 1 ml de RPMI na malha para lavar as células no tubo.Repita este processo de transferência e moagem dos linfonodos três vezes para cada amostra e, em seguida, remova a malha. Centrifugar os tubos a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos. Descarte o supernasce e suspenda as células em aproximadamente 5 ml de RPMI.Em seguida, encha os tubos com RPMI. Repita este processo, desde centrifugar as amostras até encher o tubo com RPMI, uma vez. Centrifugar os tubos novamente a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos.Descarte o supernatante e suspenda a pelota de célula em 2 ml de RPMI. Transfira 2 ml da suspensão celular para tubos de fundo redondo de 5 ml com tampas de coador de células. Primeiro, centrifugar a suspensão celular das amostras de timo, baço e PDLN a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos.Descarte o supernaspeso. Manche as células com anticorpos superficiais conforme descrito no protocolo de texto e incubar os tubos no gelo por 40 minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de tampão FACS a cada tubo.Centrifugar a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos, e descartar o supernaspe. Repita este processo, adicionando o buffer, centrifugando e descartando o supernatante, uma vez. Suspenda a pelota celular em 500 microliters de tampão de fixação de permeabilização para corrigir e permeabiliar as células.Transfira os tubos para uma geladeira a 4 graus celsius durante a noite. No dia seguinte, centrifugar os tubos a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos. Descarte o supernasciente e suspenda a pelota celular em 500 microliters de tampão de lavagem de permeabilização.Centrifugar as células novamente a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos e descartar o supernasce. Colora as células com anticorpos intracelulares, conforme descrito no protocolo de texto. Incubar os tubos no gelo por 1 hora.Depois disso, adicione 500 microliters de permeabilização de tampão de lavagem a cada tubo. Centrifugar a 433 vezes g e a 4 graus celsius por cinco minutos. Descarte o supernasciente e suspenda a pelota em 500 microliters de tampão de lavagem de permeabilização.Centrifugar mais uma vez a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e suspenda a pelota da célula em 300 microliters de tampão FACS. Em seguida, analise as células em um citômetro de fluxo, conforme descrito no protocolo de texto.Neste estudo, as células únicas são isoladas de glândulas tímicas, PDLNs e baços de camundongos NOD glicícêmicos normais, e são manchadas com marcadores celulares Treg, CD4, CD25, Foxp3, Helios e neuropilina-1 para análise citométrica de fluxo. Os resultados são analisados e aqui são mostrados como estratégias representativas de gating. A proporção de células Helios-positivas entre as células Treg CD4-positivas, CD8-negativas, CD25-positivas, Foxp3-positivas é vista como maior do que a das células Nrp1-positivas nos três órgãos.Mais de 80% das células Treg no timo são vistas para expressar Hélio, que é maior do que no PDLN, e o baço. A proporção de células NrP1 positivas entre as células Treg helios-positivas é vista como maior no PDLN do que aquelas no timo ou baço. A maioria das células Treg nrp1-positivas também expressa Hélio, e a proporção de células helios-positivas entre as células Treg nrp1 positivas é vista como mais alta no timo e baço do que no PDLN.Juntos, esses resultados indicam que Helios é um marcador melhor para detectar células Treg do que nrp1. Linfonodos são pequenos, mas alguns marcadores intracelulares requerem um grande número de células para dar um bom sinal na citometria de fluxo. Outros métodos não podem ser realizados após este procedimento porque as células já estão manchadas e mortas.Mas os quatro marcadores celulares do animal podem ser substituídos para estudar outros tipos de células imunes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este é um método rápido e abrangente de imunofenotipagem mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) e enriquecendo...

Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS)

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Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para isolamento de células individuais de linfonodos pancreáticos murinos de drenagem (PDLNs) e a caracterização de células T reguladoras (Tregs) da população de células únicas usando citometria de fluxo. As Tregs são identificadas com base na expressão positiva dos marcadores de superfície celular CD4, CD25 e Nrp1, juntamente com os fatores de transcrição nuclear Foxp3 e Helios.

Identificação de subconjuntos de células T reguladoras de linfonodos de drenagem pancreática murina

Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

As células T CD4+ virgens polarizam para vários subconjuntos, dependendo do ambiente no momento da ativação.  A diferenciação de células T CD4+ virgens em vários subconjuntos efetores pode ser alcançada in vitro através da adição de estímulos de receptores de células T e sinais específicos de citocinas.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Este artigo descreve espectral citometria, uma nova abordagem em citometria de fluxo que usa as formas de espectros de emissão de distinguir fluorocromos. Um algoritmo substitui compensações e pode tratar auto-fluorescência como um parâmetro independente. Esta nova abordagem permite a análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos.

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Este artigo ilustra um poderoso método para quantificar as mitocôndrias ou lisossomos em células vivas. A combinação de corantes lisossomo mitocôndria-específico ou com conjugado fluorescente anticorpos marcadores de superfície permite a quantificação dessas organelas em populações de células mistas, como as células primárias de amostras de tecido, colhidas por meio de citometria de fluxo multicolor.

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

Aqui, apresentamos um protocolo de fluxo cytometric para identificar CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos no sangue periférico humano usando apenas dois fluorochromes em vez de sete. Com esta abordagem, cinco marcadores adicionais podem ser gravadas na maioria dos citômetros.

Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por dois-fluorocromo citometria de fluxo

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e reprodutível de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de monócito/macrófago e células T usando ensaios de coloração extra e intracelular dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial, utilizando um modelo cirúrgico estabelecido de osteoartrite de murina.

Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Esse protocolo fornece uma estratégia de co-cultura in vitro para investigar os efeitos das células T reguladoras na proliferação e diferenciação das células T efetoras.

In Vitro Análise Funcional de Células T Reguladoras: Foco na Proliferação e Diferenciação

Aprenda a preparar suspensões de células únicas do timo, linfonodos pancreáticos e baço murinos para citometria de fluxo. Este método manual e econômico permite analisar subconjuntos de células T reguladoras em estudos de imunologia.

Determinação de subconjuntos de regulação de células T no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal

Determinação de subconjuntos de regulação de células T no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo

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