Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

Summary

O método de autoradiografia é rotineiramente usado para estudar a ligação de radioligands para cortes de tecido para determinação da farmacologia qualitativa ou quantitativa.

Abstract

Em vitro autoradiografia pretende visualizar a distribuição anatômica de uma proteína de interesse em tecido de animais experimentais, bem como os seres humanos. O método baseia-se a vinculação específica de um radioligantes ao seu alvo biológico. Portanto, seções congeladas do tecido são incubadas com radioligantes solução, e a ligação para o destino é posteriormente localizada por detecção de decaimento radioativo, por exemplo, usando filme fotossensível ou imagem de placas de fósforo. Autoradiograms Digitas resultantes exibem notável resolução espacial, que permite a quantificação e localização da ligação de radioligantes em estruturas anatômicas distintas. Além disso, quantificação permite a caracterização farmacológica de afinidade de ligante através de constantes de dissociação (K_d), constantes de inibição (K_eu), bem como a densidade dos sítios de ligação (B_máx) em tecidos selecionados. Assim, o método fornece informações sobre localização de alvo e seletividade de ligante. Aqui, a técnica é exemplificada com eosina caracterização do ácido de alta afinidade γ-hidroxibutírico (GHB) vinculação sites no tecido do cérebro de mamíferos, com ênfase especial em considerações metodológicas sobre o ensaio parâmetros, a escolha do radioligantes e o método de deteção.

Introduction

Autoradiografia é um método que fornece imagens de decaimento radioativo. A técnica é usada rotineiramente para estudar a distribuição de tecido de uma proteína de interesse em vitro com base em uma interação farmacológica específica entre um composto marcadas com radioisótopos e seu destino. Isto fornece informação directa sobre a seletividade do ligante para o alvo. Em vitro autoradiografia pode também ser utilizada para a determinação quantitativa dos parâmetros de ligação farmacológica de radioligands, tais como a constante de dissociação (K_d) e a densidade dos sítios de ligação (B_máx), bem como para a determinação a constan....

Protocol

Todo animal manipulação foi realizada em conformidade com as diretrizes da Inspetoria de Experimentação Animal dinamarquês.

Nota: O protocolo descrito aqui aborda a preparação do tecido (ou seja, tecido de cérebro de rato), em vitro ensaio eosina em detalhes suficientes para a criação do método em um novo laboratório, a exposição de imagem de placas de fósforo, bem como subsequente análise densitométricos de autoradiograms (Figura 2) com o objetivo de localizar e quantificar radioligantes vinculação em estruturas anatômicas distintas. Para comparação histológica, um protocolo para coloração de....

Results

Usando o protocolo descrito, a distribuição anatômica dos sites alta afinidade de ligação GHB foi visualizada com o análogo GHB marcadas com radioisótopos [³H] HOCPCA no cérebro de rato, que foi cortado em secções coronais, sagitais e horizontais (Figura 3 ). Observaram-se altos níveis de vinculação no hipocampo e córtex, ligação inferior no corpo estriado e não foi detectados no cerebelo, correspondente aos padrões de expressão relatada anterior d.......

Discussion

A qualidade de um ensaio de eosina mais frequentemente é determinada pela sensibilidade do radioligantes. Um grande fator que contribui é o radioisótopo selecionado, que é dado pela disponibilidade de ligantes conhecidos ou pela viabilidade de técnicas específicas de rotulagem para produzir ligantes com atividade específica apropriada (ou seja, a quantidade de radioatividade por mole de unidade de um radioligantes)²³e com quantidades limitadas de degradação química. Um grande número de ra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanol absoluto	Merck Millipore	107017
Ácido acético	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Placa de imagem	GE Healthcare Life Science	28956481	20x40 cm - Sensível ao trítio
Acetato de violeta Cresyl	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (meio de montagem não aquoso para microscopia)	Merck Millipore	100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus lâminas	VWR	631-9483	lâminas de microscópio
Tissue-Tek Conjunto de coloração manual de lâminas	Sakura Finetek Dinamarca ApS	4451
Tritium Standard em Glas	Produtos químicos radiomarcados americanos, Inc.	ART 0123
Substituto de xileno	Sigma-Aldrich	A5597