O propósito do presente protocolo é usar uma combinação de computacional e pesquisa do banco para encontrar romance sequências que não podem ser separadas facilmente uma sequência co purificante, que pode ser apenas parcialmente conhecida.
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Artigo de método
Sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Genómica subtrativa pode ser usada em qualquer pesquisa onde o objetivo é identificar a sequência de um gene, proteína ou região geral que está incorporado em um contexto maior genoma. Genómica subtrativa permite que um pesquisador isolar uma sequência do alvo do interesse (T) sequenciamento abrangente e subtraindo elementos genéticos conhecidos (referência, R). O método pode ser usado para identificar sequências de romance como mitocôndrias, cloroplastos, vírus, ou germline restrito de cromossomos e é particularmente útil quando T não pode ser facilmente isolado de R. começando com os dados completos de genômicos (R + T), o método usa base Local alinhamento pesquisa ferramenta (explosão) contra uma sequência de referência, ou sequências, para remover as sequências conhecidas correspondentes (R), deixando para trás o alvo (T). Para subtração funcionar melhor, R deve ser um projecto relativamente completo que está faltando T. Desde sequências restantes após subtração são testados através de quantitativos Polymerase Chain Reaction (qPCR), R não precisa ser completa para o método de trabalho. Aqui temos link passos computacionais com etapas experimentais em um ciclo que pode ser iterado conforme necessário, sequencialmente, removendo várias sequências de referência e refinar a busca por T. A vantagem da genómica subtrativa é que uma sequência totalmente inédita do alvo pode ser identificada mesmo nos casos em que a purificação física é caro, difícil ou impossível. Uma desvantagem do método é encontrar uma referência adequada para subtração e obtenção de T-positivo e negativo de amostras para testes de qPCR. Descrevemos nossa implementação do método na identificação do primeiro gene cromossomo germline restrito de zebra finch. Nesse caso a filtragem computacional envolveu três referências (R), removidas sequencialmente em três ciclos: um assembly genômica incompleto, dados brutos de genômicos e transcriptomic dados.
Introdução
A finalidade desse método é identificar uma alvo romance (T) sequência genômica, ou DNA ou RNA, de um contexto genômico, ou uma referência (R) (Figura 1). O método é mais útil se o destino não pode ser separado fisicamente, ou que seria caro para fazê-lo. Somente alguns organismos perfeitamente terminar de genomas para subtração, então uma inovação chave do nosso método é a combinação de computacionais e métodos de banco em um ciclo, possibilitando que os pesquisadores isolar sequências de destino quando a referência é imperfeita, ou um projecto genoma de um organismo não-modelo. No final de um ciclo, qPCR teste é usado para determinar se....
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Protocolo
1. montar começando sequência de novo
Nota: Os dados de sequência de próxima geração (NGS) podem ser usados, enquanto um assembly pode ser produzido a partir desses dados. Dados de entrada apropriados incluem Illumina, PacBio, ou Nanopore de Oxford lê montado em um arquivo fasta. Para a concretude, esta seção descreve um assembly Illumina-baseado transcriptomic específicas para o estudo de zebra finch foram realizadas7; no entanto, esteja ciente de que as especificações variam de acordo com o projeto. Para o nosso projeto de exemplo, dados brutos foram derivados de um MiSeq e lê aproximadamente 10 milhões de p....
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Resultados
Após a explosão de execução, o arquivo de saída terá uma lista de sequências de consulta que correspondem ao banco de dados. Após a subtração de Python, um número de sequências não correspondentes será obtido e testado por qPCR. Os resultados do presente e próximos passos, são discutidos abaixo.
Resultado negativo. Há dois possíveis resultados negativos que podem ser vistos depois da explosão para a sequência de.......
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Discussão
Enquanto subtrativa genómica é poderosa, não é uma abordagem do bolinho-cortador, que exigem personalização em diversas etapas-chave e a seleção cuidadosa de sequências de referência e amostras de teste. Se o assembly de consulta é de má qualidade, etapas de filtragem pode isolar apenas artefatos de montagem. Portanto, é importante validar completamente novo de assembly usando um protocolo de validação adequada para o projeto específico. Para RNA-seq, orientações são fornecidas sobre o Trinity site
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem Michelle Biederman, Alyssa Pedersen e Colin J. Saldanha por sua ajuda com o projeto de genômica zebra finch em várias fases. Também reconhecemos Evgeny Bisk para computação de administração do sistema de cluster e NIH grant 1K22CA184297 (para J.R.B.) e NIH NS 042767 (para C.J.S).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Accustart II Taq DNA Polimerase | Quanta Bio | 95141 | |
| Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Blasic (BLAST) | https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment | ||
| Gravata borboleta 2 | https://www.python.org/download/releases/2.7/ | ||
| BWA-MEM v. 0.7.12 | https://github.com/BenLangmead/bowtie2 | ||
| Geneious | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | ||
| PEAR v. 0.9.6 | http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html | ||
| Computador Pessoal | Biomatters | http://www.geneious.com/ | |
| PowerSYBR qPCR mix | ThermoFisher | 4367659 | |
| Python v. 2.7 | https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/ | ||
| Reptile v.1.1 | https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile | ||
| Stratagene Mx3005P | Agilent Technologies | 401456 | |
| TransDecoder v. 3.0.1 | https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/ | ||
| Trinity v. 2.4.0 | https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki |
Referências
- Barh, D., et al. A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens. Chemical Biology & Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).
- Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N.
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Reimpressões e permissões
